本发明涉及新的在溶液中结合能力低的人胰岛素类似物、制备这种胰岛素类似物的方法、含有本发明人胰岛素类似物的胰岛素制剂和使用这种人胰岛素类似物治疗糖尿病的方法。 自从1922年发现胰岛素以来，已有许多不同种类的胰岛素制剂用于治疗糖尿病。最初仅仅使用快速产生并且较快失去胰岛素活性的胰岛素溶液，但是后来通过加入例如锌盐和/或鱼精蛋白降低胰岛素溶解度，制备了具有广泛活性的胰岛素制剂。由于生物利用度的原因，所用胰岛素通常是从家畜（大多数为牛、猪和羊）胰腺中回收得到的，但是最近含有通过生物技术方法得到的人胰岛素制剂也见诸于市。
人胰岛素的结构图示于下：
B-链（续）
Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH
25 26 27 28 29 30
由某些家畜得到的胰岛素，其结构与人胰岛素非常相似，狗和猪的胰岛素与人胰岛素的区别仅在于在B链的30位上含有Ala，免胰岛素的区别仅在于在同一位置上含有Ser。按Morihara等（Nature 280，1979，412-413）和Marcussen（美国专利US-4343898）所述半合成法，用Thr取代B30氨基酸残基，上述这些胰岛素可转变为人胰岛素。
在生理pH值条件下，溶解这种胰岛素时，在单体、二聚体、四聚体、六聚体的以及甚至多聚体胰岛素之间，就能建立依赖浓度结合的平衡。这种平衡例如可以通过超速离心、渗透压测定或凝胶过滤等方法（参阅R.Valdes Jr.and G.A.Ackers，Methods in Enzymology，Vol.61.Enzyme Structure，Part H.eds.：Hirs & Timasheff，AcademicPress 1979，pp.125-142）予以测定。在一般的胰岛素制剂的配制中，这种平衡以胰岛素向很高程度变动时，即形成六聚体。
胰岛素分子中的取代目的在于提高胰岛素在治疗糖尿病中地活性。已经公开的国际专利申请No.WO 86/05497公开了通过中性氨基酸残基一次或多次取代胰岛素分子中的Glu就会使胰岛素的沉淀区以注射后迟缓释放的方式发生移动。
此外，业已公开的欧洲专利申请No.EP 214826公开了在注射后被特别迅速地吸收的胰岛素类似物。这种效应是由于在胰岛素分子中，尤其是在B9-B12区和B26-B28位上某些取代抑制了胰岛素的结合趋势，从而使其基本上以单体或二聚体形式存在。但是，许多这种胰岛素类似物都显示其生物活性的降低。
近几年来已经介绍了大量人工制备的人胰岛素类似物，一般都是阐明结构对活性的影响（参阅Marke et al.，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，360，1979，1619-1632）。胰岛素（B22-B26）顺序中的取代对受体结合的影响更具有特殊的意义，例如所述顺序被认为是胰岛素受体结合的基本位点，又如在所述位点上的取代能够发生突变（参阅S.Shoelson et.al.：Biomed.Res.5（3），1984，267-272）。业已发现，取代了phe（B24）或phe（B25）的类似物，其生物活性很低，因此可以断定，这两个氨基酸的存在对受体结合具有决定性的重要意义。
本发明是以下述公认的知识为基础，即不具有（pheB24）或（pheB25）氨基酸残基的某些人胰岛素类似物在溶液中结合趋势较低，同时在体外的生物活性不变或甚至更高于人胰岛素。（PheB24）或（PheB25）的缺失，其作用在于（LysB29）转移到（LysB28）中。在人胰岛素分子的该位置上，正电荷的位置被认为是本发明的重要方面。
因此，就其最重要方面而言，本发明涉及带正电荷氨基酸残基的人胰岛素类似物，所述氨基酸残基就是B28位上的Lys或Arg，即由（GlyB20）起的B链中的第8位。
出乎意料的是本发明的胰岛素类似物具有较低的结合趋势，同时与具有较低结合趋势的其他胰岛素类似物相比，有较高的物理稳定性。通过两种途径即可将正电荷引入B28位上，其途径之一是使人胰岛素分子中的B24、B25、B26、B27或B28位上缺失一个氨基酸残基;其途径之二是用Lys或Arg取代人胰岛素分子中的（ProB28）。如果Arg在B28位上较佳，则在B24、B25、B26、B27或B28位上缺少一个氨基酸残基可与由Arg残基取代原来的（LysB29）结合。
此外，与人胰岛素相比，本发明的人胰岛素类似物在B链的C端上还可含有1个或多个修饰基因。因此，在B25至B27位上的氨基酸残基和（LysB28）或（ArgB28）后的氨基酸残基可在天然存在的氨基酸残基中任意选择，或者缺失B29或B20，或二者可都缺失。
根据本发明之一，（TyrB26）可由另一个不带电荷的氨基酸残基取代，其中侧链（Cγ）上的第2个碳原子被SP2-杂化（具有平面结构的键）。
还有为能使分子对化学降解达到稳定，在A21位上的Asn和/或B3可由另一个氨基酸残基取代。
本发明人胰岛素类似物可以式Ⅰ为特征：
B-链（续）
X1-X2-X3-X4-X5-X6
式中，X1，X2，X3，X5，y1和y2可以是任何天然存在的氨基酸残基，X4是Lys或Arg，X6可以是任何天然存在的带有C端羟基或-OH的氨基酸残基，或X5和X6一起形成C端羟基。
