利用合成交联剂 的组织粘合剂 本申请是申请日为1995年5月5日的顺序号为08/435,641的申请的部分继续申请，其公开内容以参考文献的形式并入本发明。
本发明的领域为用作组织粘合剂和密封剂的生理可接受的组合物。
在许多情况下都需要粘合分开的组织。缝合和固定是有效的且很成熟的创伤闭合方法。然而，有一些在传统的修复操作效果不满意的情况下采用的外科操作仅限于高度训练的专家(如显微外科)，或者由于组织或器官的脆性，难接近性(如内窥镜操作)，或者体液丢失(包括毛细管“渗出”)而不能适用。已发展的组织粘合剂或者密封剂满足了这些需要。它们用于密封或加固已经缝合或钉住的伤口，以及探索独立地用途。主要的商品化产品是纤维蛋白粘合剂和腈基丙烯酸酯。然而，两产品均有明显的局限性从而限制了其广泛应用。
腈基丙烯酸酯主要用于面部和整形外科中皮肤伤口的闭合。腈基丙烯酸酯的优势是其几乎是立即起效的粘合速度以及强大的粘合强度。但是，由于粘合的组织必需重新切开以便整成所需的形状，所以其粘合速度可能是缺点。此外，由于其起效方式是通过机械联锁，所以其只能用于干燥的基质，从而限制其用作密封剂，而且其相对于周围组织较僵硬。已知腈基丙烯酸酯对某些组织有毒性并且虽然无需考虑其生物降解性，而可能的降解产物也被怀疑有致癌性。
含有源于血液的血纤蛋白原，XIII因子和凝血酶的血纤蛋白粘合剂最先用作密封剂和止血剂并且已应用于体内的许多不同的外科手术中。它们已显示出是无毒，生物相容性和生物可降解性的。它们能抑制过量出血并降低纤维变性。然而，用血纤蛋白粘合的组织甚至经受温和的伸拉力就会破坏粘合。需要三到十分钟进行最初的粘合，但要求有30分钟到几个小时以充分地发展强度。基于应用，该产品也可能重吸收得太快。已证明应用重组生产的血纤蛋白原，XIII因子，凝血酶及相关组分(如纤维蛋白，活化的XIII因子)不能改进纤维蛋白粘合剂的起效时间或者强度。来源于异源的人和动物血清的血纤蛋白粘合剂可能激发免疫副反应，并且使病人有受病毒感染的危险。要获得并应用可以兼顾病人安全性的自身固有的纤维蛋白粘合剂不太现实。
因此，有相当的必要发展具有血纤蛋白的生物适应性但更快起效且强度增强的产品。该产品应该易于获得，比天然来源的更合乎需要，易于给药且在规定时间外能重吸收。
组织粘合剂见于：外科中的组织粘合剂，Matsumoto，T.，医学检验出版公司，1972和Sierra，D.H.，应用生物材料杂志，7：309-352，1993带有重复单元的嵌段的蛋白质聚合物的制备方法见于美国专利5,243,038和EPA89.913054.3。
本发明提供了聚合组合物及其使用方法，其中的聚合组织物能在原位化学交联以提供新的交联聚合产物，其具有良好的机械和生物性能，比如牢固地粘合于组织。该组合物能应用于各种涉及其物理的，化学性及生物学特性的，涉及粘合分离的组织的用途中以提供至少一种包括稳定，柔韧，重吸收的特性的粘合。
该目的组织物含有高分子量的重组聚合物，该聚合物带有一个或一种与天然生成的结构蛋白相关的重复单元的结合。尤其重要的是丝心蛋白，弹性蛋白，胶原蛋白，及角蛋白，尤其胶原蛋白以及丝心蛋白和弹性蛋白的结构物的重复单元。该聚合物带有能在生理条件下用生理可接受的交联剂进行化学交联的官能团，所以能生成一种对各种基质具有强烈的粘合特性的，具有强的足以维护基质间结合的机械性能，并能配制成具有良好的重吸收性能的组合物。
尤其重要的是，本目的组合物提供了对组织的牢固的粘合作用并以接触的空间关系维持分离的组织。该目的组合物也可用作密封剂，其中的组合物可能用于填充组织中空缺，增强组织块或者将合成材料粘合于组织上。该目的组合物也可在体内通过和一种药物组合物混合而作为贮存物，或者用于粘合组织的粘合剂，或者用于其它粘合或者仅作为药物的缓释源。
用于交联的官能团可以是以全部相同的或者是官能团的结合并可能含有天然生成的氨基酸的官能团，诸如氨基，如赖氨酸，羧基，如天冬氨酸和谷氨酸，胍基，如精氨酸，羟基，如丝氨酸和苏氨酸，及巯基，如半胱氨酸。优选地，该官能团是氨基(包括胍基)。
该聚合物的分子量至少约为15KD，一般至少约为30KD，优选地至少约为50KD并且通常不超过250KD，更通常地为不超过约150KD。该聚合物至少具有两个官能度，更通常地约为至少四个官能度，每个官能度一般的当量在大约1KD到40KD的范围，更常见地在大约3KD到20KD的范围，优选范围为3-10KD，至少有3个，通常有6个官能度用于交联。若有必要，可以使用聚合物的混合物，其中的聚合物带有官能度的结合或带有不同的诸如羧基和氨基，巯基或醛基，羟基和氨基等的官能度。因此，基于该官能度和交联剂，能够形成酰胺，亚胺，脲，酯，醚，脲烷，硫醚，二硫化物及类似物。
该聚合物中的单体单元可选自丝心蛋白，GAGAGS(序列01)；弹性蛋白，GVGVP(序列02)；胶原蛋白GXX，其中的X′S可以是相同或不同的，并至少有10％但不超过60％的X′S是脯氨酸，以及角蛋白，AKLK/ELAE(序列3)。该所需的官能团可以取代单体单元中的一个氨基酸或者作为不超过大约30个氨基酸，一般不超过16个氨基酸的插入基团的一个单独氨基酸或者部分。在先前的例子中提供的是重复嵌段中的一个或多个重复序列被修饰以及引入交联的官能度中，该官能度正常情况下是不存在的。因此，可用赖氨酸取代缬氨酸，精氨酸取代甘氨酸，丝氨酸取代丙氨酸，以及其它类似地取代。在最近的例子中，在重复单元的嵌段中可能有插入官能度，其中的插入官能度的数目基于前述的范围。
尤其重要的是共聚物，或者是嵌段共聚物的或者是无规共聚物，优选嵌段共聚物，其中就弹性蛋白和丝心蛋白而言，弹性蛋白单位对丝心蛋白单位的比率在16-1∶1；优选地为8-1∶1的范围内，其中的嵌段具有不同的比率。一般地，在嵌段共聚物中，每个嵌段含有至少两个单元而不超过大约32个单元，通常不超过大约24个单元。通过用带有合适的官能团的氨基酸取代单元中的氨基酸可以提供合适数目的存在于该聚合物中的官能度或者在嵌段间使用插入基团。
单个氨基酸的重复单元含有3到30个氨基酸，通常含有3到25个氨基酸，更常见地是3到15个氨基酸，尤其是3-12个氨基酸，更尤其是3-9个氨基酸。至少有40％，通常有至少50％，更常见地有至少70％重量的蛋白质聚合物是由至少含有两个相同的连续重复单元的重复单元的片段所构成。使用的聚合物中的重复嵌段通常含有至少2，4，7或8个单元，及其结合，其中由交联官能团进行修饰的单元计为一个单元。
在大多数情况下，本发明的聚合物在聚合物链中带有天然产生的氨基酸的活性官能团，若需要，还可以带有侧基以提供所需的官能度。例如，羧基可以和多胺反应以使用一个羧基官能团交换1个或n个氨基。可以用多羧酸取代氨基以便用若干羧基置换氨基。可以通过和醛烯如丙烯醛反应而用醛置换巯基，以便提供一个醛官能度。若有必要，还可以引入其它诸如磷酸酯，活化的烯，如马来酰亚胺，硫代异氰酸根等的官能度。该官能度可以大大地不同于天然产物以便提供交联的可能。在一些情况下，这可能需要增加单位分子量的官能度数，而不增加整个链的官能度。这是用一种官能度取代另一种，如用醛取代巯基，从而便于交联剂选择的更大的变化。
该交联剂一般地是双功能的，其中的官能度可以是相同或者不同的(虽然可具有较高的官能度)，并且是不超过四个官能度的。基于聚合物上可用的具体的官能度，可以使用各种交联剂。该交联剂通常是至少大约3个碳原子而不超过50个碳原子的，一般介于大约3-30个碳原子，更常见地介于3-16个碳原子。联接两个官能度的链是至少一个原子而不超过大约100个原子，通常不超过大约60个原子，优选地是不超过40个原子，尤其是不超过大约20个原子，其中的原子可是碳，氧，氮，硫，亚磷，或类似原子。该连接基可以是脂肪饱和的或不饱和的，优选地是脂族的，并可以包含诸如羟，酯，酰胺，硫醚，氨基，及亚磷酯的官能度。交联基团可以是巯水的或亲水的。
可以使用各种活性官能团，诸如醛基，异氰酸酯，混合的羧酸酐，如乙氧甲酸酐，活化的烯，活化的卤素，氨基，及类似物。通过选择蛋白聚合物合适的官能度以及交联剂可以控制交联度和反应率。
可以使用各种交联剂，尤其是那些以前曾用过的和已发现是生理可接受的。可以使用的交联剂包括二醛，如戊二醛，活化的二烯，二异氰酸酯如，四亚甲基二异氰酸酯，六亚甲基二异氰酸酯，八亚甲基二异氰酸酯，酸酐，如琥珀酸二酐，乙烯二胺四乙酸二酐，二胺，如六亚甲基二胺，环(L-赖氨酰-L赖氨酸)等。该交联剂也可以含有不对称的官能度，例如，活化的烯醛，如丙烯醛和醌型醛，活化的卤代羧酸酐，及类似物。该交联剂通常是市售的或者也可以按照常规的方法或是在粘合剂使用前或者在原位方便地合成。
在一些情况下，还可能需要将一种生理可接受的第二化合物作为改性单元和一种多功能的，通常是双功能的化合物反应以改变交联特性。该第二化合物的加入可能增加交联率，改变该交联剂的溶解特性，增强或者降低该交联聚合物的强度，增强或降低重吸收率，或者提供其它感兴趣的物理，化学或者生物特性。该多功能的第二化合物可以在和蛋白反应前或者同时和交联化合物反应。若反应在前，那么所得交联产物将是生理可接受的而当同时反应时，用在原位的多功第二化合物，交联化合物和所得交联产物将是生理可接受的。该多功能的第二化合物对交联化合物的比率一般在大约0.1-2∶1的范围内，更常见地在大约0.1-1∶1的范围内，其是根据当该多功能的第二化合物和交联剂放在一起时的反应性，在最终的蛋白质组合物中所需的交联数，蛋白质分子间桥的大小，以及其它类似因素而定。
该多功能的第二化合物的性质可以有很大的不同。该官能基团可以是相同于或不同于聚合物中的官能基团，但能和该交联化合物的官能度反应。例如，该多功能的第二化合物可以带有氨基和/或者羟基，而蛋白质中带有氨基或者羟基官能度。通过使用二异氰酸酯和二醇将能产生二尿烷。从而，该交联蛋白的链将含有2个或多个尿烷。
在很多情况下，该多官能的第二化合物包括有内官能度，其不参加反应却可以提供给交联剂或交联的蛋白产物其它特性。感兴趣的特性包括亲水性，水解不稳定性，酶降解敏感性，生物适应性，剪切强度，及类似特性。内官能度大多会包含氧，硫和氮原子，如醚，羧酸酯，包括尿烷，氨基，酰胺，酮，二硫酚及类似物。为了增强重吸收率，酯基是重要的，而为了增强亲水性，可以使用相同的基团和醚，如聚氧化烯基。
该多功能的第二化合物一般带有至少2个碳原子而不超过50个碳原子，通常不超过大约30个碳原子，期望的是每个杂原子带有不超过大约16个的碳原子。天然的或合成的双功能化合物都可以使用。典型的化合物包括赖氨酸，精氨酸，二-(2＇-氨乙基)丙二酸酯，柠檬酸酯，赖氨酰赖氨酸，2′-氨乙基甘氨酸酯，O，N-二甘氨酰乙醇胺，二乙烯甘醇二甘氨酸酯，胱氨酸，及类似物。为了提供末端氨基，可以使用各种低分子量的氨基酸，尤其是结合到插入的双功能化合物的甘氨酸和丙氨酸，如乙烯甘醇，二乙烯甘醇，以及四乙烯甘醇，丙二醇，1-4-丁基卡因-2-二醇，抗坏血酸，等。
该目的组合物可以在粘合剂使用前通过结合该蛋白质聚合物和交联剂而制备，其中的一个或者两个都带有增量剂。该两种组合物可按照常规的方法而方便地混合，例如，用注射器将该组份注入中央反应器并通过将其吸入注射器并前后推移而混合。或者，将该两种组合物同时在应用部位分散。在一些情况下，可能需要让该交联剂在多功能的第二化合物加入前和蛋白质部分地反应。或者，可以将该多功能的第二化合物在和交联剂混合前和蛋白质混合。
通常，得到的聚合物是分散液或溶液，特别水溶液，其蛋白质聚合物的浓度一般介于大约50mg-18/ml的范围内，更常见地是介于100-800mg/ml的范围。该溶液是以能提高或减缓交联速率的pH缓冲的。该pH通常介于大约2-12的范围，更常见地是8-11。可使用各种缓冲液，如磷酸盐，硼酸盐，碳酸盐，等。阳离子可以影响产物的特性，而从这个意义上说，优选地是碱金属钾和钠。为了提供便于操作的组合物，在需要的时间限度内制备通常介于大约5-40％，更常见地介于大约5-20％，优选地介于10-20重量的蛋白组合物，及类似物。该缓冲液的浓度一般介于大约50-500mM的范围。在蛋白质溶液还可有其它试剂，如稳定剂，表面活性剂，及其类似物。若有多功能的第二化合物存在，其浓度是按照该交联剂和聚合物的比率确定的。
该交联剂对聚合物的比率依赖于交联剂，聚合物中的官能度的数目，所需的硬化速度，及类似情况而有很大变化。一般地，聚合物对交联剂的重量比率是至少大约1∶1而不超过100∶1，通常不超过大约50∶1，常见地介于2-50∶1，但在某些情况下可能不超过30∶1。蛋白质对交联剂的当量比率通常介于大约0.1-1∶3，更常见地介于大约0.5-2∶2。选择该蛋白质 交联剂的当量比率的依据是制备速率，该交联剂的反应性，该交联剂在混合物中的相对溶解度，该交联剂的生理特性，该交联产物所需的稳定程度，及类似情况。
若有必要，可以使用各种增量剂，特别是天然的蛋白质。该增量剂通常不超过组合物重量的50％，一般不超过大约20％，更常见地是不超过大约10％。可以使用的增量剂包括，但不限于：合成的聚合物，加成和缩合聚合物，蛋白质和非蛋白质，例如聚交酯，聚乙交酯，聚酐，聚原酸酯，聚乙烯化合物，聚烯，聚丙烯酸酯，聚乙烯甘醇，聚酯，聚乙烯醇，聚醚，共聚物及其衍生物；以及天然聚合物，例如，蛋白质和非蛋白质，包括胶原蛋白，纤维蛋白原，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，角蛋白，壳聚糖，肝素，右旋糖酐，藻酸盐，纤维素，糖氨基聚糖，透明质酸，聚(多糖)，其衍生物，及类似物。增量剂可以调整超交时间并提供给粘合剂所需要的物理或生理特性。
基于在实验性切片上进行的重迭部分剪切能力强度测试，在30分钟内，通常在15分钟，更常见地在5分钟，该重迭部分切剪能力强度至少为100，优选地为至少大约250，更优选地至少约为300，通常不超过大约4000，更常见地为不超过3000g/cm2。
该目的组合物可以任何方便的方式用于组织，例如，使用注射器，导管，套管，手工施用该组合物，喷雾或其它类似方法。该目的组合物可在该组织切口保持在接触关系的期间或者之前施于组织。该目的组合物含迅速地发展相当的切应力强度以便维持组织的接触。在某些情况下，有必要的是该组合物能在某些必要的时间段后，通常在至少一周且一般不超过大约四周的时期后降解。
能应用的组织包括血管如动脉，静脉或者毛细血管，肌，神经，器官，如肝，脾，等等，肺，硬脑膜，结肠，及其它类似组织。
除了用作粘合剂外，该目的组合物还可以用于密闭或填充缺陷，如组织中的空隙或洞，并因此用作密封剂。从而，该组合物可用于阻止液流，如血液，从破裂血管中流出，如动脉静脉，毛细血管及类似物。对于用作密封剂的目的组合物，其可以如上文所述施用于需要密封缺陷的部位。该组合物可以注入正常或者异常的组织中以增加组织块，如皮肤。
该目标组合物也可用于制品的制备中，其是通过单独使用其本身或者和其它材料结合使用。在一个应用中，制备哺乳动物体内使用的用品，其中的优越性是生物适应性，重吸收率，能血管化，组织粘合和/或者粘结能力，及类似性能。可以制造各种制品，如凝胶，薄膜，纤维，包衣，制备诸如针和螺钉等物，或者能流动的可注射组合物，其中的可注射组合物能起效并粘合或密封组织，形成一个药物贮存物，增强组织或作为填充剂，包衣或类似物。所形成的物可按照常规的方法，如模压，挤压从溶剂中沉淀，溶剂蒸发，及类似方法制备。可流动的缓释型制剂可以通过在用聚合物饱和的介质使用分子分散体，细颗粒；使用熔体，其中的熔体温度是通过加入生理可接受的添加剂而达到；以及类似方法而获得。
该物品可以用于和植入该物品到哺乳动物宿主相关的情况或者将其应用于哺乳动物宿主的表面，如创伤治疗，烧伤敷料，等等。在这些情况下，该物品的效果可在预定的时期内持续并能由自然过程生成的天然材料所代替，从而，需要该材料在完成其使命直至天然过程已重新了天然结构后能再吸收。因此，该组合物可以用于保持组织接触，覆盖组织，微囊化器官的细胞，提供一种细胞可侵入并能用天然组合物代替该组合物的包衣，如骨，软组织和类似物。
为了增强该聚合组合物的硬度，可将该组合物部分地预聚合。在预聚合时，与交联作用的完成相比，聚合物通常至少大约有交联链总数的3％而不超过75％。该交联链数应该允许该所得产物易加工并在起效前提供充分的时间。或者，可以将该官能团和过量的交联剂反应以便使得用该交联剂的官能度取代蛋白质的交联度。然后，该带有聚代的官能度的蛋白质可以用于交联带有原来的交联度或者多功能的第二化合物的蛋白。
该目标组合物也可用作缓释型制剂以提供一种相对均匀地释放的生理活性的产物，如药物。该药物可以合适的浓度在交联前和目的组合物混合。当交联聚合物降解时，由于该缓释制剂外表面的扩散和侵蚀可以将该药物释放。通过控制该缓释剂的剂型，交联度，药物和类似物的浓度，该药物的生理治疗水平可以持续地维持。根据具体组合物及应用，该需要吸收的时期可以短到0.5天并长过4，6或8周或更长。
可以用常规的方法制备该蛋白聚合物组合物。例如，见于美国专利5,243,038，其公开内容以参考文献的形式并入本发明。简短地说，可以合成含有许多重复单元的序列，其互补序列导致了带有突出端的dsDNA。可制备一系列dsDNA并通过逐步转入而构建作为该蛋白质基因的克隆载体。用此方法可得单体，其可通过测序而证明其序列没有改变，随后多聚化该单体，克隆并表达。而进一步的细节见于上文提供的专利。
为了说明而非限制的目的而提供了下列实施例。
实施例1
方法
合成DNA的构建及其大规模地用于多肽的合成见于美国专利5,243,038；PCT/US89/05016和PCT/US 92/09485，其公开内容以参考文献的形式并入本发明。对这些方法的改进及其它方法如下。
1使用滤器和柱纯化DNA
A. Ultrafree-Probind过滤装置(“Probind”，Millipore)：将该DNA溶液加入过滤装置并在Sorvall Microspin 24s中12,000 RPM离心30秒。
B. Microcon-30滤膜(Amicon)：将该含DNA的溶液通过加入滤器并换水两次再在微量离心管中离心(12,000RPM)6分钟而洗涤。
C. Bio-Spin6柱(“Bio-Spin”，BioRad)：将该DNA溶液事先在TEAB(三乙基碳酸氢铵，pH7.0)平衡再过柱，并在Sorvall RC5B离心管中离心(用HB4转子，2,500RPM，4分钟)。
2.磷酸酶处理DNA
DNA的磷酸酶处理可通过在20mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl2中重悬乙醇沉淀的经限制酶切的DNA并使DNA终浓度达到20μg/ml。以2μ/μgDNA的浓度加入Shrimp碱性磷酸酶(SAP)并在37℃下培育该混合液1小时，65℃下20分钟热灭活，然后，过Probind滤膜，再过Bio-Spin柱。
