本发明涉及蛋白质的化学修饰领域，更具体地说是涉及该修饰物在治疗癌症、病毒及免疫系统等疾病中的用途。经本发明修饰后的蛋白质药物体内半衰期显著延长，药效显著提高。 癌症是世界上仅次于心血管系统疾病的第二大死亡疾病，全世界每年新发病人700万，需要治疗的新老病人超过1000万，是人类亟待攻克的顽症之一。另外病毒性疾病和免疫系统的疾病等也是人类难以驾御的，象爱滋病也正在无情地吞噬着人类。人类的免疫系统是机体防御细菌、病毒、肿瘤细胞或异体大分子结构对机体侵害的重要手段，如果机体的免疫监视功能不能正常动作，则“危险”就将乘虚而入，根据Oldham肿瘤生物学疗法的理论，正常情况下肿瘤细胞与机体防御之间处于动态平衡，肿瘤的发生乃至进行增殖与播散完全是这种动态平衡的失调所致。如果将已失调的状态人为地调正到正常水平，就可以控制肿瘤地生长并使其消退。因此主张通过从体外补充、诱导或活化体内本来固有的生物应答调节剂（Biological Response Modifier，BRM）系统的具有细胞毒活性的生物活性细胞和/或因子，以调整这种生物反应。〔Oldham R K.Cancer Treat Rep.（1984）68，221〕
在目前的肿瘤疗法中，给患者输注淋巴因子（或细胞因子）是治疗的主要手段之一。这些淋巴因子如：白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干扰素（Interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF），等等。
象其它药物那样，IL-2的治疗效果也取决于它在体内的浓度，达不到一定的血药浓度和时间就没有显著的效果。IL-2的血药半衰期非常短，只有约3-6分钟，因此要长时间保持一定血药浓度就要大剂量长时间给药。但这一方面加大了用药量产生严重的毒副作用，如毛细血管漏出而致的体液潴留和向心性水肿等〔N Engl J Med.（1988）318，1538〕;另一方面也使患者用药费用加重。因此，延长IL-2的血药半衰期，降低用药量和毒副作用，是国内外竞相研究的课题之一。本发明的主要特征之一，就是大大延长了IL-2的血药半衰期，大幅度降低了IL-2的用药量，也就大大降低了大剂量用药的毒副作用;另外，由于本发明以具有显著抗癌活性并与IL-2有协同作用的香菇多糖（Le-ntinan，LNT）衍生物修饰IL-2蛋白质，而不是以普通的无相关药用价值的“中性”分子进行修饰，因此就使修饰后的IL-2结合物具有更强的抗癌活性，这是本发明的第二大特征;第三大特征就是采用LNT中小分子衍生物，溶解性好。
IL-2是一种分子量约1.5万的蛋白质，由活化增殖的T淋巴细胞产生，可以引起细胞毒T淋巴细胞的成熟，诱生多种细胞因子，促进T细胞、B细胞、NK细胞和胸腺细胞的增殖、分化和补充，介导IFN-γ启动NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）的活力，提高机体识别和杀灭肿瘤、病毒的能力，恢复和提高机体的免疫力，是一种很好的BRM，在肿瘤的生物疗法中占居非常重要的地位。〔Blood.（1991）774∶741-749〕
天然来源的IL-2（nIL-2）非常有限〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77，6134-6138;J.Immunol.（1981）127，2361-2365〕，而用DNA重组技术则可以在微生物或动物细胞中大量生产基因重组人白细胞介素-2（Recombinant human interleukin-2，rIL-2）用于研究和治疗〔Nucleic Acid Res.（1983）11，4307-4323;Nature（1983）302，24∶305;J.Biol.（1989）264，17368-73〕。rIL-2和nIL-2在生物学和免疫学性质方面无显著差异。1992年美国专利FDA批准rIL-2投放市场，用于癌症等疾病的治疗。
本发明中IL-2包括那些各种细胞诱导生产的nIL-2，如脐血淋巴细胞、人白血病T细胞株（Jurkat T）等。
本发明中IL-2亦包括那些以重组DNA技术得到的rIL-2，其中包括各种IL-2突变蛋白或其衍生物。
用于本发明的突变蛋白质基本上是基于原始IL-2蛋白质的氨基酸（aa）顺序的变异而得到的。所说的变异包括aa的加入、结构aa的缺失以及结构aa被不同的aa取代。亦包括IL-2与其它蛋白质或多肽融合表达出的融合蛋白质。
所说的aa的加入包括至少加入一个aa。
结构aa的缺失包括至少缺失一个IL-2结构aa。