在本发明的一个实施例中，X5选自除Pro外的任何天然存在的氨基酸残基。
在上式Ⅰ中，y1和/或y2在一个实施例中可以选自除Asn外的任何天然存在的氨基酸残基。
在式Ⅰ中，
X1尤指Phe，Ala，His，Thr，Ser，Asn或Tyr，
X2尤指Tyr，Thr，Glu，Asp，Ala，His，Ser或Phe，
X3尤指Pro，Glu，Asp，Ser，Thr或His，
X5尤指Lys，Thr，Ser，Ala，Asp或Glu，
X6尤指Thr-OH，Ser-OH，Ala-OH，Asp-OH，Glu-OH或-OH，
y1可以是Asn，Glu，Asp，His，Ser，Thr，Yal，Leu，Ile，Ala，Met，Trp，Tyr，Gln或Gly，尤以Gly，Asp，Glu或Ala为佳，
y2可以是Asn，Glu，Asp，His，Ser，Thr，Val，Leu，Ile，Ala，Met，Trp，Tyr，Gln或Gly，尤以Glu或Asp为佳。
一组本发明的人胰岛素类似物的特征在于其在B24或B25位上已经缺少一个氨基酸残基，在B26位上可任意由另一个不带电荷的氨基酸残基取代，其中γ位上的碳原子是SP2杂化;在A21，B3和B30位上的任意1个或多个氨基酸残基都不同于人胰岛素相应位置上的氨基酸残基;在B30位上可不存在氨基酸残基。
按更简单的定义，这种类似物是人胰岛素类似物，其中不存在（TyrB26），（PheB25）任意可由另一个在γ位上的碳原子被SP2杂化的不带电荷的氨基酸残基，在A21，B3和B30位上1个或多个氨基酸残基不同于人胰岛素中的氨基酸残基，以及在B30位上的不存在氨基酸残基。
Cγ被SP2杂化的不带电荷的氨基酸残基的例子为Tyr，Phe，His，Trp和Asn。
如果性质基本上不发生变化，则上述人胰岛素类似物还可进一步取代或衍生。这种进一步衍生可以是羧基的酯化或酰胺化、氨基或羟基的酰化或烷基化，也可以羧酰胺基脱酰氨基化。进一步的取代可以是（ThrA8）与His交换或（HisB10）与ASP交换。因此，最好在B链的C端和/或N端能增加或失去1个或几个氨基酸残基。
本发明的一组人胰岛素类似物的结构示于式Ⅱ，其中X是Tyr，His，Phe或Asn，y是Thr，Ser，Ala，Asp或Glu，或缺失并且可任意将划底线的Asn通过脱酰氨基化改变为Asp，或划底线的Asn可以是Gly。
B-链（续）
X-Thr-Pro-Lys-Y-OH
本发明最佳的人胰岛素类似物如下
脱[PheB25]-人胰岛素
脱[TyrB26]-人胰岛素
脱[ThrB27]-人胰岛素
脱[ProB28]-人胰岛素
脱[PheB25]-猪胰岛素
脱[ProB28]-猪胰岛素
脱[ProB28]-兔胰岛素
脱[PheB25]，脱[ThrB30]-人胰岛素
脱[TyrB26]，脱[ThrB30]-人胰岛素
[SerA21]-脱[ProB28]-人胰岛素
[GlyA21]-脱[ProB28]-人胰岛素
[GlyA21]-脱[PheB25]-人胰岛素
[AspA21]-脱[PheB25]-人胰岛素
[HisB25]-脱[TyrB26]，脱[ThrB30]-人胰岛素
[AsnB25]-脱[TyrB26]，脱[ThrB30]-人胰岛素
[AspA21]-脱[PheB25]，脱[ThrB30]-人胰岛素
[AspB28]-脱[PheB25]-人胰岛素
[AspB3]-脱[PheB25]-人胰岛素
[LysB28]-人胰岛素
[LysB28，ThrB29]-人胰岛素
[ArgB28]-脱[LysB29]-人胰岛素
本发明人胰岛素类似物的优点在于可用于治疗糖尿病，而结合能力的降低不仅在正常使用皮下注射后，而且在非经肠道用药，也会导致在血流中比原胰岛素更快地吸收（参阅已经公开的国际专利申请No.Wo87/06137。同时，其物理稳定性的提高也使它们在糖尿病治疗中更具有优越性。
本发明人胰岛素类似物的制备可通过由编码所需氨基酸残基的取代基的密码子置换在天然人胰岛素原基因的适当位置上的密码子替代胰岛素原基因，和/或失去相应的需要缺失的密码子。此外，编码所需胰岛素类似物的整个DNA顺序可以进行合成。然后再将编码所需胰岛素类似物的基因插入到适合的表达载体，该载体在转移到适合的宿主有机体（例如大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母）时，便产生所需产物，并根据所表达的产物是否由细胞分泌，从细胞或培养液分离表达产物。
新的胰岛素类似物也可采用类似于Marki等所介绍的方法（Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，360，1979，1619-1632），由化学合成方法合成。它们的制备还分别由体外制备的含有由适当氨基酸残基取代和缺失的A链和B链，通过形成二硫键将经过修饰的A链和B链连接在一起，该已知方法可参考Chance et al.，In：Rick DH，Gross E（eds）Peptides：Synthesis-Structure-Function（Proceedings of the Seventh American peptide Symposium，Illinois，pp.721-728）。