3.制备性琼脂糖凝胶电泳
为了琼脂糖连接，使用的缓冲液是1×TAE(50mM Tris-乙酸盐，pH7.8)。
4.琼脂糖DNA连接
将琼脂糖在65℃下熔化，然后降到37℃并加入连接缓冲液(5X＝100mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl2，50mM DTT,1mM ATP)；然后将反应管置于室温并加入连接酶(1000单位T4 DNA连接酶(NEB))。该反应体积一般为50μl。反应液在15℃下培育16-18小时。
5.用Ultrafree-MC过滤装置纯化琼脂糖DNA
该方法可用于切成400μl大小的琼脂糖。琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭染色观察并切出带有所需DNA带的琼脂糖块。然后，将该琼脂糖在-20℃冷冻一小时，再在37℃下5分钟快速解冻。然后，该琼脂糖彻底浸渍。再将其转移到过滤装置的样品杯中并在5,000xg下用普通的微量离心机离心20分钟。再将该琼脂糖重悬于200μl的Tris-EDTA中，或者其它缓冲液中，并在室温下培育30分钟以使其它DNA从凝胶上洗脱。在10,000RPM下离心该混合物20分钟。至此，DNA存在于滤管中并从琼脂糖片段上分离，从而可用于随后的DNA操作。
6.人工合成肽的抗体的制备
使用如美国专利5,243,038，PCT/US89/05016和PCT/US92/09485中所述的方法进行。
7.凝胶中蛋白质的免疫印迹
还可以使用另一种检测125I-蛋白A的方法。该方法基于由辣根过氧化物酶(HRP)的发的化学发光信号。该化学发光试剂可以方便地从诸如Amersham和DnPont NEN的n个供应商处购得。制备Westem印迹并用BLOTTO封闭。用于引入该HRP标记的酶的一些方法包括，例如，半抗原/抗-半抗原-HRP，生物素化抗体/链霉抗生物素-HRP，或者羊或小鼠-抗兔TgG-HRP。这些试剂购自各种厂商如BioRad或Amersham，偶而也有生物素化的抗体在我们的实验室用来自Vector实验室(Burlinggame，CA.(CaT.#SP-1200))的生物素NHS按照厂商的产品说明书制备。以下是一个用于检测蛋白质聚合物的表达的方法。
将该印迹置于15ml的BLOTTO溶液(含有溶于其中的生物素化羊抗-兔TgG(BioRad)(1∶7500))中并在室温下轻轻振荡2小时。然后，洗涤该滤膜30分钟(3次换TSA(50mM Ths-HClpH7.4，0.9％NaCl，0.2％叠氮化钠))，然后在含0.1％TWEEN 20的TBS中洗涤5分钟。再将该印迹在室温下轻轻旋转培育20分钟(带有0.1％Tween20的20ml的TBS(100mM Ths碱，150mM NaCl，pH7.5)HRP-链霉抗生物素蛋白(Amersham)(1∶1000稀释)中)。然后，将该印迹在含0.3％的Tween20的TBS中洗涤3次，每次5分钟，再用含0.1％Tween20的TBS中洗涤3次，每次5分钟。然后，将该印迹在转振下在12ml的以等量混合的#1和#2(Amersham)显色液中培育1分钟。移出印迹并放射自显影。
8.蛋白质表达检测
在250ml的烧瓶中，用50ml的LB培养基在30℃下培养该培养液过夜。加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素并在30℃下搅拌培养(200rPm)。当该培养液的OD600达到0.8时，移出40ml到事先42℃预热新烧瓶中并在相同的温度下培养大约2小时。将培养液(30℃和42℃)冰冻冷却并测OD600。离心收集细胞并按1.0OD600分成数等份，用于使用合适的抗体进行的Western检测。
9.氨基酸检测
使用Waters 600E系统在反相HPLC上检测氨基酸衍生物。
10.肽合成
在Ramin/Protein Technologies PS3 FMOC肽合成仪上制备合成肽。合成和切割都使用仪器操作说明书上提供的方法完成。
11.体外DNA合成
β-氰乙基亚磷酰胺，控制-孔玻璃柱以及全部合成试剂均购自Applied Biosystems，Foster市，California。合成的寡核苷酸是使用亚磷酸三酯的方法在Applied Biosystems Model 381A DNA合成仪上用10倍过量的保护的亚磷酰胺和0.2μmol的结合于合成支持柱上核苷酸而制备的。用于合成的化学方法是该合成仪使用说明书推荐的常规方法并见于(Matteucci等，美国化学学会杂志，103：3185-3319(1981))。脱保护和固相支持物上的寡聚体的切割是按照Applied Biosystems提供的常规方案进行的。用Applied Biosystems推荐的方法通过测定去保护基的OD值而得到的合成回收率大于97.5％。
使用Applied Biosystems，1992年的评价和分离合成的寡聚核苷酸的方法通过制备性凝胶电泳纯化该粗制的寡核苷酸混合物。该丙烯酰胺胶的浓度根据寡聚体的浓度而介于10-20％之间。若有必要，该纯化的寡聚体用UV投影鉴定，从凝胶上切出并用压榨和浸出法抽提(Smith，酶学分法，65：371-379(1980))。
对于长度超过100个碱基的寡核苷酸的合成来说，合成循环是由381ADNA合成仪代替Applied Biosystems推荐的方案。使用全部的试剂均为新鲜的。除了乙腈(水含量低于0.001％的Burdick和Jackson Cat#017-4)和2000A孔径的柱(Glen Rosearch)外，其余全部试剂均由Applied Biosystems提供。鉴于寡聚体的长度，在合成过程中必需有暂停以便更换试剂已用完的试剂瓶。该暂停是在循环开始步骤而暂停时间要尽可能的短。在每个合成循环的开始，用TCA在脱三苯甲基后的洗涤要比推荐次数多2到3次。加帽反应的时间也要延长以控制截短的失败序列。将该合成的DNA脱盐后进行PCR扩增。
12.DNA的序列分析
数据的贮存和分析是使用DNA Strider，DNA Inspectim IIe或者DNA id的Apple Macintosh个人电脑的软件。
13.双链质粒DNA的双脱氧DNA序列分析
按美国专利5,243,038所述的方法小量制备质粒DNA。在DNA合成仪上合成引物并按MB测序的步骤对质粒DNA退火。使用测序酶(United States Biochemicals)及其推荐的条件进行测序反应。全部序列在聚丙烯酰家胺凝胶上电泳。
14.PCR扩增
该PCR反应是以100μl的体积在Perkin Elmer薄壁Gene AmpTM反应管中进行。将大约lμm的每个引物加入1×PCR缓冲液(Perkin Elmer提供，10x溶液)，200μMdNT，5μTaq酶，以及一定浓度的靶DNA中。扩增是在Perkin Elner DNA热循环仪(Model 480)上以30周期，每周期12分钟，循环参数为95℃，62℃和72℃而进行的。以1.5％的低熔点琼脂糖凝胶在0.5×TA缓冲液中电泳检测各种反应试样。收集给出所需带的反应混合液并通过Probind滤膜离心除去Taq酶，然后过Microcon-30滤膜和Bio-Spin柱。真空浓缩该DNA溶液。
15.二胺合成甘氨酸2-氨乙基酯：
将浓硫酸(9.90克，0.101摩尔)稀释于10ml的水中。将甘氨酸(7.50g，0.100mole)，2-氨基乙醇(6.10g，0.100mole)和稀硫酸置于250ml的三颈圆底烧瓶中，配上塞，机械搅拌器，加热罩，和Dean-Stark水汽阀，用氮气流保护该装置中内容物免受水汽干扰。加入甲苯(100ml)并回流流装置的内容物直至无水挥发的产生。拆除该装置并倾去甲苯，再接上真空管以除去残留在反应物中的甲苯。该产品无需再纯化即可使用。该反应产物的傅立叶变换红外光谱显示其在1736cm 1和1672cm 1处有强烈的羧基吸收。同甘氨酸乙酯氢氯化物和甘氨酰甘氨酸氢氯化物的光谱相比，估计该反应产物是大约4∶1混合物的甘氨酸2-氨乙酯和N，O-二甘氨酰乙醇胺。赖氨酸胆碱酯：
将浓硫酸(11.40g，0.120mole)稀释到水(10ml)中。将赖氨酸单氢氯化物(13.69g，0.075mole)，氯化胆碱(10.47g，0.075mole)及稀硫酸置于装有磁力搅拌棒，热油浴加热，及真空管的250ml的单颈圆底烧瓶中。逐步开真空并渐渐加热以除去进入用液氮冷却的阀中的挥发组分。当油浴温度达到110℃而压力降至0.024mm-Hg时终止反应。用薄层色谱(纤维素，乙酸/乙腈/水5∶65：30v/v/V，在喷雾的茚三酮中显色，Rf＝0.25)显示该产物是均一的。其可以直接使用。二甘氨酸1，3-丙二酯：
将浓硫酸(10.78g，0.110mole)稀释到水(10ml)中。将1，3-丙二醇(7.61g，0.100mole)，甘氨酸(15.0g，0.200mole)，及稀硫酸置于装有塞子，机械搅拌器，油浴，以及Dean-Stark水阀的250m三颈圆底烧瓶中。用氮气流保护该装置的内容物不受湿气侵扰。加入甲苯(100ml)，130℃油浴，并回流该内容物直至无进一步的水挥发产生(约9小时)。拆除装置并倾除甲苯。将反应物在室温下搅拌溶于水(29ml)。冷却至-20℃18小时，该溶液中沉淀出可用过滤移出的白色的细晶体。将滤液倾入预冷去3℃的甲醇(250ml)中从而沉淀出半固态浆料。倾去上清，将该浆料的研体中分批研磨并用甲醇(50ml)研碎以得到颗粒状固体(12.55g)。将固态样品(9.19g)用甲醇(18.4ml)加水(7.9ml)煮沸，趁热过滤，并在4℃下结晶18小时。趁冷过滤沉淀，沉积于漏斗，用甲醇，丙酮漂洗，并空气干燥以得到白色晶态固体(6.89g)。使用pH升，用KOH水溶液滴定该产物样品。每种胺的表观当量为201g/mol；还出现了一种酸性污染物，其表观当量为601g/mole。傅立叶变换色谱显示单羧基吸收峰在1744cm-1。
16.发酵条件
用于表达该蛋白质聚合物的发酵罐通常是15LMBR，10L工作容积，或者13L Braun Bostat E，8.5L工作容积。发酵罐及其尺寸的选择不是很严格。可以使用任何适于EColi生长的培养基。氮源可使用从NZ胺到天机盐而碳源一般是甘油或葡萄糖。全部发酵都是在选择性适于该质检所需(如卡那霉素，氨苄青霉素，等)的条件下进行的。用于在Ecoli中表达蛋白质聚合物的发酵方法是补料分批法。虽然也可以用其它方法，但补料分批法是发酵重组生物的优选方法。
该补料分批法是利用细胞从指数生长期到稳定期的过渡的生长阶段而进行的。该过渡通常是必要营养成份的耗尽或者代谢副产物的积累的结果。当原因是前者时，加入营养物到系统中可使细胞分裂继续进行。可以在发酵过程中逐步加入一种或多种必要营养成份到反应罐中从而使得净体积增加。结果是控制生长速度从而使生物量和表达水平最优化。当培养液中细胞数达到或接近最大值时，通过基于所用的表达系统而提供合适的物理或化学信号能诱导蛋白质聚合物的生产。然后，生产继续进行直至积累的产物达到最高水平(Fiestchko，J.，和Riteh，T，化学工程通讯。1986，45：229-240；Seo，J.H.；Bailey，J.E.，生物技术和生物工程1986，28：1590-1594)。
实施例2SELP8K，SELP8E和CLP6的构建
制备称为SELP8K和SELP8E的聚合物，其特征是带有用于交联的官能团。这些聚合物的构建见下文(从前述的基因单体，SELPO开始)(见于美国专利5,243,038，PSY1298)。SELP8K和SELP8E氨基酸单体序列设计：SELP8K MONOMER(GAGAGS)4(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3(序列04)SELP8K MONOMER(GAGAGS)4(GVGVP)4GEGVP(GVGVP)3(序列05)SELP8构建：
质粒PSY1378(见于美国专利5,243,038)用Ban I REN消化，琼脂糖电泳纯化，再过NACS柱，然后，用乙醇在2.5M乙酸铵中沉淀DNA并和事先用Fok I REN消化的PPT0134(见于PCT/US92/09485)相接，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
将该连接混合物的产物转化到E.coli株HB101中。将从转化子中抽提的质检DNA纯化并通过Nra I和Xmn I RENs消化分析。得到带有所需的限制性酶切位点的质检PPT0255并用于随后的构建。
用Cfr10I REN处理质检DNAPPT0255，随后用RNAse处理。通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段，切出DNA并自连接。将连接产物转化到E.coli株HB101中。将从转化体中提纯的质粒DNA纯化并用Nae I和Stu I RENs消化分析。将带有所需的缺失的质粒PPT0267用于随后的构建。
合成出的两个寡核苷酸如表1所示并如实施例1所述纯化。
表1
5-CTGGAGCGGGTGCCTGCATGTACATCCGAGT-3′(序列06)
3-CCGAGACCTCGCCCACGGACGTACATGTAGGCTCA-5′(序列
07)
将两段寡核苷酸链退火并和事先用Ban II和Sca I RENs消化的质粒PPT026 DNA连接，用琼脂糖凝胶电泳纯化，再过NACS柱。
将该连接反应的产物转化入E.coli株HB101中。将从转化体中抽提的质粒DNA纯化并用Dra I消化。
将来源于两个克隆的带有正确的消化位点的质粒DNA测序。发现称为PPT0287的质粒DNA是正确的并选作进一步的构建。
将质粒DNApSY1298(见于美国专利5,243,038)用Ban II REN消化，并用琼脂糖凝胶电泳纯化该SELPO基因片段，再过NACs柱，最后连接于用BanII消化的PPT0287。用苯酚/氯仿抽提除去酶并用乙醇沉淀。
将连接产物转化到E.coli株HB101中。将从转化体中提取的质粒DNA纯化并用Dral REN消化分析。将源于该克隆的且显示出正确的限制性位点的质粒DNA用Ban II，Aha II和Stn I RENs进一步消化。质粒PPT0289带有所需的SELP8单体序列(见表2)。
表2：SELP8基因单体序列
BanI BanIIGGT GCC GGT TCT GGA GCT GGC GCG GGC TCT GGA GTA GGT GTG CCA GGTCCA CGG CCA AGA CCT CGA CCG CGC CCG AGA CCT CAT CCA CAC GGT CCAG A G S G A G A G S G V G V P GGTA GGA GTT CCG GGT GTA GGC GTT CCG GGA GTT GGT GTA CCT GGA GTGCAT CCT CAA GGC CCA CAT CCG CAA GGC CCT CAA CCA CAT GGA CCT CACV G V P G V G V P G V G V P G V
SmaIGGT GTT CCA GGC GTA GGT GTG CCC GGG GTA GGA GTA CCA GGG GTA GGCCCA CAA GGT CCG CAT CCA CAC GGG CCC CAT CCT CAT GGT CCC CAT CCGG V P G V G V P G V G V P G V G
BanIIGTC CCT GGA GCG GGT GCT GGT AGC GGC GCA GGC GCG GGC TCT GGA GCGCAG GGA CCT CGC CCA CGA CCA TCG CCG CGT CCG CGC CCG AGA CCT CGCV P G A G A G S G A G A G S G A(SEQ ID NOS：08 & 09)构建SELP8K和SELP8E基因单体
合成在90位点处带有单碱基多态性的能克隆一份SELP8基因单体的一条寡核苷酸链。在此位点上使用腺嘌呤和鸟嘌呤都可从单合成中产生出克隆赖氨酸和谷氨酸的寡核苷酸(见表3)。该合成是在Applied Biosystems DNA合成仪(model 381A)上用Glen Research提供的2000A合成柱进行的。减少了在该合成中所需换瓶的时间。合成后，将该202个碱基的DNA片段脱保护并通过在55℃下用30％氢氧化铵处理6小时而从柱上切下。
表35′-ATGGCAGCGAAAGGGGACCGGGCTCTGGTGTTGGAGTGCCAGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGCGTTCCGGGAGTTGGTGTACCTGGA(A/G)AAGGTGTTCCGGGGGTAGGTGTGCCGGGCGTTGGAGTACCAGGTGTAGGCGTCCCGGGAGCGGGTGCTGGTAGCGGCGCAGGCGCGGGCTCTTTCCGCTAAAGTCCTGCCGT-3′(SEQ ID NO：10)
另有两条DNA链用作PCR扩增的引物。这两条链是：
1.5′-AAGAAGGAGATATCATATGGCAGCGAAAGGGGACC-3′(SEQ ID No：11)
2.5′CGCAGATCTTTAAATTACGGCAGGACTTTAGCGGAAA-3′(SEQ ID No：12)
如实施例1中所述进行PCR扩增和产物纯化。
如实施例1中所述将DNA重悬并且Ban II REN消化。然后，有低熔点琼脂糖凝胶电泳分离该消化的DNA并和事先用Ban II RENs消化的PPT0289相连，再过NACs柱纯化。将连接反应的产物转化到E.Coli株HB101中。从分离的转化体中提取的质粒DNA纯化并用ApaL I和EcoN I RENs消化分析。带有正确的限制性位点的克隆质粒DNA再用Asp700REN消化分析以区别在此多态性位点上编码赖氨酸或谷氨酸的克隆。将带有每种多态性的克隆质粒DNA纯化并通过DNA测序分析。质粒PPT0340含有所需的SELP8K单体序列(见表4)而PPT0350则含有所需的SELP8E单体序列。
表4：SFLP8K基因单体序列
BanI BanII
GGT GCC GGT TCT GGA GCT GGC GCG GGC TCT GGT GTT GGA GTG CCA GGT
CCA CGG CCA AGA CCT CGA CCG CGC CCG AGA CCA CAA CCT CAC GGT CCA
G A G s G A G A G S G V G V P G