结构aa被不同的aa取代包括至少一个IL-2结构aa被至少一个不同的aa取代。
在已加入了至少一个aa的IL-2变异蛋白质中，所说的至少一个aa不包括衍生于用于多肽表达的起始密码子和信号肽的Met。
被加入的aa的数目也可以是一个，但只要不丧失IL-2的基本特性，也可以是任何数目。更可取的是这些aa包括蛋白质的某些或所有aa顺序。这些顺序与IL-2有同源性，并表现具有与IL-2的aa顺序相似的活性。
结构aa缺失的数目，只要不丧失IL-2的基本特性，可以是任何数目。
取代前结构aa的例子包括CySH和Cys，但较好是CySH。另外，取代前的结构aa还包括Asp、Arg、Gly和Val。当取代前的结构aa为CySH时，以中性aa作为取代aa较好。中性aa包括Gly、Val、Leu、Ile、Tyr、Phe、His、Trp、Ser、Thr和Met。特别常用Ser、Thr和Ala，如CySH125→Ser125，CySH125→Thr125，和CySH125→Ala125等。
当被取代的前结构aa为CySH以外的其它aa时，常选择其亲水性、疏水性和电荷不同于被代aa的aa。例如取代前的aa为Asp时，取代aa常用Asn、Thr、Val、Phe、Arg，尤其选择Asn和Arg。
用定点诱变方法产生突变蛋白的技术是已知的，如参见：R.F.La-ther and J.P.lecoq，Genetic Engineering（1983）PP31-50，Academi-c Press;M.Smith and S.Gillam，Genetic Engineering;Principlesand Methods（1981）3，PP1-32，Plenum Press。
本发明也可适用于其它淋巴因子，如IL系列（如：IL-1，IL-3，IL-4，IL-6等），IFN系列（α、β、γ），TNF（α、β），CSF系列（G、M、GM、Mutil-CSF）等。亦包括其各种保持原基本特性的突变蛋白质。
延长蛋白质药物血药半衰期的方法主要有三种：一种是采用基因工程手段对蛋白质的基因进行定点诱变、缺失、加入等，以图表达出的新蛋白质性质有所改进。此法普遍试用，但缺点是难度及盲目性都较大，而且一般收益也并不大。另一种方法是对蛋白质进行化学修饰使其带上其它分子或基因。目前常见的修饰剂主要有PEG、（聚乙二醇）Dextran（右旋糖酐）等“中性”分子，效果显著。其次就是选用多相脂质体、缓释胶囊（泵）等载体系统。
本发明采用化学修饰方法，以LNT的衍生物为修饰剂对IL-2进行修饰。
LNT是一种很好的免疫调节剂，来源于香菇（Lentinus edodes）的子实体，是一种以β-（1，3）-葡萄糖为主链，β-（1，6）-葡萄糖为枝链的葡聚糖（glucan），分子量约50万。其生理活性为：激活巨噬细胞的活性并增高IL-1、IFN-α的产生，IL-1又促进TH细胞分泌多种辅助因子，包括IL-2，使未成熟的T细胞分化成熟，增强T-T、T-B细胞的相互作用，促进免疫应答过程。LNT还能直接和/或通过提高IFN-α的水平间接激活NK细胞杀伤肿瘤，其整体抗瘤作用还突出地表现在它能刺激肿瘤特异性抗原引发的迟发型变态反应和激活补体旁路，对多种肿瘤有明显的抑制和治疗作用，而且副作用很小，没有致癌致突变作用，又可为人体消化吸收，是一种符合WHO要求的较理想的免疫增强剂。〔Canar Res.（1984）44，1368;Gann（1985）76∶37〕
IL-2与LNT联合用药具有较好的协同抗癌和提高LAK细胞活性等作用〔Canar Immunol Immunother.（1989）29，89;INt.J.Immunopharmaco-1.（1990）12，6∶613;日癌志，（1992）25，2∶405〕。此种联合用药虽然效果好于单独用药，但IL-2血药半衰期太短的缺点仍然没有改善。
本发明涉及的修饰剂并不限于LNT衍生物，而是一组包括LNT在内的具有免疫增强和或抗癌活性的多糖，其中主要包括β/α-glucan或β/α甘露聚糖（mannan）。在以β-（1，3）或β-（1，6）糖苷键为主键的glucan中，通常前者比后者具有更强的活性。前者除了已述及的LNT之外，还有猪苓多糖（grifolan，GRN）、裂褶多糖（schizophyllan，SP）、酵母多糖（zymosan）等。那些以β-（1，4）及β-（1，2）键为主键的glucan，如茯苓多糖（Pachyman）、云芝多糖（Krestin，PSK）等。有证据表明巨噬细胞膜上有β-glucan受体存在〔J.Immunol.（1985）134，2588-2593;（1989）142，959-965;（1990）144，2712-2718〕。β-glucan与受体的结合导致巨噬细胞的活化和增殖，所分泌的多种细胞因子如IL-1、IFN-α又可激活TH、NK等细胞从而放大出多种抗癌抗病毒活性。