此外，胰岛素类似物还可通过类似于欧洲专利申请No.0163529A所介绍的方法进行制备，该公开的方法已经结合在本申请中作为参考文献。通过这种方法，人胰岛素类似物在其中B28或B29上（如果最终产物将在该位置上具有碱性氨基酸）的碱性氨基酸通过长度可改变的肽键或肽链与GlyA1连结，并且通过具有正确二硫键位置的酵母表达和分泌，然后采用Morihara方法（Morihara supra）或所谓的转肽反应（参阅美国专利USP No.4343898）转化为所需的人胰岛素类似物。
此外，本发明胰岛素类似物的制备还可将编码所述胰岛素类似物前体的DNA顺序插入到适合的酵母表达载体中，当其转移到酵母中时在适宜的培养基中培养该酵母株，即能表达和分必胰岛素类似物前体，其中的（LysB28）、（ArgB28）、（LysB29）或（ArgB29）通过含式Ⅲ（式中R是含n氨基酸残基的肽链，n是整数0-33，R′是Lys或Arg）的肽键或肽链与GlyA1连接，式Ⅲ如下
然后从培养液中回收该前体，再与含式Ⅳ（式中Q是1个氨基酸残基，尤以Thr为佳，或二肽，R″是羧基保护基，如甲基或叔丁基）的氨基化合物反应，该反应以类似于美国专利说明书No.4343898（该文作为参考文献结合在本文中）所述方法，用胰蛋白酶或类似胰蛋白酶作为催化剂，在水和有机溶剂的混合物中除去羧基保护基，从反应混合物中分离得到该胰岛素类似物，式Ⅳ如下：
如果胰岛素类似物含有不同于Lys或Arg作为B链的C端残基。则它们也可以采用类似于已经公开的欧洲专利申请No.EP 195691所述方法进行制备（该文已作为参考文献结合在本文中）。采用该方法，在由一对碱性氨基酸（Lys，Arg）组成的A链和B链之间具有桥键的胰岛素类似物前体是在酵母中合成的，然后再用酶转化方法，转化为胰岛素类似物。
如果B链的C端氨基酸残基是Lys或Arg，则可采用胰蛋白酶进行酶解，由上述生物合成的前体制备胰岛素类似物。
取代仅在最靠近B链C端最后的氨基酸残基中的本发明人胰岛素类似物，采用已知方法，例如由猪胰岛素制备（如K.Inoye et al.;JACS，101（3），1979，751-752所述方法），即先用胰蛋白酶将猪胰岛素断裂为脱-（B23-30）-人胰岛素，即用酶方法将脱-（B23-30）-人胰岛素与具有所需氨基酸顺序的合成肽偶合。
本发明胰岛素类似物可用于制备具有胰岛素活性的新的胰岛素制剂，以取代已知技术中的人或猪胰岛素的胰岛素制剂。这种新的胰岛素制剂含有本发明的胰岛素类似物或其药物上可接受的盐的水溶液或悬浮液，尤以中性pH值为佳。水介质用例如氯化钠，醋酸钠或丙三醇配制成等渗液。水介质还可含锌离子、缓冲液（如乙酸或柠檬酸缓冲液）和防腐剂（如m-甲酚、羟苯甲酸甲酯或酚）。制剂的pH值调至所需值，胰岛素制剂用无菌过滤制成无菌制剂。
本发明胰岛素类似物还可与具有长效胰岛素活性的其他胰岛素类似物混合，制成含有长效和速效胰岛素混合物的胰岛素制剂。
本发明胰岛素制剂可按类似于已知胰岛素制剂的使用方法使用。
氨基酸采用的缩略符号可参照J.Biol.Chem.，243，（1968），3558。氨基酸为L构型，除了另有说明外，本文所指胰岛素均为人胰岛素。
参考附图进一步详述本发明的内容。
图1表示表达质粒pYGABA 14276，
图2表示酵母载体pAB24，
图3表示由质粒pKFN-864得到的0.4kb EcoRI-XbaI片段的DNA顺序，
图4表示表达质粒pKFN-866的制备。
以表达盒为基础构建编码修饰胰岛素前体的DNA顺序，该顺序包含在由表达质粒pYGABA得到的BamHI限制性片段中（见图1所示），长度为1103碱基对，主要含有（从5′端开始依次连续）：GAPDH启动区（Travis et al.，J.Biol.Chem.，260，1985，4384-4389），由野生型酵母DNA顺序编码的MF α1-引导顺序的83个N端氨基酸（按Kurjan & Herskowitz所述），编码Lys和Arg的2个密码子AAA和AGA，胰岛素前体单链脱（ThrB30）人胰岛素（SCI）的编码区，它是优先用酵母密码子合成构建的基因。在2个终止密码子后，确定了SaⅡ限制性位点的位置，顺序的其余部分构成了含有终止区的MF α1-顺序。顺序的构建完全可采用常规技术。
采用的方法是“控制诱发突变的寡核苷酸的位点”。该方法已由Zoller & Smith作过介绍（DNA，Vol.3，No.6，1984，479-488）。下面将会简要介绍该方法，并在实施例1中予以全面介绍。从表达质粒分离得到的胰岛素前体顺序被插入到单链染色体组即环状M13噬菌体载体中。然后将化学合成的互补DNA链对合到单链染色体组。DNA链含有在环形DNA上完全对应于胰岛素顺序的顺序围绕着的所需的顺序。然后用生物化学上的克列诺失聚合酶将引物在体外延伸到环状染色体组的全长。这个链将导致单链噬菌体的产生，当其在大肠杆菌中生长时，就能分离得到含有所谓顺序的双链DNA。由该双链DNA可分离得到限制性片段，然后再将该片段插入到表达载体中。
下列实施例将进一步说明本发明。
实施例1：能够用于表达脱（PheB25）-SCI的表达质粒的构建