EcoNIGTC GGT GTT CCG GGT GTA GGC GTT CCG GGA GTT GGT GTA CCT GGA AAACAG CCA CAA GGC CCA CAT CCG CAA GGC CCT CAA CCA CAT GGA CCT TTTV G V P G V G V P G V G V P G KGGT GTT CCG GGG GTA GGT GTG CCG GGC GTT GGA GTA CCA GGT GTA GGCCCA CAA GGC CCC CAT CCA CAC GGC CCG CAA CCT CAT GGT CCA CAT CCGG V p G V G V P G V G V P G V G
SmaI BanIIGTC CCG GGA GCG GGT GCT GGT AGC GGC GCA GGC GCG GGC TCT GGA GCGCAG GGC CCT CGC CCA CGA CCA TCG CCG CGT CCG CGC CCG AGA CCT CGCV P G A G A G S G A G A G S G A(SEQ ID NO：13 &14)SELP8K聚合物构建
将来源于PPT0340的质粒DNA用Ban I REN消化并将消化片段用琼脂糖凝胶电泳分离。切出192bp的SELP8K基因片段并用NACS柱纯化。将该纯化的片段和已用Ban I REN消化的质粒PPT0317相连，过Millipore Probind和Bio-Spin6柱。然后，如实施例1所述用Shrimp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA。
将该连接反应的产物转化到E.Coli株HB101中。筛选出抗卡那霉素的转化体。纯化每个转化体的质粒DNA并检测其由于SELP8K单体多DNA插入而增加的大小。获得插入了200bp到约7kb的碱基的几个克隆株。将带有6-32重复的克隆株用于表达SELP8K蛋白质聚合物(PPT0341，PPT0343，PPT0344，PPT0345和PPT0347)。SELP8K表达分析
将已在30℃下过夜的培养液接种到置于250ml烧瓶中的50ml的LB培养基。将卡那霉素以终浓度50μg/ml加入并在30℃下摇动(200rpm)培养。当该培养液的OD600达到0.8时，取40ml转移到在42℃中预热的新烧瓶中并在相同的温度下培养约2小时。将培养物(30℃和42℃)冰冻并测OD600。离心收集细胞并以1.0OD600平分，用抗-SLP抗体进行Westem分析。
含有质粒PPT0341，PPT0343，PPT0344，PPT0345和PPT0347的E.coh株HB101如上文所述培养。用Westem blot检测该室的质对SLP抗体的反应从而检测这些细胞生产的蛋白质。每个克隆都产生强烈反应带。该产物的表观分子量介于大约35KD到超过250KD。PPT0345株产生出一个表观分子量为80,000的SLP抗体反应带。所期望的由质检PPT0345编码的SELP8K聚合体的氨基酸序列如下。pPT0345 SELP8K 884 AA MW 69，772
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPMGAGSGAGAGS
[(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3(GAGAGS)4]12
(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3(GAGAGS)2
GAGAMDPGRYQDLRSHHHHHH(SEQ ID No：15)SELP8K纯化
在E.Coli株PPT0345中发酵生产SELP8K。从细胞生物量中通过细胞裂解，离心除去残渣，并亲和层析纯化该产物。将该纯化产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，和能和丝样肽模块(SLP抗体)反应的多克隆抗血清的免疫反应性，及氨基酸分析而检测。用酰胺黑染色SDS-PAGE胶可见有表观分子量为80,000的蛋白带并转膜，在Westem印迹上用SLP抗体反应可见同样的带。如所料，氨基酸分析(如表5所示)表明该产物富含甘氨酸(43.7％)，丙氨酸(12.3％)，丝氨酸(5.3％)，脯氨酸(11.7％)，和缬氨酸(21.2％)。该产物还含有1.5％赖氨酸。下表中的氨基酸组成显示了纯化的产物组成和从合成的基因序列中编码的理论上预期的组成间的关系。
表5：纯化的SELP8K的氨基酸分析
氨基酸 pmoles 实际％组成 理论％组成
Ala 1623.14 12.3 12.2
Asx 122.20 0.9 0.8
Glx nd nd 0.4
Phe 58.16 0.4 0.1
Gly 5759.31 43.7 41.5
His 46.75 0.4 0.8
He 43.87 0.3 0
Lys 198.21 1.5 1.5
Leu 39.54 0.3 0.5
Met 36.01 0.3 0.3
Pro 1534.21 11.7 12.4
Arg 70.84 0.5 0.6
Ser 703.83 5.3 6.1
Thr nd nd 0.1
Val 2797.47 21.2 22.4
Tvr 140.87 1.1 0.1
nd＝没检测CLP6制备
如PCT/US92/09485中所述用PPT0246株制备CLP6(CLP6是指DCP6)。用常规的蛋白质纯化，抽提，和分离方法纯化多克量的蛋白质聚合物。结晶的产物是白色的，海绵状的物质，并且极易溶于水。
CLP6 pPT0246 1,065 AA MW 85，386
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM
[(GAHGPAGPK)2(GAQGPAGPG)24(GAHGPAGPK)2]4
GAMDPGRYQLSAGRYHYQLVWCCK
(SEQ ID NO：16)
实施例3 SELPOK聚合物的构建聚合物设计要素
由丝样嵌段(SLP模块)和弹性蛋白样模块(ELP模块)所组成的SELP8K共聚体结构如下；[(SLP模块)4(ELP嵌段)8]。另外，还可以通过将SLP嵌段的长度调整到ELP嵌段的长度而设计带有不同的重吸收和溶解特性，而其粘合剂特性不变的聚合物。相对于SELP8K而言，SELPOK含有一半长度的可结晶的SLP嵌段而维持其ELP片段的分散频率。
还要设计出带有插入序列以便在体内通过用胶原蛋白酶(92kd)和组织蛋白酶进行蛋白酶切而促进重吸收的聚合物。SELPOK用作这些设计的骨架，但这些位点可用于许多不同的聚合物骨架序列。选择合适的插入位点以便使这些位点便于蛋白酶的催化沟的接近。大多数蛋白酶都结合于该酶切位点的上游四个氨基酸处。因此，该插入序列应该无氢键和可由诸如SLP嵌段诱导的结晶。
在第一个ELP嵌段的脯氨酸后，该SELPOK的β结构断裂。SELPOK-CS1在插入的六个氨基酸中含有两个连续的胶原蛋白酶酶切位点(PLGP)(序列17)。选择该插入位点以便使其从SLP嵌段中至少除去一个脯氨酸(GAGAGS GVGVP LGPLGP GVGVP(序列18)。SELPOK-CS2在八个氨基酸插入片段中含有多个组织蛋白酶B(ARR)，L(FF)，S和H(FVR)和纤溶酶的酶切位点。选择合适的插入位点以便在SLP模块中至少除去一个脯氨酸(GAGAGS GVGVP GFFVRARR GVGVP)(序列19)。质粒PPT0317质粒的构建
用Pvu II REN线性化质粒DNAPSY1262(见于美国专利5,243,038)，然后，过Probind滤膜和Bio-Spin6柱。然后，用Shrimp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA。然后，将该线性化的PSY1262DNA和来源于如下制备的PQE-17(QLAGEN Catalog#33173)的DNA的相联。用Bg III和Hind III RENs消化质粒DNAPQE-17并用Probind滤膜和Biospin柱纯化如表6所示的366P的片段。用Microcon-30滤膜进一步纯化该DNA并保留含有36bp的片段的滤液。然后，用DNA聚合酶I处理该DNA并用Probind滤膜和Biospin柱纯化(见实施例1)。
表65′-GATCTTCGATCTCATCACCATCACCATCACTA(SEQ ID NO：20)3′-AAGCTAGAGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTCGT(SEQ ID NO：21)
将该连接反应的产物转化到E.coli HB101株中。将该转化体的质粒DNA纯化并用Bstl107I和EcoRVRENs酶消化分析。用Bstl 1071和BstYI RENs进一步消化含有所需的DNA片段的克隆株以检测该插入的方向。纯化带有正确的限制性位点的克隆质粒DNA并通过DNA测序检测。质检PPT0317含有所需的DNA插入片段并且可用于进一步的DNA构建。SELPOK聚合物构建
用Applied Biosystems DNA合成仪(model 381A)和Glen Research提供的2000A合成柱合成表7所示的一条寡核苷酸。合成后，将该93个碱基的DNA片段脱保护并在55℃下在氢氧化铵中处理6小时从而从支持柱上切出。
表75′-ATGGCAGCGAAAGGGGACCGGTGCCGGCGCAGGTAGCGGAGCCGGTGCGGGCTCAAAAAGGGCTCTGGTGCCTTTCCGCTAAAGTCCTGCCGT -3′(SEQ ID NO：22)
用和构建SELP8K基因单体所述的相同的两个DNA引物进行PCR反应并纯化反应产物。重悬DNA并用Ban I REN消化。然后，用低熔点琼脂糖凝胶分离该消化的DNA并和事先用Ban I REN消化的PPT0285(见PCT/US92/094850)相连接并过NACS柱纯化。将连接反应的产物转化到E.coliHB101株中。纯化该转化体质粒DNA并用EcoRI和Ban II RENs消化分析。然后，纯化带有正确的限制性位点的克隆质粒DNA并DNA测序分析。质粒PPT0358含有所需的序列并用于随后的DNA构建。
用Ban II REN消化源于PPT0340的质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出156bp(见表8)的SELPOK基因片段并用Ultrafree-Mc滤膜，再过Bio-Spin6柱纯化。
表8BanIIG GGC TCT GGT GTT GGA GTG CCA GGT GTC GGT GTT CCG GGT GTA GGC GTTC CCG AGA CCA CAA CCT CAC GGT CCA CAG CCA CAA GGC CCA CAT CCG CAA G S G V G V P G V G V P G V G VCCG GGA GTT GGT GTA CCT GGA AAA GGT GTT CCG GGG GTA GGT GTG CCGGGC CCT CAA CCA CAT GGA CCT TTT CCA CAA GGC CCC CAT CCA CAC GGCP G V G V P G K G V P G V G V PGGC GTT GGA GTA CCA GGT GTA GGC GTC CCG GGA GCG GGT GCT GGT AGCCCG CAA CCT CAT GGT CCA CAT CCG CAG GGC CCT CGC CCA CGA CCA TCGG V G V P G V G V P G A G A G S
BanIIGGC GCA GGC GCG GGC TCCCG CGT CCG CGC CCG AGG A G A G S(SEQ ID NOS：23&24)
将纯化的片段和已用Ban II REN消化的质粒PPT0358相连接，再过Probind滤膜和Microcon-30滤膜。然后，再用琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。再切出质粒DNA并先后用Ultrafree-MC滤膜和Bio-Spin6柱(见实施例1)纯化。
将该连接反应的产物转化到E.coli HB101株中。筛选出耐氯霉素的转化体。纯化每个转化体的质粒DNA并检测其由于SELPOK多重DNA的插入所致的增加的大小。得到带有不同大小的插入序列的几个克隆株。将分别含有18，2或6个SELPOK基因单体的重复序列的质粒PPT0359，PPT3060和PPT0374用于随后的构建。
将PPT0359和PPT0374的质粒DNA用Ban I REN消化并用琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出大约为2800bp和1000bp的SELPOK基因片段并过NACS柱纯化。然后，将该纯化的片段和已用Ban I REN消化的质粒PPT0317相连接，再过Probind滤膜和Bio-Spin柱。然后，用Shrimp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA，先后过Probind滤膜和Bio-Spin6柱(见实施例1)。
将该连接反应的产物转化到E.coliHB101株中。筛选出耐卡那霉素的转化体。纯化每个转化子的质粒DNA并检测其由于SELPOK多重DNA插入所致的增加的大小。得到几个克隆株。将质粒PPT0364和PPT0375用作SELPOK的表达。SELPOK表达分析
将E.coli HB101株(含质粒PPT0364和PPT0375)如实施例1所述培养生长。通过SDS-PAGE检测这些细胞生产的蛋白质对ELP抗体的反应性。可发现每个被测样均有一条强烈的反应带，其表观分子量分别约为95KD和35KD。
pPT0364 SELPOK 1000 AA MW 80，684
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM
[(GAGAGS)2(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3]16
(GAGAGS)2 GAGAMDPGRYQDLRSHHHHHH
(SEQ ID NO：25)
pPT0375 SELPOK 376 AA MW 31，445
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM
[(GAGAGS)2(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3]6
(GAGAGS)2 GAGAMDPGRYQDLRSHHHHHH
(SEQ ID NO：26)SELPOK-CS1聚合体构建
用Bn I REN消化质粒PPT0360并通过琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出约为300bp的SELPOK基因片段并先后过Ultrafreee-M1滤膜和Bio-Spin6柱纯化。将该纯化的片段和已用Fok I REN消化的质粒PPT0134(见于PCT/US92/09485)相连接。在65℃下加热20分钟灭活该酶并将该连接混合物过Probind滤膜。然后，用Shrimp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA，分别先后过Probind滤膜和Bio-Spin6柱。
将该连接反应的产物转化到E.coliHB101株中。筛选出耐氯霉素的转化体。纯化每个转化体质粒DNA并用Dral REN消化分析。PPT0363显示了正确的限制性图谱并可用于随后的DNA构建。
用Applied Biosystems DNA合成仪(model381A)和2000A的合成柱(GlenResearch提供)合成表9中所示的寡聚核苷酸链。合成后，将该141个碱基的DNA片段脱保护并在55℃下于氢氧化铵中处理6小时而从支持柱上切除。
表95′-ATGGCAGCGAAAGGGGACCGCCGGTGCGGGCTCTGGTGTTGGAGTGCCGCTGGGTCCTCTTGGCCCAGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGCGTTCCGGGAGTTGGTGTACCTGGAAAAGGTTTCCGCTAAAGTCCTGCCGT-3′
(SEQ ID NO：27)
使用和构建SELP8K基因单体中所述的相同的两个DNA引物链进行PCR反应并纯化该反应产物。然后，重悬该DNA并用BsrFI和EcoNI RENs消化。用Probind和Microcon-30滤膜处理该消化的DNA，再和已用BsrFIREN消化的PPT0363相连接，用ProBind滤膜和Bio-Spin6柱处理并用EcoNIREN进一步消化。用琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出较大的约为2000bp的DNA带并先后用Ultrafree-M1滤膜和Bio-Spin6柱(见于实施例1)纯化。
将该连接反应的产物转化到E.coli HB101株中。纯化每个转化体质粒DNA并用Asp 700I和Eco 0109 IRENS消化检测。将表现出正确的限制性图谱的的克隆株质粒DNA纯化的克隆株质粒DNA纯化并通过DNA测序分析。质粒PPT0368(见表10)含有所需的序列并用于随后的DNA构建。
表10BanIIG GGC TCT GGT GTT GGA GTG CCG CTG GGT CCT CTT GGC CCA GGT GTCC CCG AGA CCA CAA CCT CAC GGC GAC CCA GGA GAA CCG GGT CCA CAG G S G V G V P L G P L G P G VGGT GTT CCG GGT GTA GGC GTT CCG GGA GTT GGT GTA CCT GGA AAACCA CAA GGC CCA CAT CCG CAA GGC CCT CAA CCA CAT GGA CCT TTTG V P G V G V P G V G V P G KGGT GTT CCG GGG GTA GGT GTG CCG GGC GTT GGA GTA CCA GGT GTACCA CAA GGC CCC CAT CCA CAC GGC CCG CAA CCT CAT GGT CCA CATG V P G V G V P G V G V P G V
