人工合成抗癌药物,研制费用大,并且付作用大。从植物中筛选,提取抗癌药成为当今的世界潮流。我国中国医学科学院药物研究所也在从事这方面工作。在该所发表的“中国粗榧抗肿瘤有效成分的研究”(《中草药》1981,NO.6 P.1~4)一文中报导了粗榧树皮中含有的台湾三尖杉碱,对小鼠白血病L615有微弱作用。海南粗榧(Cephalolaxus hainaneie Li)为三尖杉属植物。另外在“长叶榧化学成分的研究”(《中药通报》Vol.10 NO.4 1985 P.32~33)一文报导了从紫杉科植物长叶榧(Torrya jackii)中分离出β-谷甾醇和扁豆脂素之外的豆甾-3-烯-4酮等四种化合物。长叶榧提取物的动物实验发现有降压,舒张血管作用。发明人在抗癌植物筛选研究中首次发现,从香榧又称榧树的树枝中得到的提取物,发明人命名为“托里埃”,它具有抗癌活性,经动物肿瘤实验,具有较好疗效,对小白鼠S180肿瘤抑制瘤率为38~64%,其显著性有效率高达95~99%以上(P值<0.05~<0.01)。 本发明的目的在于提供一种由香榧树枝提制抗癌新药“托里埃”有效成分的工艺方法,并确定其化学成分。
香榧树系裸子植物门,榧树族,榧树属,榧树组榧树(Torreya gandis Fort.et Lindl),为我国特有树种,分布在长江以南的贵州,湖南,江西,福建,安徽,浙江及江苏等地。
本发明工艺流程为:
1.原料准备:采集新鲜香榧树枝,晒干,粉碎,过20目筛先制成生药粉。
2.提取:在榧粉生药粉中拌入0~10%碳酸钠和/或Ca(OH)2,用4~12倍体积的甲醇和/或乙醇溶剂,经40~80℃提取2~10小时,得到甲醇和/或乙醇的碱性醇类提取液。
当不用碳酸钠和/或Ca(OH)2时,可用生药粉用4~12倍体积的水煎煮,其滤液用甲醇和/或乙醇调整醇度到70%~85%经2~3次提取,过滤,得到甲醇和/或乙醇提取液。
3.蒸馏浓缩,把提取液在蒸馏装置中蒸馏浓缩至出现泡沫,停止加热,得到浓缩物,同时回收甲醇和/或乙醇溶剂。
4.沉淀:在浓缩物中边搅拌边加入8~12倍体积的蒸馏水,用盐酸和/或硫酸酸析,使pH等于2~4,并析出淡黄色沉淀物。
对于非碱性溶液浓缩物则加入热饱和醋酸铅水溶液,直至沉淀完全。
5.过滤:把沉淀物过滤,抽干。
6.真空干燥:在真空干燥器中真空干燥,得到“托里埃”总提物,得率2~3%。
7.分离:把“托里埃”总提物用硅胶层析柱分离,以混合洗脱剂洗脱,分别得到“托里埃”1号和“托里埃”2号,得率分别为3‰和9‰。
所述的混合洗脱剂是由氯仿,甲醇,丁酮组成的,其配比为氯仿∶甲醇∶丁酮=16~24∶1~3∶1。
分离得到的“托里埃”1号及“托里埃”2号在沈阳化工研究院等有关单位,用核磁共振仪,红外光谱仪,色质联用仪等仪器进行测试,分析检验,确定“托里埃”1号的分子式为C18H10O8,分子量为354.270,结构式如图1所示,图1中的R≡1,命名为托里埃黄酮(Torreyaflavone)。
同样确定“托里埃”2号的分子式为C27H26O12,分子量为542.490,其结构式如图2所示。其中鼠李糖的结构如图3所示,它是一种公知的结构。命名“托里埃”2号为托里埃黄酮甙(Torreyaflavonoloside)。
图面说明:
图1为“托里埃”1号分子结构式。
图2为“托里埃”2号分子结构式。
图3为鼠李糖分子结构式。
为了检验“托里埃”1号的抗癌效果,由江西中医院病理研究室进行了小白鼠试验。
取传代第10天小白鼠S180瘤株1∶1稀释液,接种健康小白鼠30只,每只腋窝皮下注射0.2毫升。随机分为三组:对照组,托1一组,托1二组。于接种瘤株的次日,对照组腹腔注射10%酒精0.2毫升/只,每天1次,连续8天。托1一、二组分别腹腔注射200毫克/公斤/只,100毫克/公斤/只“托里埃”1号,每天1次,连续8天。停药地第二天全部动物脱椎处死,取瘤称重,计算抑瘤百分率,结果列于表1。