在BamHI限性制片段上的表达质粒pYGABA（见图1）中含有表达盒的分离：将表达质粒与核酸内切限制酶BamHI一起温育，条件是：20μg质粒，50单位BamHI，100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2和1mM DTT，体积为100μl。温度37℃，反应时间2小时。在1%琼脂胶上将2个DNA片段分开，分离得到所需片段。
连接到M13载体M13mp 18：
将分离得到的限性制片段在下述反应混合物中连接到用核酸内切限制酶BamHI切割的噬菌体载体M13mp 18上，所述反应混合物为：片段0.2μg，载体0.02μg，50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，10mMDTT，和/mM ATP，体积为20微升。将5微升该混合物转移到大肠杆菌株JM101中，用由转化株分离得到的双链M13-DNA的限制性酶图谱测定载体中片段的存在和片段的取向。
单链（SS）DNA（模板）的分离
按Messing（Gene，19，1982，269-276）所述方法，从上述转化株中分离得到单链DNA。
突变引物的5′磷酸化
含有5′-TTGGAGTGTAGAAACCTCTT-3′顺序的突变引物在30微升含有下述组分的反应混合物中对其5′端进行磷酸化处理，所述反应混合物含有：70mM Tris-HCl，pH7.0，10mM MgCl2，5mM DTT，1mM ATP，100pmol寡核苷酸和3.6单位的T4多核苷酸激酶。在37℃下，反应进行30分钟，然后在65℃下保温混合物，使酶失活。
模板和经过磷酸化的突变引物的对合
模板与引物的对合是在65℃下，在10微升含有0.5pmol模板，5pmol引物，20mMTris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT中加热10分钟进行的，然后冷却至0℃。
扩大/连接反应：
将10微升下述混合物加入上述反应混合物中，在所述10微升混合物中含有0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM TTP，1mM ATP，20mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，3单位T4 DNA连接酶和2.5单位克列诺夫聚合酶，反应在16℃下进行16小时。
JM101的转移作用：
采用常规技术将不同稀释度的上述反应混合物转移到经过CaCl2处理过的大肠杆菌JM101细胞中，并以2×YT topagar将其接种在2×YT琼脂平板上2×YT＝胰化胨16g/升，酵母膏10g/升，NaCl 5g/升，（2×YT topagar＝2×YT，并含有0.4%琼脂糖，经过高压釜消毒。2×YT琼脂平板＝2×YT，并含有2%琼脂，经过高压釜消毒）。平板在37℃下温育过夜。
正克隆的鉴定：
采用噬菌斑杂交方法，即将硝酸纤维素滤器置于具有适当噬菌斑密度的平板上，使滤器湿润，然后将其浸没在下述溶液中。在所述含有1.5M NaCl和0.5M NaOH溶液中浸30秒，在1.5M NaCl和0.5M Tris-HCl（pH8.0）溶液中浸1分钟，在2×SSC（0.3M NaCl和0.03M柠檬酸钠）中浸至以后使用。滤器在3MM滤纸上干燥，并在80℃真空炉内烘2小时。
将具有5′TTGGAGTGTAGAAACCTCTT-3′顺序的突变引物在30微升含有下述的组分中对其5′进行放射性标记，所述组分包括：70mM Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl2，5mM DTT，10pmol寡核苷酸，20pmol γ-32P-ATP和3.5单位T4聚核苷酸激酶。混合物先在37℃温育30分钟，后在100℃温育5分钟。
干燥滤器在65℃下置于6×SSC，0.2%牛血清蛋白，0.2%聚蔗糖，0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0.2%十二烷基硫酸钠（SDS），和50μg/ml鲑鱼精子DNA中预杂交2小时。然后将含有标记样品的反应混合物加到15ml新鲜的预杂交混合物中，在28℃和缓慢摇动下将滤器浸在其中过夜。杂交后，将滤器在2×SSC+0.1%SDS中洗涤3次，每次15分钟。接着进行放射性自显影。在52℃的相同溶液中洗涤后，再进行放射性自显影，对附加在突变引物的含有DNA顺序的噬菌斑进行鉴定。
正克隆的筛选：
由于被鉴定的克隆是异源双链的结果，因此需要将噬菌斑再接种在平板上，重复杂交和鉴定。
双链M13噬菌体DNA的纯化
经筛选的克隆用于大肠杆菌株JM101的感染。含有大约108噬菌体和5个JM101菌落的培养物在37℃下和5ml 2×YT培养基中进行培养。然后按照Birnboim & Doly所介绍的方法（Nucleic Acids Res.，2，1979，1513），从片状沉淀物中纯化双链环状DNA。
含有经过修饰的胰岛素前体的限制性片段的分离：