BanIIGGC GTC CCG GGA GCG GGT GCT GGT AGC GGC GCA GGC GCG GGC TCTCCG CAG GGC CCT CGC CCA CGA CCA TCG CCG CGT CCG CGC CCG AGAG V P G A G A G S G A G A G S (SEQ ID NOS：28&29)
用Ban II REN消化质粒DNA PPT0368，并通过琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出174bp的SELPOK-CS1基因片段并先后过Ultrafree-M1滤膜和Bio-Spin6柱纯化。将纯化的片段和已用Ban II REN消化的质粒PPT0358相连，然后，过Probind滤膜和Microcon-30滤膜。随后，用琼脂糖凝胶电泳分离该消化的片段。再切出质粒DNA并先后用Ultrafree-M1滤膜和Bio-Spin6柱(见于实施例1)纯化。
将连接反应的产物转化到E.coli HB101株中。筛选出耐氯霉素的转化体。纯化每个转化体的质粒DNA并检测其由于SELPOK-CS1多重DNA插入而增加的大小。获得了插入大小介于1000bp到大约3000bp的几个克隆株。将含有16个重复的SELPOK-CS1基因单体的质粒PPT0369用于随后构建。
将PPT0369的质粒DNA用BanI REN消化，随后过Probind滤膜并通过琼脂糖凝胶电泳分离该消化的片段。切出大约为2800bp的SELPOK-CS1基因片段并通过Ultrafkee-M1滤膜纯化，过Bio-Spin6柱脱盐。然后，将该纯化的片段和已用BanIREN消化的质粒PPT0317相连，并先后过Probind滤膜和Bio-Spin6柱。随后，用Shrimp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA，先后分别过Probind滤膜和Bio-Spin6柱(见于实施例1)。
将这些连接产物转化到E.coli HB101株中。筛选出耐卡那霉素的转化体。纯化每个转化体的质粒DNA并检测其由于SELPOK-CS1多重DNA插入而增加的大小。获得了几个克隆株。选出质粒PPT0370用于SELPOK-CS1的表达。SELPOK-CS1表达分析
E.coli HB101株(含质粒PPT0370)如实施例1所述培养生长。通过SDS-PAGE检测这些细胞产生的蛋白质对ELP抗体的反应性。在每个检测中均可观察到表观分子量约为90KD的强烈的反应带。 pPT0370 SELPOK-CSl 934 AA MW 76，389
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM
((GAGAGS)2(GVGVP)1LGPLGP(GVGVP)3GKGVP(GVGVP)3]15
(GAGAGS)2GAGAMDPGRYQDLRSHHHHHH
(SEQ ID NO：30)SELPOK-CS2聚合体构建
使用Applied Biosystems DNA合成仪(model 381A)和Glen Research提供的2000A的合成柱合成如表11所示的一个寡聚核苷酸链。合成后，将该147个碱基的DNA片段脱保护并在55℃下于氢氧化铵中处理6小时从而从支持柱上切除。
表115′-ATGGCAGCGAAAGGGGACCGCCGGTGCGGGCTCTGGTGTTGGAGTGCCAGGCTTCTTTGTACGTGCACGCCGTGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGCGTTCCGGGAGTTGGTGTACCTGGAAAAGGTTTCCGCTAAAGTCCTGCCGT-3′(SEQ ID NO：31)
使用和构建SELPSK基因单体中所述的相同的两个DNA引物进行PCR反应并纯化该反应产物。然后，重悬该DNA并用BsrFI和Eco NI RENs消化。用ProBind和Microcon-30滤膜，Bio-Spm6柱处理该消化的DNA，并和已用BsrFIREN消化的PPT0363相连，用ProBind滤膜和Bio-Spin6柱处理并用Eco NI REN进一步消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该消化的片段。切出较大的约为2000bp的DNA带并先后用Ultra M1滤膜和Bio-Spin6柱纯化。
将该连接反应产物转化到E.coli HB101株中。纯化每个转化体的质粒DNA并用Asp 700I和Dra III RENs消化分析。纯化那些显示出正确的限制性图谱的克隆株质粒DNA并通过DNA测序分析。质粒PPT0367(见表12)含有所需的序列并用于随后的DNA构建。
表12BanIIG GGC TCT GGT GTT GGA GTG CCA GGC TTC TTT GTA CGT GCA CGC CGTC CCG AGA CCA CAA CCT CAC GGT CCG AAG AAA CAT GCA CGT GCG GCA G s G V G V P G F F V R A R RGGT GTC GGT GTT CCG GGT GTA GGC GTT CCG GGA GTT GGT GTA CCT GGACCA CAG CCA CAA GGC CCA CAT CCG CAA GGC CCT CAA CCA CAT GGA CCTG V G V P G V G V P G V G V P GAAA GGT GTT CCG GGG GTA GGT GTG CCG GGC GTT GGA GTA CCA GGT GTATTT CCA CAA GGC CCC CAT CCA CAC GGC CCG CAA CCT CAT GGT CCA CATK G V P G V G V P G V G V P G V
BanIIGGC GTC CCG GGA GCG GGT GCT GGT AGC GGC GCA GGC GCG GGC TCCCG CAG GGC CCT CGC CCA CGA CCA TCG CCG CGT CCG CGC CCG AGG V P G A G A G S G A G A G S(SEQ ID NOS： 32&33)
用Ban II REN消化质粒DNA PPT0367，用Probind滤膜和Bio-Spin6柱处理并通过琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出180bp的SELPOK-CS2基因片段并先后用Ultrafree-M1滤膜和Bio-Spin6柱纯化。将该纯化的片段和已用Ban II REN消化的质粒PPT0358相连接并通过Probind滤膜和Microcon-30滤膜。随后用琼脂糖凝胶电泳分离该消化的片段。切出质粒DNA并先后用Ultrafree-M1滤膜和Bio-Spin6柱(见实施例1)纯化。
将该连接反应的产物转化到E.coli HB101株中。筛选出耐氯霉素的转化体。纯化每个转化体的质粒DNA并检测其由于SELPOK-CS2多重DNA的插入所致的增加的大小。获得了几个插入片段大小介于200b0到大约3000bp的克隆株。将分别含有18和15个重复的SELPOK-CS2基因单体的质粒PPT0371和PPT0372用于随后的构建。
用Ban I PEN消化PPT0372的质粒DNA，随后过Probind滤膜，并用琼脂糖凝胶电泳分离该消化片段。切出大约为2800bp的SELPOK-CS2基因片段并过Ultrafree-M1滤膜纯化，用Bio-Spin6柱脱盐。然后，将该纯化片段和已用Ban I REN消化的质检PPT0317相连接，过Probind滤膜和Bio-Spin6柱。用Shrinp碱性磷酸酶(SAP)处理该DNA，先后过Probind滤膜和Bio-Spin6柱(见于实施例1)。
将该连接反应的产物转化入E.coli HB101株中。筛选出耐卡那霉素转化体。纯化在每个转化体的质粒DNA并检测由于SELPOK-CS2多重DNA插入所致的增加的大小。获得了几个克隆株。选出质粒PPT0373用作SELPOK-CS2的表达。SELPOK-CS2表达分析
将含有质粒PPT0373的Ecoli HB101株中实施例1所示培养生长。通过SDS-PAGE检测这些细胞产生的蛋白质对ELP抗体的反应性。在每个检测中均观察到了表现分子量大约为90KD的强烈的反应带。pPT0373 SELPOK-cS2 964 AA MW 83，218
MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM
[(GAGAGS)2(GVGVP)1GFFVRARR(GVGVP)3GKGVP(GVGVP)3]15
(GAGAGS)2GAGAMDPGRYQDLRSHHHHHH(SEQ ID NO：34)SELPOK和SELPOK-CS1的纯化
SELPOK和SELPOK-CS1分别产生于E.coli PPT0364株和PPT0370株。该产物通过裂解该细胞生物量，通过聚乙烯亚胺沉淀并离心硫酸铵沉淀以及离子交换层析除去不可溶的碎片。通过SDS-PAGE，与能和弹性蛋白样肽嵌段(ELP抗体)反应的多克隆抗血清的免疫反应性，以及氨基酸分析检测该纯化的产物。
对SELPOK而言，通过酰胺黑染色的SDS-PAGE分离可见表观分子量为95,000的蛋白带，转膜，并且在Westem印迹上有相同的带和该ELP抗体反应。如所料，氨基酸分析(见于表13)表明该产物富集甘氨酸(41.0％)，丙氨酸(8.0％)，丝氨酸(4.5％)，脯氨酸(14.1％)，以及缬氨酸(26.8％)。该产物还含有1.9％的赖氨酸。下表所示的氨基酸组成显示该纯化的产物的氨基酸组成和理论上期望的由合成的基因序列诱导的理论组成间的相关性。
表13
纯化的SELPOK的氨基酸分析
pMoles Mole％ 理论的Mole％
ASX 28.10 0.6 0.7
GLX 26.90 0.6 0.4
SER 199.84 4.5 4.0
GLy 1812.07 41.0 40.5
HIS 28.45 0.6 0.7
ARG 20.49 0.5 0.5
THR 0 0.0 0.1
ALA 355.29 8.0 8.0
PRO 623.22 14.1 15.0
TYR 8.47 0.2 0.1
VAL 1183.63 26.8 27.3
MET 17.21 0.4 0.3
ILE 4.83 0.1 0.0
LEU 20.66 0.5 0.4
PHE 7.57 0.2 0.1
LYS 84.02 1.9 1.8
总计 4420.75
对SELPOK-CS1而言，通过酰胺黑染色的SDS-PAGE分离胶可见表观分子量为90,000的蛋白带，转膜，并且在Westem印迹上用ELP抗体反应可见相同的带。如所料，氨基酸分析(见于表14)显示该产物寡集甘氨酸(40.0％)，丙氨酸(7.6％)，丝氨酸(5.2％)，脯氨酸(16.3％)，和缬氨酸(23.3％)。该产物也含有1.5％的赖氨酸。下表所示的氨基酸组成表显示了该纯化的产物的组成和理论预期的由合成的基因序列诱生的理论组成的相关性。
表14
纯化的SELPOK-CS1的氨基酸分析
pMoles Mole％ 理论的Mole％
ASX 16.43 0.7 0.7
GLX 10.59 0.5 0.4
SER 119.96 5.2 3.6
GLY 924.51 40.0 39.6
HIS 13.85 0.6 0.7
ARG 11.26 0.5 0.5
THR 0 0.0 0.1
ALA 175.07 7.6 7.3
PRO 376.40 16.3 16.7
TYR 2.49 0.1 0.1
VAL 537.96 23.3 24.5
MET 5.19 0.2 0.3
ILE 0 0.0 0.0
LEU 76.62 33 0.4
PHE 2.58 0.1 0.1
LYS 35.68 1.5 1.6
总计 2308.59
实施例4. CLP6和SELP8K特性的检测试验方法
Tiseel粘合剂系统。用水洗涤大鼠皮，吸干并切成1cm×4cm的条状。应用Tiseel试剂盒VH(Osterreiches皮毛血液衍生物研究所，GmbH，A-1220，Vienna，Austria)按照制造商说明书的方法检测其粘合性。大鼠皮肤重迭部分的抗切张力强度试验
使用体外的大鼠皮肤重迭部分的抗切能力强度试验测定粘合剂组合物的粘合皮肤的能力。将粘合剂施用到从小鼠皮肤采集的皮条带的下侧。叠合第二条皮以便产生出大约1cm2粘合表面。在迭合处施加100克的重量并通常让该粘合物置于室温下2小时使其固化，包于塑料中以防干燥。将该迭合连接装于Instron张力试验器或者类似装置并施加张力。记录并标准化装载失败的所检测的迭合区域。带有戊二醛的粘合系统。将大鼠皮肤用水洗涤，吸干，并切成大约1cm×4cm的条带。蒸馏戊二醛，冻存并在使用前迅速解冻。按照Godman说明书(Goldman，WO94/01508)所述溶解胎牛血清白蛋白。将CLP6以600mg/ml的浓度溶于150mM HEPES+30mM NaCl中并调节pH到7.5。将SELP8K以表15中所示的浓度溶于150mM HEPES+30mM NaCl中并调节pH到7.5。将SELP8K以表15中所示的浓度溶于150mM HEPES+45mM NaCl中并调节到pH8。将所示的蛋白质等分溶液在戊二醛溶液加入前涂布于两块皮肤上。将第二块皮肤盖上并摩擦下层皮肤以分散该组分，并将迭合区调整为大约1cm2，盖以塑料纸以防干燥，并在100g/cm2的压力下于25℃固化2小时。带有1，6-(二异氰酸)己烷的粘合系统。用水洗涤大鼠皮肤，吸干，并切成大约1cm×4cm的皮条。将SELP8K在特定的缓冲液中以大约50％w/w的浓度制成溶液。制备六次甲基二异氰酸酯和PluronicL-61表面活性剂的1：1v/v混和物。先后在一块皮肤上施用20μlSELP8K溶液和2μl的稀HMDI。将第二块皮肤盖在下层皮肤上并摩擦以混合该组分，调整迭合区域到约1cm2，盖上塑料纸以防干燥，并在100g/cm2的压力下于25℃，2小时固化。结果
为了给随后的粘合试验提供一个基线，检测了腈基丙烯酸乙酯和Tisseel纤维蛋白胶。结果如下表。
表15：迭合抗切张力的基本实例 试剂 剂量 抗张力强度常规生理盐水 不适用 13±4Tiseel纤维蛋白胶 -25mg 261±51腈基丙烯酸乙酯 25mg 385±119
全部数据均基于至少三个试验标本。全部试验结果均基于两个小时的固化时间。
将该目标组合物和Goldman(WO94/01508)所述的蛋白质粘合系统相比较。将10微升的戊二醛(浓度如上述)加入到全部试验中。结果如下表。
表16：戊二醛固化的粘合系统的迭合抗切张力 试剂 剂量 抗张力强度卵白蛋的 + 戊二醛(30μ)200mg/mL 10μL2.5N 6mg/2.5mg 50±10发育不全胶原蛋白(变性) + 戊二醛(25μL)125mg/ml 10μL2.5N 3mg/2.5mg 148±47CLP6 + 戊二醛(40μL)600 mg/mL 10μL2.5N 24mg/2.5mg 306±98CLP6 + 戊二醛(20μL)600mg/mL 10μL2.5N 12mg/2.5mg 171±42SELP8K(30μL) +戊二醛600mg/ML1.0N300mg/mL 1.0N300mg/mL(impure) 1.0N300mg/mL(impure) 0.1N287mg/mL 2.5N100mg/L 1.0N100mg/mL 2.5N 18mg/1mg 9mg/1mg 9mg/1mg 9mg/0.1mg 7mg/2.5mg 3mg/1mg 3mg/2.5mg 545±153 452±54 234±51* 210±57* 374±90 361±47 274±17*已知该SELP8K制剂是不纯的并且检测出其粘合力约为更彻底纯的材料的一半。
上表中的数据表明，在和胶原蛋白和卵白蛋白相当的条件下，该目标聚合物在用于戊二醛固化系统中时能提供优越的粘合能力。尽管用于交联的氨基酸数较少，但是在该大鼠皮肤迭合剪切结果中，该SELP8K聚合物提供了最高的抗张力强度。上述结果证明即使戊二醛的剂量低到100μg/cm2也能获得显著的粘合效果。已知该戊二酰的质量和纯度对获得良好的交联效果很重要(Rujigork，Dewijin，Boon，材料科学与材料医学杂志5：80-87(1994))；Whipple，Rata，有机化学杂志，39：1666-1668(1974)。这些实验中使用的戊二醛是经过蒸馏的，并稀释到2.5N，贮存于-20℃直至使用。
在下面的研究中，使用六亚甲基二异氰酸酯。已发现有必要加入相同体积的稀释剂以得到良好的粘合效果，否则固化的太快。结果如下表所示，其中n＝12。
表17：与HMDI有关的粘合系统的迭合抗切张力 试剂 剂量抗张力强度SELP8K 20μL×50％w/wHMDI/L-61 1∶1v/v 2μL×50％v/v缓冲液：(100μL水+10μL1M KHCO3) 10mg 1mg 585±203SELP8K 20μL×50％w/wHMDI/L-61 1∶1v/v 2μL×50％v/v缓冲液：(100μL50mM PO4(pH6.8)+5μL 1M KHCO3) 10mg 1mg 503±21SELP8K 20μL×50％w/wHMDI/L-61 1∶1v/v 2μL×50％v/v缓冲液：(100μL50mMPO4(pH68)+10μL1MKHCO3) 10mg 1mg 451±67 SELP8K 20μL×50％w/wHMDI/L-61 1∶1v/v 2μL×50％v/v缓冲液：(100μL50mMPO4(pH6.8)) 10mg 1mg 362±71
实施例5评价SELPOK(SEOK)和SELPOK-CS1的特性
用不同配方组成制备一系列配方并测定其迭合抗切强度。此外，还用一系列方案以制备提供粘合性的蛋白质胶状物。这些方案如下：方案A SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氧化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 131∶1制备蛋白质胶状物