表1 “托里埃”1号对S180瘤株生长的影响组别剂量(毫克/公斤)途径×天动物数体重(克)体重变化瘤重(克)抑瘤率%P值始终始终对照组100%酒精0.24/只10101.9821.5+1.71.13托1-组200ip×81082019.4-0.60.4164<0.01托1二组100ip×8101019.819.4-0.40.6542<0.01
表1的结果表明,当“托里埃”1号用药量为200毫克/公斤时,抑瘤率为64%,P值<0.01。即显效率在99%以上。
同样对“托里埃”2号进行小白鼠实验,其结果列于表2
表2 “托里埃”2号对S180瘤株生长的影响组别剂量(毫克/公斤)途径×天动物数体重变化(克)瘤重(克)抑瘤率%P值始终始终对照组(5~10%酒精)0.2毫克/只ip×814141.88+6.21.43托1-组200毫升/只ip×8101018.4+2.60.6257<0.05托1二组150毫升/只ip×8101018.3+4.10.8938<0.05
从表2可见,“托里埃”2号对小白鼠S180瘤株的抑瘤率,当用药量为200毫克/公斤时,达57%,P值<0.05,即显效率在95%以上。
实施例1
1.榧树枝晒干,粉碎,经20目过筛得生药粉(1);
2.称取97.5克生药粉和2.5克无水碳酸钠混合均匀(2);
3.称取40克拌有无水碳酸钠的生药粉,用500毫升甲醇(C.P)于索氏器提取,温度40~80℃时,最好保持在54~60℃,持续4个小时,得到甲醇提取液(碱性溶液)(3);
4.把(3)转入蒸馏装置,回收甲醇溶剂,直至釜内的甲醇提取液出现泡沫,停止加热,冷却后,倒入600毫升烧杯中(4);
5.在搅拌条件下,在(3)中加入蒸馏水稀释至500毫升,再加入6N盐酸(C.P),调节pH至pH=2~3,即析出淡黄色沉淀,过滤,抽干,真空干燥得“托里埃”总提物(5),得率为2%~3%。
6.把(5)用硅胶层析柱分离,以混合洗脱剂(氯仿∶甲醇∶丁酮=16∶3∶1)洗脱,分离得到“托里埃”1号和“托里埃”2号。得率分别为3‰和9‰。
实施例2
同实施例1的原料生粉90份加Ca(OH)2水溶液配成100份,用12倍体积的乙醇,在60~80℃索氏提取10小时,得到乙醇提取液,经蒸馏浓缩至出现泡沫,停止加热,得到浓缩液,同时回收乙醇,浓缩物用蒸馏水稀释,再用6N硫酸调节pH=3~4,即析出淡黄色沉淀,沉淀经过滤,抽干,真空干燥得到总提物,再用硅胶层析柱分离,以混合洗脱剂氯仿∶甲醇∶丁酮=20∶2∶1洗脱,得到“托里埃”1号及“托里埃”2号,得率2~3‰。
实施例3
1.生药粉300克加入2000克水煎煮4小时,超热过滤,得滤液(1)。
把(1)浓缩至400毫升,在搅拌下加入乙醇至溶液醇度达70%,得乙醇液(2),静置过夜。
2.乙醇液(2)过滤,得滤液(3)。
3.把滤液(3)回收溶剂,浓缩至500毫升,在搅拌下加入乙醇使溶液醇度达85%,得乙醇液(4),静置过夜。
4.醇液(4)过滤,回收溶剂,浓缩得浓缩液500毫升(5),以热饱和醋酸铅水溶液加入(5)中,直至沉淀完全(6)。
5.将(6)过滤,得黄色沉淀(7)和滤液(8)。
6.把(7)溶于400毫升无水乙醇中,用87%H2SO4脱铅,再以6NNaOH中和至pH~7,过滤,浓缩,得托里埃粗提物,得率1%。
7.把滤液(8)用8%H2SO4脱铅,再以6NNaOH中和至pH~7得托里埃粗提物,得率2%。
8.托里埃粗提物都用硅胶层析柱分离,以氯仿∶甲醇∶丁酮=24∶1∶1无混合洗脱剂洗脱,分别获得托里埃1号和托里埃2号。