由上述分离得到的DNA制剂（约5μg）在60微升的100mM NaCl，50mM Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl2和/mM DTT中，用10单位核酸限制性内切酶BamHI于37℃下消化2小时。在琼脂糖-凝胶上分离DNA产物，并从凝胶中纯化该片段。
连接到酵母载体pAB24（图2）：
将分离得到的限制性片段在下述反应混合物中连接到用核酸限制性内切酶BamHI消化的酵母载体pAB24上，所述混合物包括：片段0.2μg，载体0.02μg，50mM Tris-HCl（pH7.4），10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，总体积为20微升。取该反应混合物5μl用于转化大肠杆菌株MC1061，其中修饰过的表达质粒已经鉴定和繁殖。除了缺失的密码子外，质粒与pYGABA完全相同。
酵母的转移：
按照Ito等所介绍方法（J.Bact.，Vol.153，No.1，1983，163-168），进行表达质粒转移到酵母株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae JC482△pep △Leu 2 cir°（α，his4，pep4，ura3，leu2，cir°）。将经过转化的细胞置于SC-ura培养基中（0.7%酵母氮碱，2.0%葡萄糖，0.5%酪蛋白氨基酸，2.0%琼脂），用于选择含质粒的细胞。
实施例Ⅱ：能够用于产生脱（TyrB26）-SCI的表达质粒的构建
除了突变引物具有5′-ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-3′顺序以及杂交温度为36℃和杂交后洗涤温度为60℃外，采用的方法基本上与实施例1所述方法相同。经过修饰的质粒除了缺失的密码子外，具有与pYGABA完全相同的顺序。
实施例Ⅲ：能够用于产生（HisB25），脱（TyrB26）-SCI的表达质粒的构建
除了突变引物具有5′-AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCTCTTTCACC-3′顺序以及杂交温度为43℃和杂交后的洗涤温度为66℃外，所用方法与实施例1相同。修饰过的质粒，除了修饰和缺失的密码子外，经过修饰的质粒具有与pYGABA完全相同的顺序。
实施例Ⅳ：能够用于产生（AsnB25），脱（TyrB26）-SCI的表达质粒的构建
除了突变引物具有5′-AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-3′顺序以及杂交温度为42℃和杂交后的洗涤温度为65℃外，所用方法与实施例1相同。除了修饰和缺失的密码子外，经过修饰的质粒具有与pYGABA完全相同的顺序。
实施例Ⅴ：前体的表达和由培养基进行分离
将如实施例Ⅰ至Ⅳ所述经过转移的酵母置于含有基本培养基（无尿嘧啶）的陪替氏平板上，在30℃下繁殖48小时。在100ml摇瓶含有基本培养基（无尿嘧啶）和5g/升酪蛋白氨基酸、10g/升琥珀酸和30g/升葡萄糖（pH5.0）上，接种一个由陪替氏培养皿取出的菌落，摇瓶在30℃下摇动温育72小时。
离心后，取出1升上清液过滤灭菌，加入5M HCl和水，将pH调至4-4.5和导电率＜10mS。以120ml/小时的流速，将上清液装载在S/琼脂糖FF柱上，该层析柱事先用50mM乙酸、50%（体积）乙醇平衡并用NaOH将pH调至4.0。层析柱用60ml缓冲液洗涤，并用0-0.35M 线性梯度的NaCl缓冲液（360ml）和10ml/小时的流速洗脱前体。洗脱物分成4ml等份，进行紫外光吸收率测定。含有前体的各馏份经RP-HPLC分析和沉淀，在交联葡聚糖G25柱上用1M乙酸脱盐，经冷冻干燥分离得到前体。
实施例Ⅳ：脱（PheB25）、脱（ThrB30）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅰ和Ⅴ所述方法制备400mg脱（PheB25）-SCI，将其溶于40ml的50mM Tris-（羟甲基）氨基甲烷中，再加入用HCl将pH调至9的20%（体积）乙醇和含有32mg固定化胰蛋白酶（溶于相同缓冲液中）的40ml（沉降体积）琼脂糖。悬浮液在8-10℃下缓慢搅拌24小时后过滤，用40ml缓冲液洗涤凝胶，将过滤物装载在2.6×7.5cm的Q-琼脂糖FF柱上，层析柱事先用经HCl调至pH8.0的50mM Tris-（羟甲基）氨基甲烷、50%（体积）乙醇平衡。层析柱用0-0.15M线性梯度的NaCl（于相同的缓冲溶液中）和以225ml/小时的流速洗脱。对洗脱液进行紫外光吸收率的测定，含主峰蛋白沉淀。真空除去乙醇后，在pH5.4沉淀蛋白质。
经冷冻干燥分离得到250mg脱（PheB25）、脱（ThrB30）-人胰岛素。
通过氨基酸分析、等离子体解吸质谱测定和分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法证实产物的相同性。