该1∶2是指衍生于赖氨酸的氨基相对于衍生于SEDK的氨基的标称比率。该1∶1是指来源于SEOK和赖氨酸的每个氨基的碳酸根离子的标称比率。而该131∶1则是指异氰酸酯基对来源于SEOK和赖氨酸的胺基的标称比率。
将赖氨酸氢氯化物0.0157克，碳酸钾0.0710克，以及伊文思蓝染料0.00371克溶于7.526ml的去离子水中从而制备出贮备缓冲液。加入620.6μl的贮备缓冲液到置于Eppendorf管的127.1mg的SEOK中。涡旋混合该混合物直至得到均一的溶液。在5000rpm下离心该溶液30-60秒以除去气泡。然后，将该溶液吸入1ml的注射器中以便涂布到试验皮肤上。优选的包在蛋白胶状物中染料是用于更方便地观察该胶状物在试验皮肤上的分布。制备HMDI凝结剂
将1.75mg的苏丹红染料溶于纯净的1.00克的1，6-二异氰酸己烷中以制备该HMDI凝结剂。选择性地将染料包埋在该蛋白胶状物中是为更方便地观察该凝结剂在试验皮肤上的分布。大鼠皮肤的制备
将新鲜采集的大鼠皮冻存于-20℃。使用前解冻并切成1em×3em的带状。用剃刀除去皮条上的所有筋膜。选择具有相同的宽度和厚度和皮条。将所制的小鼠皮样品置于浸有PBS的消毒垫中并包上防干燥的塑料袋，暂时贮存于37℃。粘合剂的应用
在-37℃的温室中，在两块小鼠皮条带的每一块施用15μl的蛋白胶状物，共30μl，并用不锈钢刮铲将其切成大约1cm2/块皮肤。将总量为1.8μl的HMDI凝结剂均匀地施用到皮肤上从而使3个平行的HMDI条带施用到第一块皮肤而两个成X型的条带施用到第二块皮肤上。将这些皮肤立即进行迭合连接，盖以塑料膜以防干燥，并压上100克的重量。将该连接皮在37℃下15分钟固化。在用Instron Model 55检测仪进行张力试验前，用尺测量该迭合连接皮的长度和宽度并准确到1mm。将十字头的速度设为25mm/分钟。该迭合抗切能力试验的结果以g/cm2的单位报告。计算出至少为一式3份的测试的平均和标准偏差。方案B SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了用两个阶段工序除去该蛋白质胶状物中的气泡外，其它步骤如方案A。离心后，将该胶状物置于减压(26Hg)装置中30分钟。应用于迭合连接皮的HMDI凝结剂的体积是2.0μ1。方案C SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了改变了HMDI凝结剂结合物外，其余步骤如方案B。在100℃下加热10分钟，将5.2mg的苏丹红染料溶于10.735克纯净的Pluronic表面活性剂L-31中。冷却至室温后，加入同样重量的1，6-二氰酸乙烷到该混合物中。该混合物在使用前制备。方案D1 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将4.75mg的Pluronic表面活性剂L-31加入到74.6mg的SEOK中外，其它步骤如方案B。该SEOK对赖氨酸缓冲液的比率也如方案B中所述。方案D2 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将1.07mg的Pluronic表面活性剂L-31加入到74.7mg的SEOK中外，其余步骤同方案B。该SEOK对赖氨酸缓冲液的比率如方案B所述。方案E SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了将5.1mg Pluronic L-31加入到85.0mg的SEOK中外，其余的步骤如方案B。还改变了该HMDI凝结剂组合物。在100℃下加热10分钟，将5.2mg的苏丹红溶于10.735克纯净的Pluronis表面活性剂L-31中。冷却至室温后，加入等量的1，6-二氰酸己烷到该混合物中。该混合物在使用前制备。方案F SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了通过将0.46克赖氨酸氢氯化物，1.24克硼酸溶于92.2ml的去离子水而制备贮备缓冲液外，其余步骤如方案B。用7.8ml 2N的氢氧化钠溶液将该溶液的pH调整到9.52。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲液中，并将该溶液0.45μm的注射管滤器过滤。将333.5μl的贮存缓冲液加入到置于Eppendorf管中的68.3mg的SEOK中。涡旋该混和物直至其彻底溶液化。方案G SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钾 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将0.46克赖氨酸氢氯化物，和1.24克硼酸溶于99.1ml的去离子水中而制备贮备缓冲液外，其余步骤同方案B。加入0.9ml 10N的氢氧化钾溶液将该溶液的pH调整到9.52。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲液中并通过0.45微米的注射管滤器过滤。将367.2μl的贮备缓冲液加入置于Eppendorf管中的75.2mg的SEOK中。在涡旋仪上振荡该混合物直至其彻底溶液化。方案H SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸锂 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将42.7mg的赖氨酸氢氯化物溶于10.0ml的去离子水，并加入14.3mg的碳酸锂使得pH为9.55外，其余步骤如方案B。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲液中，并通过0.45μm的注射管滤器过滤。方案I SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将1.06克碳酸钠和0.46克赖氨酸氢氯化物溶于99.2ml的去离子水外，其余步骤如方案B。用0.8ml浓盐酸将该溶液的pH调整为9.54。将伊文思蓝以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲溶液，并通过0.45微米的注射管滤器过滤。方案J SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将1.38克碳酸钾和0.46克赖氨酸氢氯化物溶于99.1ml的去离子水中而制备贮备缓冲液外，其余步骤如方案B。用0.9ml的浓度盐酸将该溶液的pH调整到9.53。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲液，并通过0.45μm的注射管滤器过滤。方案K SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸铯 pH9.5
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将42.7mg的赖氨酸氢氯化物溶于10.0ml的去离子水中并加入55.2mg的碳酸铯而使其pH为9.52而制备贮备缓冲液外，其余步骤同方案B。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于该缓冲液并通过0.45μm的注射滤器过滤。方案L SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钙 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将20.8mg的赖氨酸氢氯化物溶于10.0ml去离子水并加入68.6mg碳酸钙而制备该贮备缓冲液外，其余步骤如方案B。将伊文思蓝染料以0.50mg/ml的浓度溶于此缓冲液中，并通过0.45μm的注射管滤器过滤。方案M SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 pH9.0
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将103.9mg的赖氨酸氢氯化物溶于50.0ml的去离子水并加入473.3mg的碳酸钾而制备该贮备缓冲液外，其余步骤如方案B。用浓盐酸将该缓冲液的pH调为9.00。方案N1 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
碘根∶碳酸根 1∶2
除了将碘化钾以5.70mg/ml的浓度加入到该贮备缓冲液中外，其余步骤同方案B。该胶状物的标称pH为大约11。方案N2 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 pH9.0
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
碘根∶碳酸根 1∶2
除了将碘化钾以5.70mg/ml的浓度加入到该贮备缓冲液外，其余步骤如方案B。方案O1 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
葡萄糖 1.09M
除了将1.2755克葡萄糖加入到6.495ml的该贮备缓冲液中外，其余步骤如方案B。该溶液的pH为10.5。方案O2 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 pH9.0
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
葡萄糖 1.09M
除了加入1.2755克葡萄糖到6.495ml的该贮备缓冲液中外，其余步骤如方案B。用浓盐酸将该缓冲液的pH调为9.00。方案P1 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
尿素 1.5M
除了将0.5226克的尿素加入到5.087ml的贮备缓冲液(标称1.5M)外，其余步骤同方案B。方案P2 SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 pH9.00
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
尿素 1.5M
除了将0.5226克尿素加入到5.807ml的贮备缓冲液外，其余步骤同方案B。用浓盐酸将该缓冲液pH调为9.00。方案Q SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 7.3
除了将该HMDI凝结剂的体积减为1.0μl外，其它步骤如方案B。方案R SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 6.7；6.5；6.1∶1
除了该HMDI凝结剂用甲苯以1∶1w/w，1∶3w/w，或1∶5w/w稀释外，其余步骤如方案B。施用于迭合连接处的浓HMDI凝结剂的体积分别是2μl，4μl，或6μl。方案S SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 6.1；5.7；5.6∶1
除了将该HMDI凝结剂用甲基环己烷以1∶1w/w，1∶3w/w，或1∶5W/W稀释外，其余步骤同方案B，而施用于迭合连接处的稀HMDI凝结剂体积分别是2μl，4μl，或者6μl。方案T SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 8.5；9.4；9.7∶1
除了用氯仿以1∶1w/w，1∶3w/w，或1∶5w/w稀释该HMDI凝结剂，其余步骤同方案B。而施用于迭合连接稀HMDI凝结剂的体积分别为2μl，4μl，或6μl。方案U SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 8.0；8.7；7.8∶1
除了用二氯甲烷以1∶1w/w，1∶3w/w，或1∶5w/w稀释该HMDI凝结剂外，其余步骤如方案B。施用于迭合连接处的稀MDI凝结剂的体积分别为2μl，4μl，或6μl。方案V1 SEOK 33％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶1
碳酸钾 3∶2
异氰酸酯∶胺 5.0∶1蛋白质胶状物的制备
将赖氨酸氢氯化物(9.14mg/m1)，碳酸钾(41.6mg/ml)，和伊文思染料(0.50mg/ml)溶于去离子水中制备贮备缓冲液。使用前通过玻璃纤维塞过滤该混合物。将113.9mg SE8K，和227.8mg的贮备缓冲液置于Eppenborf管中在涡旋仪上振荡直至溶解。以5000rpm离心30秒除去该溶液中的气泡。然后，将该蛋白胶状物吸入1.00ml的注射器并在涂布于试验标本的迭合连接处前置于室温中20分钟。制备HMDI凝结剂
通过将3.75mg的苏丹红染料溶于Pluronic表面活性剂L-61，并加入等量的1，6-二异氰酸己烷而制备该HMDI凝结剂。制备大鼠皮肤
将新收获的大鼠皮于-20℃下冻存。在使用前融化并切成1cm×3cm的条带。选择那些宽度和厚度相同的皮条带并去除巯松的筋膜和肌肉组织。将这些鼠皮标本在使用前置于浸有PBS的无菌衬垫间，包上塑料袋以防干燥，暂时贮存于37℃。粘合剂的应用
在鼠皮的一端施用35μl的蛋白胶状物并用切成大约1cm2的小块(用不锈钢刮刀将5-10次)。用不锈钢刮刀将过量的蛋白胶状物转移到第二块大鼠皮上并类似地处理。按比例将总量为3.8μl的HMDI凝结剂施用于该皮肤从而在第一块皮上有三个平行的HMDI条带。立即将该皮肤用于形成迭合连接，彼此摩擦以分散该HMDI凝结剂，用一块塑料膜覆盖以防干燥，并压上100克的重量。让该连接在37℃下固化15分钟。在于Instron Model55检测仪上进行张力测试前用尺测量该迭合连接的长度和宽度(准确到1mm)。将十字头速度设置为25mm/分钟。迭合抗切张力以g/cm2的单位报告。计算出至少为一式三份的试验结果的平均值和标准差。方案V2 SE8K 33％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
碳酸钾 3∶2
异氰酸酯∶胺 5.0∶1
除了将赖氨酸氢氯化物(4.59mg/ml)，碳酸钾(31.2mg/ml)，和伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备贮备缓冲液外，其它沿用方案V1的方法。方案V3 SE8K 33％w/w
赖氨酸氢氯化物 0∶2
碳酸钾 3∶2
异氰酸酯∶胺 5.0∶1
除了将碳酸钾(13.83mg/ml)，和伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备贮备缓冲液外，其它沿用方案V1的方法。方案W1 SEOK 17％w/w
精氨酸 1∶4
碳酸钾 1.2∶1
异氰酸酯∶胺 13.1∶1
除了将精氨酸(2.4mg/ml)，碳酸钾(9.46mg/ml)，和伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶解于去离子水而制备该缓冲液外，其沿用方案A的方法。所用于迭合连接处的HMDI凝结剂的体积是2.0μl。假设只有精氨酸的α氨基参加了凝结反应化学计量。方案W2 SEOK 17％w/w
半胱氨酸 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 13.1∶1
除了将半胱氨酸(1.38mg/ml)，和碳酸钾(9.46mg/ml)，及伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案A的方法。用于迭合连接的HMDI凝结剂的体积为2.0μl。方案W3 SEOK 17％w/w
酪氨酸 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 13.1∶1
除了将酪氨酸(2.07mg/ml)，和碳酸钾(9.46mg/ml)，及伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案A的方法。所用于迭合连接的HMDI凝结剂的体积为2.0μl。方案W4 SEOK 17％w/w
1，3-BDSA 1∶2
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 13.1∶1
除了将1，3-苯二磺酸二钠盐-水合物(1，3-BDSA)(3.79mg(mg/ml)，和碳酸钾(9.46mg/ml)，及伊文思蓝梁料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案A的方法。施用于该迭合连接处的HMDI凝结剂的体积为2.0μl。方案X SEOK 17％w/w
肽RGRGRGKGKGK 1∶2(序列35)
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将合成肽RGRGRGKGKGK(序列35)(4.4mg/ml)，碳酸钾(9.46mg/ml)，和伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案A的方法。方案Y SEOK 17％w/w
赖氨酸胆碱酯 1∶4
碳酸钾 1.12∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了将赖氨酸胆碱酯(29.2mg)，碳酸钾(123.9mg)，和伊文思蓝染料溶于13.09ml的去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案B的方法。将该缓冲液在使用前通过0.45μm的注射器滤膜过滤。该蛋白胶状物是通过将SEOK(63.5mg)溶于310.0μl的缓冲液而制备的。方案Z SEOK 17％w/w
AEGly 1∶4
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 14.5∶1
除了用甘氨酸2-氨基乙酯，AEGly(见于实施例1，二胺合成)制备该缓冲液外，其它沿用方案B的方法。将一等份甘氨酸2-氨基乙酯试样(28.9mg，236mg/ml)，以及碳酸钾(48.6mg)溶于5.127ml水中。加入2.20mg伊文思蓝染料，并将该溶液通过0.45μm的注射滤器过滤。方案AA SE8K 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶1