多糖的抗癌及增强免疫力等活性依赖于分子的高级结构〔Phytochemistry（1989）28，11∶2877〕。以β-（1，3）-glucan为例其β-构型有利于形成一个螺旋型链的构象，这有利于激发抗癌活性;而α-（1，3）-glucan的α-构型却利于形成一个沿纤维轴伸展的带状构象，因此α-glucan多呈现免疫增强活性而抗癌活性较弱，如黄芪多糖、人参多糖等。从目前的认识来看，由真菌分离出的多糖通常显示抗肿瘤和免疫增强的活性;来源于高等植物的多糖多表现免疫增强活性;而从藻类分离出的多糖通常含有硫酸酯，是好的抗凝剂。
多糖的活性亦依赖于其分子大小（分子量），因为这是其形成一定高级结构（构象）的必要条件。在一定范围内分子量愈大活性愈强在达到一定限度之后这种关系就不够明显了。例如对于LNT、SP、GRN等来说，其分子量小于10Kd时，分子愈小活性愈弱，而分子量在10-40Kd水平时即可基本保持原大分子的活性，分子量再增加活性增加已经不明显了〔Gann，（1976）67，191;Cancer Res.（1978）37，379〕。另外，主链上带了枝链的多糖比没有的活性强。
多糖的衍生化是增强其活性改进性能的重要手段，其方法主要有水解、甲基化、羟乙基化、硫酸化、糖基化、硬脂酰化及磷酯酰化等。以LNT为例，水解法制备LNT中小分子衍生物可采用高温水解（如150℃）、甲酸水解、亦可采用强碱或强酸水解，或用葡萄糖苷酶水解。通过控制反应的浓度、温度及时间来获得适宜大小的反应混合物。由于分子量愈大的多糖在乙醇溶液中的溶解度愈小，因此通过控制乙醇的浓度即可将所需大小的衍生物分级分离出来，亦可以采用层析等其他方法获得。
大分子多糖虽然水溶性较小分子差，但只要采用一些促溶手段，如加热、有机溶剂及表面活性剂等亦同样可溶。
本发明涉及的多糖修饰蛋白质的方法有多种，其中较好的为高碘酸钠（NaIO4）氧化法。严格地说NaIO4并不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为“桥”连结在多糖与蛋白质之间，将糖基中的1个邻二醇结构氧化断裂成两个醛基，两分子NaIO4可将1个邻丙三醇结构氧化断裂成两个醛基，一个甲酸分子。四醋酸铅（Pb（AC）4）亦具有同NaIO4类似的氧化特性，但需要在有机溶剂中实现，而NaIO4则适用于水溶液中。氧化后的醛化多糖经分离纯化，与一定量的待修饰蛋白质混合反应，蛋白质分子中游离的-NH2与醛化多糖的醛基缩合形成西佛碱（Schiffs），再经还原剂（如NaBH4）还原即可形成稳定的共价键。
本发明实现多糖或其衍生物对蛋白质的修饰性结合亦可采用溴化氰〔J.Biochen.（1971）18，351-360〕、氯化氰尿〔J.Immunol.（1979）122，1266-1272〕，表氯醇、以及诸如碳二亚胺、琥珀酰亚胺、N-琥珀酰亚氨基-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯的双功能偶联剂或其衍生物等实现偶联。
以NaIO4氧化为例，IL-2被LNT衍生物（LNTd）修饰的程度一方面取决于LNTd的氧化程度。另一方面取决于两者的分子比。LNTd的氧化度一般以50-10%较好（根据可氧化糖基的数目计算），氧化度太高易造成过度修饰不良产物较多，IL-2活性损失过多;过低氧化则修饰物产率偏低。IL-2与LNTd反应的分子比一般取1∶1-30，通常以1∶5-20较好。结果以每分子IL-2结合1-5个LNTd分子较好。过多结合则严重影响IL-2的活性。如果LNTd分子较大应适当减少同IL-2的结合，如果LNTd分子较小可适当增加与IL-2的结合。该修饰过程一般对IL-2的活性有一定损失，通常应控制保留50%以上的IL-2活性。与IL-2血药半衰期大大延长，药效显著提高相比，这种活性损失是微不足道的。
本发明的用途不限于肿瘤的治疗，亦可用于治疗病毒性疾病、感染、自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、糖尿病等等。另外，亦可用作细胞培养及活化的试剂。
当用于体内治疗时，给病人使用治疗有效量的香菇多糖衍生物修饰的IL-2结合物（治疗有效量即是消除或减少病人病症的量）。治疗途径通常是非肠道给药，较好的是静脉内给药。剂量及疗程视病症的性质（如癌症的初期或转移性的）及其种类、特定药物的特征（例如其治疗指数），病人及病史而定。