实施例Ⅶ：脱（PheB25）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅵ所述方法制备200mg脱（PheB25），脱（ThrB30）-人胰岛素，溶于含400mg苏氨酸甲酯、2.0ml乙醇和0.8ml水的混合物中。用乙酸将pH值调至6.3，加入4ml（沉降体积）含有2.3mg固定化胰蛋白酶的琼脂糖。在20℃下缓慢搅拌2小时后，过滤去除凝胶，加10体积2-丙醇沉淀出蛋白质。沉淀物经风干后再溶于20mM Tris（羟甲基）氨基甲烷/HCl，60%（体积）乙醇（pH8.25）中，然后将其装载在事先用所述缓冲液平衡过的2.6×20cm Q-琼脂糖FF柱上，用0-0.1M线性梯度的NaCl（溶于相同的缓冲液中）和125ml/小时流速洗脱。真空除去含有脱（PheB25）-人胰岛素-（B30-甲酯）的沉淀馏份中的乙醇，在pH6.1下沉淀出蛋白质。悬浮液经离心后，冷冻干燥沉淀物。在蛋白质浓度为10mg/ml时，在冷却的0.1M NaCH中将甲酯水解10分钟。将pH调至8.5终止反应，加入2体积的20mM Tris（羟甲基）-氨基甲烷/HCl（pH8.5）。将溶液装载在2.6×20cm Q-琼脂糖柱上，按上述方法洗脱。真空除去乙醇后，在pH5.5时蛋白质沉淀。
冷冻干燥后，得到80mg脱（PheB25）-人胰岛素。
通过氨基酸分析、等离子体解吸质谱和分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法，证实产物的相同性。
实施例Ⅷ：脱（TyrB26）、脱（ThrB30）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅱ和Ⅴ所述方法，制备250mg脱（TyrB26）-SCI，将其溶于25ml的50mM tris（羟甲基）氨基甲烷，加入经HCl调至pH9的20%（体积）的乙醇和含有20mg固定化胰蛋白酶（在相同的缓冲液中）的25ml（沉降体积）琼脂糖。悬浮液在8-10℃下缓慢搅拌24小时，然后过滤。凝胶用25ml缓冲液洗涤，将沉淀的过滤物装在2.6×7.5cm的Q-琼脂糖FF柱上，层析柱事先用经HCl调至pH8.0的50mM tris-（羟甲基）氨基甲烷、50%（体积）乙醇平衡。层析柱用0-0.15M线性梯度的NaCl（在相同缓冲液中）和225ml/小时流速洗脱6小时。对洗脱液进行紫外光吸收率测定，沉淀出含主峰蛋白的馏份。真空去除乙醇后，在pH5.4时蛋白沉淀。
经冷冻干燥，得到130mg的脱（TyrB26），脱（ThrB30）-人胰岛素。
通过氨基酸分析和分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法，证实产物的相同性。
实施例Ⅸ：（HisB25），脱（TyrB26），脱（ThrB30）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅲ和Ⅴ所述方法，制备450mg的（HisB25），脱（TyrB26）-SCI，将其溶于45ml的50mM tris-（羟甲基）氨基甲烷，加入经HCl调至pH9的20%（体积）乙醇和含有36mg固定化胰蛋白酶（于相同缓冲液中）的45ml（沉降体积）的琼脂糖。悬浮液在8-10℃下缓慢搅拌24小时后过滤，凝胶用40ml缓冲液洗涤，将沉淀的过滤物装在2.6×7.5cm的Q-琼脂糖FF柱上，层析柱事先用经HCl调至pH8.0的50mM tris-（羟甲基）氨基甲烷，50%（体积）乙醇平衡。层析柱用0-0.15M线性梯度的NaCl（于相同缓冲液中）和225ml/小时的流速洗脱6小时，对洗脱液进行紫外光吸收率的测定，沉淀出含主峰蛋白的馏份。真空去除乙醇后，在pH5.4时蛋白质沉淀。
经冷冻干燥后分离得到200mg的（HisB25），脱（TyrB26），脱（ThrB30）-人胰岛素。
通过氨基酸分析和分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法，证实产物的相同性。
实施例Ⅹ：（AsnB25），脱（TyrB26），脱（ThrB30）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅳ和Ⅴ所述方法，制备150mg的（AsnB25），脱（TyrB26）-SCI，将其溶于15ml的50mM tris-（羟甲基）氨基甲烷，加入经HCl调至pH9的20%（体积）乙醇和含有12mg固定化胰蛋白酶（于相同缓冲液中）的15ml（沉降体积）的琼脂糖。悬浮液在8-10℃下缓慢搅拌24小时后过滤。凝胶用40ml缓冲液洗涤，将沉淀的过滤物装载在1.6×10cm的Q-琼脂糖FF柱上，层析柱事先用经HCl调至pH 8.0的50mM tris（羟甲基）氨基甲烷，50%（体积）乙醇。层析柱用0-0.15M线性梯度的NaCl（于相同的缓冲液中）和90ml/小时的流速洗脱。对洗脱液进行紫外光吸收率的测定，沉淀出含主峰蛋白的馏份。真空除去乙醇后，在pH0.54时蛋白沉淀。
经冷冻干燥后，分离得到80mg的（AnsB25），脱（TyrB26），脱（ThrB30）-人胰岛素。
通过氨基酸分析和分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法，证实产物的相同性。
实施例Ⅺ：（AspA21），脱（PheB25），脱（ThrB30）-人胰岛素的制备