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 12.0∶1
除了将赖氨酸氢氯化物(3.73mg/ml)，碳酸钾(11.33mg/ml)，和伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案VI的方法。Pluronic表面活性剂L-61不能加入该HMDI凝结剂。所用的蛋白质聚合物是SE8K。用于该连接处的凝结剂体积是2.0μl。方案AB SEOK-CS1 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 0.94∶2
碳酸钾 0.96∶1
异氰酸酯∶胺 16.4∶1
除了将赖氨酸氢氯化物(1.84mg/ml)，碳酸钾(8.37mg/ml)，以及伊文思蓝染料(0.50mg/ml)溶于去离子水而制备该缓冲液外，其它沿用方案A的方法。所用的蛋白聚合物是SEOK-CS1。用于该连接的凝结剂体积为2.0μl。方案AC SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了施用于该迭合连接处的HMDI凝结剂体积为1.0μl外，其它沿用方案F步骤。方案AD SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了用环己烷按1∶1v/v，1∶3v/v，或1∶5v/v稀释该HMDI凝结剂外，其它沿用方案F步骤。施用于该迭合连接处的稀HMDI凝结剂体积分别为2μl，4μl，或6μl。方案AE SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了1，1，1-三氯乙烷按1∶1v/v，1∶3v/v，或1∶5v/v稀释该HMDI凝结剂外，其它沿用方案F的步骤。施用于该迭合连接处的稀HMDI凝结剂体积分别为2μl，4μl，或6μl。方案AF SEOK 17％w/w
赖氨酸氢氯化物 1∶2
硼酸钠 pH9.5
异氰酸酯∶胺 7.3∶1
除了用乙酸乙酯按1∶1v/v，1∶3v/v，1∶5v/v，或1∶9v/v稀释该HMDI凝结剂外，其它沿用方法F步骤。施用于该迭合连接处的稀HMDI凝结剂的体积分别为2μl，4μl，6μl，或者10μl。方案AG SEOK-CS1 17％w/w
1，3-PG 0.39∶2
碳酸钾 0.496∶1
碳酸氢钾 0.496∶1
异氰酸酯∶胺 2.5∶1
沿用方案B的方法，稍作如下改动。蛋白胶状物的制备
将81.6mg蛋白聚合物SEOK-CS1加入到331μl的置于Eppendorf管的去离子水中并在涡旋混合仪上振摇直止溶解。在此溶液中加入11.43μl的二甘氨酸1，3-丙二酯(1，3-PG)的水溶液(10％w/w)；14.73μl的碳酸钾水溶液(10％w/w)；以及9.43μl的碳酸氢钾水溶液(10％，w/w)。将该内容物于涡旋混合仪上振摇直至均匀。将该溶液以大约5000rpm离心30-60秒以排气泡，然后将该胶状物置于减压力(26英寸Hg)下30分钟。HMDI凝结剂的制备
将纯净的1，6-二异氰酸己烷(100mg)，和苏丹红染料(2.4mg)溶于1-氯-2，2，2-三氟乙基二氟甲醚(2.342g)中。施用于该迭合连接处的稀HMDI凝结剂的体积是4μl。方案AH SEOK 17％w/w
赖氨酸 0∶1
碳酸钾 1∶1
异氰酸酯∶胺 5.0∶1蛋白胶状物的制备
将蛋白聚合物SEOK以17％w/w溶于10毫摩尔的乳酸水溶液(0.90mg/ml)中制备蛋白胶状物。用宽范围的pH试纸测该蛋白胶状物的pH约为3.5。将1.66克碳酸钾溶于10ml的去离子水制备促进固化的溶液。制备HMDI凝结剂
将1，6-二异氰酸己烷(5.04g)，Pluronic表面活性剂F-127(0.0033g)，和苏丹红染料(0.0020g)溶于氯仿(2.24g)制备HMDI凝结剂。大鼠皮的制备
将新采集的大鼠皮冻存于-20℃。在使用前融化并切成1cm×3cm的条带。用剃刀除去皮条上上的筋膜。选择那些宽度和厚度相同的皮条带。将所制鼠皮标本置于浸有PBS的无菌衬垫间并包上防干燥塑料袋暂时存于37℃。粘合剂的使用
在37℃的温室中，将皮条置于玻璃平皿上。用不锈钢刮刀在每两块皮的末端的大约1cm2的表面上涂上1.0μl的HMDI凝结剂，共2.0μl。将2.0μl碳酸钾固化液分成六滴，在每两块皮中的一块加入了滴并立即进行迭合连接。在连接处压上100克的重量，再将其置于37℃下15分钟让粘合剂固化。
将该迭合连接在Instron能力测试仪上如下文所述检测其可靠性。
第一个试验使用表面活性剂PluronicL-31。
表18：表面活性剂Pluronic L-31的作用SEOK胶状物K2CO3 L-Lys HMDI+Pluronic 迭合抗切 强度g/cm2方案 1SEOK17％w/w 1∶1 1∶2 无 2143± 328 A 2SEOK17％w/w(驱除气体) 1∶1 1∶2 无 2901± 685 B 3SEOK17％w/w(驱除气体) 1∶1 1∶2 HMDI/L-31 1∶1 (3.3％w/w相对 于总胶状物) 1248± 370 C 4SEOK 17％w/w(驱除气体)+L-31(1.04％w/w相对于总胶状物) 1∶1 1∶2 无 745±209 D1 5SEOK 17％w/w(驱除气体)+L-31(0.24％w/w相对于总胶状物)(1.4％w/w wrt SEOK) 1∶1 1∶2 无 1499± 159 D2 6SEOK 17％w/w(驱除气体)+L-31(0.17％w/w相对于总胶状物)(1.0％w/w wrt SEOK) 1∶1 1∶2 HMDI/L-31 1∶1 (3.3％相对于总 胶状物) 677±284 E
在下一个试验中，使用各种缓冲液连用赖氨酸作为多官能团。
表19
使用在各种PH9.5的缓冲液中的17％SELPOK(SEOK)的粘合效果 缓冲液 抗切强度 g/cm2 CV ％ 方案 1Na3BO3/L-Lys(1∶2)* 2360±475 20％ F 2K3BO3/L-Lys(1∶2) 2037±338 17％ G 3 Li2CO3/L-Lys(1∶2) 188±38 20％ H 4 Na2CO3/L-Lys(1∶2) 1168±274 23％ I 5 K2CO3/L-Lys(1∶2) 2393±631 26％ J 6Cs2CO3/L-Lys(1∶2) 233±56 24％ K 7 CaCO3/L-Lys(1∶2) 88±2 2％ L
*衍生于赖氨酸的氨基相对于衍生于SEDK的氨基的摩尔比SELPOK
在下一个试验，将各种无化学反应性和有化学反应性的添加剂加入到配方中以测定该添加剂对抗切强度的影响。
表20使用带有添加剂的溶于碳酸盐缓冲液中的17％的SELPOK的粘合效果 缓冲液 pH 抗切强度 g/cm2 CV 方案 1 K2CO3(2∶2)/L-Lys(1∶2) 无添加剂 10.5 9.0 2901±685 1618±293 24％ 18％ B M 2K2CO3(2∶2)/L-Lys(1∶2)加KI(0.043Mole/L) 11 9.0 2538±441 826±211 17％ 26％ N1 N2 3K2CO3(2∶2)/L-Lys(1∶2)加葡萄糖(1.09 Mole/L) 10.5 9.0 1896±557 1398±358 29％ 26％ O1 O2 4K2CO3(2∶2)/L-Lys(1∶2加尿素(1.50Mole/L) 11 9.0 2674±846 239±38 32％ 16％ P1 P2
在下列试验中，使用了各种有机溶剂，其中的交联剂在和蛋白质的缓冲水溶液混合前溶于该溶剂。
表21 使用HMDI加挥发性稀释剂和溶于赖氨酸-硼酸缓冲液(pH9.5)的粘合效果 稀释剂 沸点 稀释比例 [v/v] 凝结剂 体积 抗切强度 g/cm2 CV ％ 方案1 无 未测 1∶0 1μL 852±173 20％ AC2 环己烷 81° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μl 900 953 1053 未测 AD3 1，1，1-三氯乙烷 75° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μL 781±13 943±119 816±51 2％ 13％ 6％ AE4 乙酸乙酯 77° 1∶1 1∶3 1∶5 1∶9 2μL 4μL 6μL 10μL 869±41 741±296 685±147 658±131 5％ 40％ 21％ 20％ AF
表22 使用HMDI加挥发性稀释剂和溶于赖氨酸-碳酸缓冲液(pH10)的粘合效果 稀释剂 沸点 比例 [w/w]凝结剂体积 抗切强度 g/cm2 CV ％方案 1 无 未测 1∶0 1μL 2713±234 6％ Q 2 甲苯 110° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μL 2303±502 2295±210 1178±282 22％ 9％ 24％ R 3 甲基环己烷 101° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μL 2508±234 2160±111 1364±395 9％ 5％ 29％ S 4 氯仿 61° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μL 2075±370 2836±620 1493±223 18％ 22％ 15％ T 5 二氯甲烷 40° 1∶1 1∶3 1∶5 2μL 4μL 6μL 2389±542 2636±504 2511±493 23％ 19％ 20％ U
在下列试验中，使用了带有各种有官能度的不同的多功能剂以交联聚合体，其中的官能度是对称的或非对称的而带有不同的官能团侧链的插入链是脂肪族的或芳香族的。有时，用于交联的多功能是水解不稳定的，其在连接中带有一个水解敏感键。
表23 带有不同的多官能剂的SELP8K，SELPOK或者SELPOK-CS1的粘合效果蛋白质积缓冲液比例*多官能剂抗切强度g/cm2方案SE8K 33％w/wK2CO3 3∶22∶21∶20∶2赖氨酸1328±2031212±2411161±383V1V2V3SE0K 17％w/wK2CO3 1∶11∶2赖氨酸精氨酸半胱氨酸酪氨酸3，5-二磺酸儿茶酚酪2143±3281176±748741±66622±339399AW1W2W3W4SE0K 17％w/wK2CO3 1∶11∶2肽RGRGRGKGKGK850±184XSE0K 17％w/wK2CO3 1∶11∶2赖氨酸2901±685BSE0K 17％w/wK2CO3 1∶11∶4赖氨酸胆碱酯2385±502YSE0K 17％w/wK2CO3 1.12∶11∶4甘氨酸2-氨基乙酯N，O-二甘氨酰乙醇胺的4∶1混合物的硫酸盐 3269±422ZSE0K-CS1 17％w/wK2CO3 1∶11∶2赖氨酸2196±275ABSE0K-CS1 17％w/wK2CO3 1∶10.77∶2二甘氨酸1，3-丙二酯3028±392AG
*所加入的亲核基因对蛋白质骨架有效氨基的比例。
在表24中，比较了含有SELP8K，SELPOK，SELPOK-CS1的各种配方。
表24 SELP8K，SELP0K知SELP0K-CS1的粘合效果 聚合物K2CO3对胺的比率胺比例* 抗切强度 g/cm2 CV ％方案SE8K 17％w/w 1∶1 2∶2 2854±1027 36％AASE0K 17％w/w 1∶1 1∶2 2143±328 15％ASE0K 17％w/w 10mM乳酸水溶液 1∶1 0∶2 532±207 39％AHSE0K-CS1 17％w/w 1∶1 1∶2 2196±275 13％AB
*来源于赖氨酸的胺基对来源于蛋白质的胺基的比率。
从上述结果中显而易见的是本发明提供了一个组合物，其能迅速地产生具有广谱的特征的组分。该目标组合物能提供具有良好的抗切强度的强烈的粘合组分，其抗切强度在短时间内即可出现。本发明还能提供用于填充组织缺陷或空调的或者用于扩张组织的组合物。因此，本发明的蛋白聚合物能用作组织粘合剂，其能产生出能长期维持强度的且能重吸收的生理适应性的组合物，以及作为密封剂，或其它用途。
在本说明书中提及的出版物和专利申请都以和它们单独被引用相同的程度以参考文献的形式并入本发明。
现已充分描述了本发明，对本领域的普通技术人员来说，显而易见地是可以在不脱离附带的权利要求书的精神或范围的前提下对本发明作出许多改变和改进。
序列表(1)一般资料 (i)申请人：STEDRONSKY，Erwin R
CAPPELLO，Joseph (ii)发明名称：利用合成交联剂的组织粘合剂 (iii)序列数：35 (iv)通信地址：
(A)收件人：FLEHR，HOHBACH，TEST，ALBRITTON和HERBERT
(B)街道：Four Embarcadero Center，Suite200
(C)城市：San Francisco
(D)洲：CA
(E)国家：美国
(F)邮编：94111 (v)计算机可读形式
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBMPC兼容
(C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS
(D)软件：PatenIn Release，#1.0，Version#1.30 (vi)当前申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号： (viii)律师/代理人资料
(A)姓名：ROWLAND，Bertram I
(B)注册号：20015
(C)资料/档案号：A61127-1/BIR (ix)电信信息：
(A)电话：415-781-1989
(B)电传：415-398-3249(2)序列1资料： (i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：序列1
Gly Ala Gly Ala Gly Ser(2)序列2资料： (i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：序列2
Gly Val Gly Val Pro
1 5(2)序列3资料： (i)序列特征：
(A)长度：7个AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：序列3
Ala Lys Leu Xaa Leu Ala Glu
1 5(2)序列4资料： (i)序列特征：
(A)长度：64AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：序列4Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
20 25 30Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
35 40 45Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
50 55 60(2)序列5资料： (i)序列特征：
(A)长度：64个AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：序列5Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
20 25 30Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val
35 40 45Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
50 55 60(2)序列6资料： (i)序列特征：
(A)长度：31bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：序列6(2)序列7资料：
(i)序列特征：
(A)长度：35bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列7
ACTCGGATGT ACATGCAGGC ACCCGCTCCA GAGCC 35(2)序列8资料：
(i)序列特征：
(A)长度：192bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列8GGTGCCGGTT CTGGAGCTGG CGCGGGCTCT GGAGTAGGTG TGCCAGGTGT AGGAGTTCCG 60GGTGTAGGCG TTCCGGGAGT TGGTGTACCT GGAGTGGGTG TTCCAGGCGT AGGTGTGCCC 120GGGGTAGGAG TACCAGGGGT AGGCGTGCCT GGAGCGGGTG CTGGTAGCGG CGCAGGCGCG 180GGCTCTGGAG CG 192(2)序列9资料：
(i)序列特征：
(A)长度：65AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列9Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Gly Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
20 25 30Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
35 40 45Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
50 60Ala65(2)序列10资料：
(i)序列特征：
(A)长度：201bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列10ATGGCAGCGA AAGGGGACCG GGCTCTGGTG TTGGAGTGCC AGGTGTCGGT GTTCCGGGTG 60TAGGCGTTCC GGGAGTTGGT GTACCTGGAA AGGTGTTCCG GGGGTAGGTG TGCCGGGCGT 120TGGAGTACCA GGTGTAGGCG TCCCGGGAGC GGGTGCTGGT AGCGGCGCAG GCGCGGGCTC 180TTTCCGCTAA AGTCCTGCCG T 201(2)序列11资料：