非肠道使用的本发明修饰物辅以药学上可接受的非肠道赋形剂而配制成单位剂量的注射剂（冻干粉、溶液、悬浮液、乳剂）。这类赋形剂本身无毒无疗效，例子如水、盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖、甘露糖（醇）、右旋糖酐、人血清白蛋白。也可使用诸如不挥发油和油酸乙酯的非水性赋形剂，磷脂可用作载体。赋形剂可含有微量的诸如提高溶解度、增加等渗性和化学稳定性的添加物，例如表面活性剂、缓冲液和防腐剂等。
本发明所需的IL-2、LNT等前体药物应为高度纯化的临床级制品，其生产和制备方法是已知的。〔Biochem.J.（1987）245，85-91;Bioche-m.Biophy.Res.Commun.（1985）130，2，692-699;Nature（1969）222，687-688;Cancer Res.（1970）30，2776-2781〕
下列实施例详细叙述了本发明香菇多糖衍生物修饰的IL-2结合物的制备、分析及测定。制备中所用的水、试剂、原料及容器等应达到无热原及必要的无菌要求。这些实施例不限制本发明。
实施例1
甲酸水解法制备INTd
1g LNT溶于50ml 80%甲酸溶液中，置于85℃水浴中水解20分钟，冷却至室温，经减压蒸发除去甲酸，然后将此悬浮于50ml水中，置沸水浴中煮3小时，以除去降解物上的甲酰基团。此混合物经静置或离心收集可溶性上清组分，加入650ml乙醇，沉淀物即为分子量约20Kd的LNT衍生物（LNTd20）。沉淀物离心收集后用40ml水溶解并对水透析，分析测定后定量分装，干燥备用。
实施例2
LNTd20适度氧化
在无菌条件下，1g LNTd20溶于20ml水中，然后冷却至4℃，0.1g NaIO4溶于5ml4℃水中。将此两溶液搅拌下缓慢混合，置暗处4℃过夜。此反应混合物经由0.1M PB（PH8.5）平衡的Sephadex G-25（3×20CM）柱脱盐纯化，以每分钟1ml的流速用0.1M PB（PH8.5）洗脱，每管5ml收集组分，用“酚/硫酸”法〔Anal.Chem.（1956）28，350〕确定醛化多糖的洗脱峰位置和定量测定。收集此醛化多糖分装冻干待用或直接用于IL-2的修饰。上述氧化反应混合物亦可加入250ml冰冷的无水乙醇混匀，放置10分钟后，3000rpm×10分钟离心，弃上清液取沉淀物，用100ml冰冷的90%乙醇洗沉淀物1-2次。沉淀物离心收集，用30ml水溶解，然后定量分装冻干备用，亦可直接用于IL-2的修饰。
实施例3
IL-2的化学修饰
在无菌条件下，100mg IL-2溶于50ml 0.1M PB（PH7.0）;500mg LN-Td20溶于30ml 0.1M PB（PH7.0）中，4℃平衡后，将此两溶液于搅拌下混合反应，置暗处4℃过夜。200mg NaBH4搅拌下缓慢加入该反应混合物中，于暗处4℃放置2小时。
实施例4
结合的纯化及分析
修饰后的结合物反应液对0.1M PB（PH7.0）超滤或透析（YM-5），然后通过已由0.1M PB（PH7.0）平衡的Sephacryl S-200（或SephadexG-200）柱（5×90cm）进行凝胶过滤色谱层析，以每分钟1.5ml流速洗脱，待流出液超过Vo后开始收集组分（15ml/管）。同时用280nm紫外光检测并记录流出液的光密度（OD28nm）。必要时可事先用兰色葡聚糖（Bl-ue dextran，Mw.2×106）测定该层析柱的外水体积（Vo），亦可用LNT-d20在相同条件下层析确定LNTd20的流出时间。LNTd20-IL-2结合物应是先于LNTd20流出的具有OD28nm吸收峰的组分，该组分糖含量的变化应与蛋白浓度的变化基本一致。
有关蛋白质测定可用紫外光（280nm）吸收法，亦可用“Lowry法”〔J.Biol.Chem.（1951）193，265〕;糖（及多糖）的测定采用“酚/硫酸”法或“蒽酮”法〔Anal.Chem.（1953）25，1656-1661〕。分子量测定采用SDS-PAGE银染法〔生物化学与生物物理进展，1990，17（2），407〕IL-2及其修饰物的生物活性分析采用已知常规方法〔J.Immuno-1.（1978）120，2027〕。
纯化的LNTd20-IL-2结合物经超滤（YM-5）浓缩、定量及活性测定后，定量分装冻干备用。
该技术领域的内行将欣然认为本发明可以很好地执行上述目的，并得到结果及其利益。这里所述的化合物、方法、过程和技术是优选出的代表实例，只是例举而不是来限制本发明的范围。该技术领域人员所作出的改变及其它使用也包括于本发明的精神中并被权利要求书所定义。