按实施例Ⅵ所述方法制备50mg的脱（PheB25），脱（ThrB30）-人胰岛素，将其溶于经1M HCl调至pH 2的10ml水中。溶液在30℃下放置16天，冷却至20℃后，加入7.5g尿素，用1M NaOH调至pH8.1。然后将溶液装载在1.6×20cm Q-琼脂糖FF柱上，该层析柱事先用20mM tris-（羟甲基）氨基甲烷/HCl，7M尿素（pH 8.1），在4℃下平衡。层析柱用NaCl（于相同缓冲液中）以0-0.05M的线性梯度和40ml/小时的流速洗脱24小时。含有最后洗脱峰的蛋白的沉淀馏份在交联葡聚糖G25柱上用1M乙酸脱盐并冷冻干燥。
得到30mg的（AspA21），脱（PheB25），脱（ThrB30）-人胰岛素。
通过氨基酸分析、5步埃德曼降解法和用羧肽酶A的C端分析，证实产物的相同性。
实施例Ⅻ：（SerA21），脱（ProB28）-人胰岛素的制备
构建能用于产生（SerA21），脱（ProB28）-人胰岛素的表达质粒和制备（SerA21），脱（ProB28）-人胰岛素。
编码该类似物的pUC-19衍生的质粒pKFN-864是通过用NOR-648 CTAG AGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTAG和NOR-745 ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC两个突变引物进行质粒pKFN-734的间隙复式诱变构建的（Y.Morinaga et at.，Biotechnology 2，1984，636-639）。质粒pKFN-734是通过将编码融合在密码中的合成酵母信号前导物的0.4kb EcoRI-XbaI片段连接到由质粒pLac212spx3至pUC-19的2.7kbEcoRI-XbI片段的合成胰岛素前体基因B（1-29）-AlaAlaLys-A（1-21）（C.Yannisch-Perron et al.，Gene，33，1985，103-119）。
质粒pLaC212spx3在国际专利申请No.WO 89/02463的实施例3和图6和13中已经作了介绍。
编码信号前导物胰岛素B（1-29，脱28 Pro）-AlaAlaLys-A（1-21，21Ser）的pKFN-864中的0.4kb EcoRI-XbaI片段的DNA顺序在图3中给出。
pKFN-864由EcoRI和XbaI切割，并将0.5kb片段连接到PMT636的9.5kb NcoI-XbaI片段和pMT636的1.4kb NcoI-EcoRI片段，形成质粒pKFN-866（见图4）。质粒pMT636是由缺失LEU-2基因后的pMT608和pMT479构建的（见图4）。pMT608已在EP195691中作了介绍，PMT479则在EP163529中作了介绍。pMT479含有Schizosaccharomyces pombe TPI基因（POT），酿酒酵母（S.cerevisiae）三碳糖磷酸异构酶启动区和终止区，TPIp和TPIT（Alber，T.and Kawasaki，G.J.Mol.App.Gen.，1，1982，419-434）。质粒pKFN-866含有下列顺序：
TPIp-信号-前导物-胰岛素B（1-29，脱28Pro）-AlaAlaLys-A（1-21，21 Ser）-TPIT。
酿酒酵母株MT 663（E2-7B XE 11-36 a/α，△tpi △tpi，pep 4-3/pep 4-3）在YPGaL（1% Bacto酵母膏，2% Bacto蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸）上培养到在600nm上光密度为0.6。
通过离心收集100ml生成的培养物，用10ml水洗涤，再离心并悬浮在10ml含有1.2M山梨糖醇，25mM Na2EDTA（pH＝8.0）和6.7mg/ml二硫苏糖醇的溶液中。悬浮液在30℃下温育15分钟，离心，将细胞悬浮在10ml含有1.2M山梨糖醇，10mM Na2EDTA，0.1M柠檬酸钠（pH＝5.8）和2mg Novzym234的溶液中。悬浮液在30℃下温育30分钟，离心收集细胞后，在10ml的1.2M山梨糖醇和10ml的CAS（1.2M山梨糖醇，10mM CaCl2，10mM Tris HCl（Tris＝Tris（羟甲基）氨基甲烷，pH＝7.5）中洗涤，然后再悬浮在2ml CAS中。为了转移，将0.1ml的CAS悬浮的细胞与大约1μg的质粒pKFN-866混合，在室温下保存15分钟。加入1ml的20%聚乙二醇4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl（pH＝7.5），混合物在室温下再保存30分钟，离心后将碎片悬浮在0.1ml的SOS（1.2M山梨糖醇，33%V/V YPD，6.7mM CaCl2，14μg/ml亮氨酸），在30℃下温育2小时。悬浮液离心后，将碎片悬浮在0.5ml的1.2mM山梨糖醇，在52℃下加入6ml含有1.2M山梨糖醇加0.25%琼脂）的Topagar（Sherman等的SC培养基，见Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981），将悬浮液倒在含有相同琼脂固化的山梨糖醇培养基的平板上部。在30℃下，三天后摘取转化株菌落，分离并用于液体培养原料。从这种转化株KFN-883中再进一步选择其特征。