(i)序列特征：
(A)长度：35bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列11
AAGAAGGAGA TATCATATGG CAGCGAAAGG GGACC 35(2)序列12资料：
(i)序列特征：
(A)长度：37bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列12
CGCAGATCTT TAAATTACGG CAGGACTTTA GcGGAAA 37(2)序列13资料：
(i)序列特征：
(A)长度：192bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：序列13GGTGCCGGTT CTGGAGCTGG CGCGGGCTCT GGTGTTGGAG TGCCAGGTGT CGGTGTTCCG 60GGTGTAGGCG TTCCGGGAGT TGGTGTACCT GGAAAAGGTG TTCCGGGGGT AGGTGTGCCG 120GGCGTTGGAG TACCAGGTGT AGGCGTCCCG GGAGCGGGTG CTGGTAGCGG CGCAGGCGCG 180 GGCTCTGGAG CG 192(2)序列14资料：
(i)序列特征：
(A)长度：64AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列14Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys
20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
35 40 45Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala
50 55 60(2)序列15资料：
(i)序列特征：
(A)长度：884AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列15Met Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val 1 5 10 15Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Asp Pro
20 25 30Met Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
35 40 45Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
50 55 60Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val65 70 75 80Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
100 105 110Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
115 120 125Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
130 135 140Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly145 150 155 160Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
165 170 175Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
180 185 190Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
195 200 205Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
210 215 220Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro225 230 235 240Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
245 250 255Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
260 265 270Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
275 280 285Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
290 295 300Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Va1 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly305 310 315 320Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
325 330 335Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
340 345 350Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
355 360 365Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
370 375 380Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val385 390 395 400
Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
405 410 415Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
420 425 430Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
435 440 445Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
450 455 460Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly465 470 475 480Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
485 490 495Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
500 505 510Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
515 520 525Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
530 535 540Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro545 550 555 560Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
S65 570 575Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
580 585 590Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
595 600 605Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
610 615 620Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly625 630 635 640Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
645 650 655Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
660 665 670Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
675 680 685Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
690 695 700Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val705 710 715 720Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
725 730 735Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
740 745 750Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
755 760 765Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
770 775 780Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly785 790 795 800Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro
805 810 815Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
820 825 830Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
835 840 845Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
850 855 860Ala Gly Ala Met Asp Pro Gly Arg Tyr Gln Asp Leu Arg Ser His His865 870 875 880His His His His(2)序列16资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1065AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列16Met Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val1 5 10 15Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Asp Pro
20 25 30Met Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala
35 40 45Gly Pro Lys Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly
50 55 60Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala65 70 75 80Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly
85 90 95Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
100 105 110Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro
115 120 125Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln
130 135 140Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly145 150 155 160Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro
165 170 175Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala
180 185 190Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly
195 200 205Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala
210 215 220Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly225 230 235 240Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
245 250 255Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala His Gly Pro
260 265 270Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His
275 280 285Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly
290 295 300Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro305 310 315 320Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala
325 330 335Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly
340 345 350Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala
355 360 365Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly
370 375 380Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly385 390 395 400Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro
405 410 415Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln
420 425 430Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly
435 440 445Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro
450 455 460Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala465 470 475 480Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly
485 490 495Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala
500 505 510Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys
515 520 525Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly
530 535 540Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala Gln Gly Pro545 550 555 560Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln
565 570 575Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly
580 585 590Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro
595 600 605Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala
610 615 620Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly625 630 635 640Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala
645 650 655Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly
660 665 670Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
675 680 685Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro
690 695 700Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln705 710 715 720Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly
725 730 735Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro
740 745 750Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala
755 760 765Gly Pro Gly Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly
770 775 780Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala785 790 795 800His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly
805 810 815Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
820 825 830Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro
835 840 845Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln
850 855 860Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly865 870 875 880Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro
885 890 895Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala
900 905 910Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly
915 920 925Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala
930 935 940Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly945 950 955 960Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
965 970 975Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro
980 985 990Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln
995 1000 1005Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly
1010 1015 1020Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro1025 1030 1035 1040Lys Gly Ala Met Asp Pro Gly Arg Tyr Gln Leu Ser Ala Gly Arg Tyr
1045 1050 1055His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Cys Lys
1060 1065(2)序列17资料：
(i)序列特征：
(A)长度：4AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列17
Pro Leu Gly Pro
l (2)序列18资料：
(i)序列特征：
(A)长度：22AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列18
Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Leu Gly Pro Leu Gly
l 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro
20(2)序列19资料：
(i)序列特征：
(A)长度：24AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列19
Gly Ala Gly Ala Gly ser Gly Val Gly Val Pro Gly Phe Phe Val Arg
1 5 10 15
Ala Arg Arg Gly Val Gly Val Pro
20(2)序列20资料：
(i)序列特征：
(A)长度：32bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“合成的”
(xi)序列描述：序列20 GATCTTCGAT CTCATCACCA TCACCATCAC TA 32(2)序列21资料：
(i)序列特征：
(A)长度：32bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“合成的”
(xi)序列描述：序列21TGCTTAGTGA TGGTGATGGT GATGAGATCG AA 32(2)序列22资料：
(i)序列特征：
(A)长度：93bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“合成的”
(xi)序列描述：序列22ATGGCAGCGA AAGGGGACCG GTGCCGGCGC AGGTAGCGGA GCCGGTGCGG GCTCAAAAAG 60GGCTCTGGTG CCTTTCCGCT AAAGTCCTGC CGT 93(2)序列23资料：
(i)序列特征：
(A)长度：162bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“合成的”
(xi)序列描述：序列23GGGCTCTGGT GTTGGAGTGc CAGGTGTCGG TGTTCCGGGT GTAGGCGTTC CGGGAGTTGG 60TGTACCTGGA AAAGGTGTTC CGGGGGTAGG TGTGCCGGGC GTTGGAGTAC CAGGTGTAGG 120CGTCCCGGGA GCGGGTGCTG GTAGCGGCGC AGGCGCGGGC TC 162(2)序列24资料：
(i)序列特征：
(A)长度：54AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：序列24Gly ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Vall 5 l0 15Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val pro Gly Val Gly Val pro
20 25 30Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser
35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser
50(2)序列25资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1002AA
(B)类型：AA
(C)链型：单
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列25Met Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val1 5 10 15Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Asp Pro
20 25 30Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly
35 40 45Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
50 55 60Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro65 70 75 80Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
85 90 95Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
100 105 110Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
115 120 125Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
130 135 140
Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly145 150 155 160Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
165 170 175Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
180 185 190Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val
195 200 205Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly
210 215 220Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val225 230 235 240Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly
245 250 255Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
260 265 270Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
275 280 285Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
290 295 300Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro305 310 315 320Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
325 330 335Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
340 345 350Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
355 360 365Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
370 375 380Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly385 390 395 400Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val
405 410 415Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly
420 425 430Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
435 440 445Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly
450 455 460Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val465 470 475 480Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
485 490 495Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
500 505 510Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
515 520 525Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
530 535 540Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly545 550 555 560Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
565 570 575Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
580 585 590Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
595 600 605Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val
610 615 620Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly625 630 635 640Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
645 650 655Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly
660 665 670Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
675 680 685Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
690 695 700Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly705 710 715 720Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
725 730 735Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
740 745 750Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
755 760 765 Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
770 775 780Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val785 790 795 800Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
805 810 815Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val
820 825 830Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly
835 840 845Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
850 855 860Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly865 870 875 880Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
885 890 895Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
900 905 910Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
915 920 925Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
930 935 940Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly945 950 955 960Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
965 970 975Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Met Asp Pro Gly Arg Tyr Gln
980 985 990Asp Leu Arg Ser His His His His His His
995 1000(2)序列26资料：
(i)序列特征：
(A)长度：378bp
(B)类型：AA
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(B)类型：核酸
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(A)描述：/desc＝“合成的”
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850 855 860Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly865 870 875 880
Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Phe Phe Val Arg Ala
885 890 895Arg Arg Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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