酵母株KFN-883在YPD培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨（从Difco实验室得到）和2%葡萄糖）上培养。10ml酵母株培养物在30℃下摇动至600nm时光密度达20。离心后按L.Snel等所述的HPLC分析上清液（Chromatographia，24，1987，329-332）。得到约0.14mg/升的胰岛素B（1-29，脱28 Pro）-AlaAlaLys-A（1-21，21 Ser）。
通过将发酵上清液在低pH值下吸附到离子交换柱上和在高pH值下解吸以及通过锌离子沉淀，分离得到单链胰岛素前体。该前体对（SerA21），脱（ProB28），（ThrB30-OME）-人胰岛素的转肽作用如下：
10mmol（2.35g）苏氨酸甲酯和冰醋酸溶于DMF，得到5ml溶液，再加入2.5ml的76.5% V/V DMF水溶液，将0.5g前体溶于保持在12℃的该混合物，加入50mg溶于1.25ml的0.05M乙酸钙的胰蛋白酶，24小时后，在12℃下将反应混合物加到100ml丙酮中，使肽沉淀，取出后真空干燥。
分离得到的胰岛素类似物酯在用酸性pH值的硅-C18作为基质的预先制备的HPLC柱上进行纯化，将经纯化的酯在pH10的水介质中和25℃下水解24小时，形成的（SerA21），脱（ProB28）-人胰岛素在中性pH时用锌离子进行沉淀。沉淀物通过阴离子交换层析和凝胶过滤脱盐进行纯化。冷冻干燥后得到102mg（SerA21），脱（ProB28）-人胰岛素。
实施例ⅩⅢ：脱（ThrB27）-人胰岛素的制备
将1g无锌猪胰岛素溶于pH调至9的40ml水中，加入50mg猪胰蛋白酶于10ml的0.25M碳酸氢铵（用氨水调至pH9）的溶液。该溶液置于4℃下，48小时后经HPLC分析，得率为65%。反应混合物在4℃下在5×90cm超细交联葡聚糖G50于0.05M碳酸氢铵中的柱上，以90ml/小时流速进行凝胶过滤。沉淀和冷冻干燥含主峰蛋白的馏份，得到520mg脱（B23-B30）-人胰岛素。
具有Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr顺序的肽是在PAM树脂上用被护对称氨基酸酐由（应用生物系统得到的）肽合成仪进行合成。最后，在0℃下用无水氟化氢从树脂上切下肽，同时去除保护基。
将200mg脱（B23-B30）-人胰岛素和400mg肽溶于2.40ml二甲基甲酰胺和1.20ml水的混合物中，用三乙胺将该混合物的pH值调至6.5。加入10mg猪胰蛋白酶的水（0.20ml）溶液，反应混合物在20℃下放置4小时，加入25ml 2-丙醇使反应终止，离心分离出沉淀的蛋白。将沉淀物溶于10ml的1M乙酸并装载在2.6×20cm的LichroprepRP-18（25-40μm）的柱上，该层析柱事先用0.5mM盐酸，0.1M氯化钠的30%（体积）乙醇溶液平衡。在20℃下，用20ml/小时流速的相同缓冲液（但其乙醇量线性增加至50%）洗脱层析柱24小时。对洗脱液进行紫外光吸收率的测定，沉淀含主峰蛋白的馏份。用同体积的水并用氢氧化钠溶液调至pH5.5，使蛋白沉淀，在4℃下静置1小时后，通过离心和冷冻干燥，分离沉淀物。
通过分离的乙烯吡啶化的A链和B链的顺序埃德曼降解法鉴定，得到80mg脱（ThrB27）人胰岛素。
实施例ⅩⅣ：注射液配制剂的制备
将60μmol的本发明人胰岛素类似物溶于4ml的0.1M HCl中，加入20ml的1.5%m-甲酚，再将该溶液与40ml的4%丙三醇和20ml的65mM磷酸氢二钠混合，将pH调至7.3。最后将溶液加水至100ml，过滤灭菌。
实施例ⅩⅤ：结合度的测定
2.6cm×88cm交联葡聚糖G-75柱用13mM磷酸钠缓冲液（pH＝7.3）以22ml/小时的流速进行平衡。用脱（八肽-B23-30）-人胰岛素、细胞色素、核糖核酸酶、单体和多体肌红蛋白作分子量标记物，绘出表示分子量与洗脱体积函数关系的曲线图。
用含有0.6mM无锌人胰岛素或0.6mM胰岛素类似物的1ml溶液，按实施例Ⅻ所述方法制备，在尾峰上得到无锌人胰岛素洗脱液，表观分子量为≈5KD。
上述结果证明：本发明人胰岛素类似物在pH7.3的溶液中，基本上为单体，而在相同水平的条件下，平常的人胰岛素则为二聚体和较高寡聚体的混合物。
实施例ⅩⅥ：生物活性的测定
基本上按J.Gliemann和S.Gammeltoft所述方法（Diabetologia 10，1974，105-113），通过测量对离体老鼠的脂肪细胞和肝细胞的胰岛素受体的结合亲合力，测定体外生物活性。
胰岛素类似物与半合成人胰岛素对比，其效力为100%，结果示于下表：
脂肪细胞 肝细胞
脱（PheB25），脱（ThrB30）-人胰岛素 223% 201%
脱（PheB25）-人胰岛素 225% 249%
（AspA21）-脱（PheB25），250% 242%
脱（ThrB30）-人胰岛素