H速冻液及玻璃化储存皮肤的方法.pdf

本发明属于用于皮肤组织超低温贮存的抗冻液及冷冻方法。
    在大面积深度烧伤病人的医疗救护工作中，因病人自体皮的不足，常需使用具有活力、质量良好的异体皮，用以复盖创面挽救病人生命。因此，贮存具有活力质量良好的异体皮以备抢救之急需是很重要的。

    目前，贮存具有活力的皮肤组织的方法，一般采用液氮超低温（-196℃）贮存皮肤组织。为了防止皮肤组织在超低温贮存过程中受到冷冻损伤以致降低成活率，通常应用抗冻液对皮肤组织进行予处理，并采用慢速降温的方法使皮肤组织降至-79℃再放入液氮中长期贮存。这种方法，常用5-15%的二甲亚砜或10-30%的甘油作为抗冻液，将皮片浸泡在其中5-15分钟，然后将皮片取出经干冰或低温冰箱以0.5-4℃/分的速率降温，有时为了使降温速率更准确，还可采用可控降温仪降温，经过4-12小时后，当皮肤组织温度降至-79℃时，放入液氮中，即可长期贮存并能保存皮肤组织活力。（朱兆明：中华外科杂志1∶53，1979;常兆华：低温医学生物学专题讨论会资料汇编，21页，1986        北京）应用上述抗冻液及采用慢速降温方法解决了在超低温（-196℃）条件下保存具有活力的皮肤组织的课题，被临床及实验室广泛应用，救治了大量危重的大面积烧伤病人。至今，有的皮肤组织已贮存了数十年之久仍能保存活力。但是，沿用传统的抗冻液及冷冻方法超低温贮存的皮肤组织的活力与冷冻前皮肤组织活力相比较仅为冷冻前组织活力的50%左右（应用胎兰法、琥珀酸脱氢酶测定法及耗氧量测定法测定）。保存活力不高。同时，将该冷冻皮复温后应用于临床复盖创面，存在着皮肤转红慢、起水泡地问题。当应用于切痂不彻底或感染较重的肉芽创面时，生长成活率低。另外，这种方法操作过程复杂，时间长，且需费用昂贵的控制降温设备。

    随着低温生物学的发展，近年来不少学者研究采用玻璃化溶液、超速降温的方法使组织细胞达到玻璃化以防止组织细胞的冷冻损伤，提高超低温贮存组织细胞的存活率。目前，使用的玻璃化溶液有VS1（20.5% W/V 二甲亚砜、15.5% W/V 乙酰胺、10% W/V 丙二醇、6% W/V 聚乙二醇）VS2（6% W/V 聚乙二醇、5.5M 丙二醇），VS3（6% W/V聚乙二醇、6.5M甘油）。其方法是将需冷冻的组织细胞在0℃条件下放入上述玻璃化溶液中浸泡5-15分钟后取出，然后直接放入液氮中，这时组织细胞从0℃--196℃的降温速率可达600℃/分。目前，采用上述玻璃化溶液及超速降温的方法已经实现鼠胚胎细胞悬液，仑鼠卵母细胞悬液，胰岛细胞悬液，人红细胞，单核细胞悬液及角膜内皮细胞的玻璃化及超低温贮存，并取得较好效果，如小鼠胚胎玻璃化超低温贮存的存活率达80-85%，人单核细胞存活率达92%，并保留单核细胞的趋化及吞噬功能。（Fahy，G，M：Cryobiology 24，196-213，1987;Rall，WF：Cryobiology 23，548 1986;Takahashi，T：Cryobiology 23，103-115，1986）但是，组织细胞的玻璃化由于受到玻璃化溶液，细胞密集度，组织块大小及形状的影响，目前，只实现细胞悬液的玻璃化，角膜组织仅能解决单层内皮细胞的玻璃化，像皮肤这样组织较厚（0.4-0.6mm）多层细胞，面积较大（500-1000cm2）又无法通过血管进行灌注再加上抗冻液对不同组织和细胞的毒性和冷冻保护作用不一样，应用贮存细胞及胚胎的方法不适用于人的皮肤贮存，因此，迄今未见有应用玻璃化贮存皮肤组织成功的报道。

    为了提高皮肤组织超低温贮存的存活率，解决皮肤组织玻璃化的问题，我们对各种抗冻液配方对豚鼠及人体皮肤的毒性及玻璃化后皮肤的活力进行了大量的实验研究和临床研究，提出了本发明。H速冻液由平衡液、二甲亚砜、丙二醇组成，其成份为：氯化钠0.52%（W/V）、氯化钾0.027%（W/V）、氯化钙0.021%（W/V）、硫酸镁0.022%（W/V）、磷酸氢二钠0.414%（W/V）、1N盐酸0.23%（V/V）、二甲亚砜20-30%（W/V）、丙二醇6-10%（W/V）PH7.2-7.5。玻璃化贮存皮肤的方法是先将需冷冻的皮肤组织制成厚度为0.4-0.6mm，大小为500-1000cm2左右的皮片。把皮片浸入0-4℃的速冻液中持续25-34分钟，取出装入塑料袋中，封口，直接在1个大气压条件下放入液氮中以600℃/分速率降温即可使皮肤组织玻璃化，长期贮存。

    本发明与现有的皮肤冷冻方法相比，增加了二甲亚砜的浓度，从5-15%增加到20-30%，同时增加了新的抗冻剂丙二醇。处置方法上延长了抗冻液浸泡的时间，由5-15分钟延长至25-34分钟，并且显著地提高了降温的速率，由0.5-4℃/分猛增至600℃/分左右。与现有的玻璃化溶液相比也显著地调整了抗冻剂的配方和含量，减少了影响玻璃化性能的乙酰胺和不适宜皮肤组织的聚乙二醇，同时，增加了二甲基亚砜的浓度，延长了抗冻液处置皮肤组织的时间，因而取得了较满意的冷冻效果。经本发明冷冻超低温贮存的皮肤经检测其存活率与冷冻前相比达70%较现有方法提高40%，用于临床大面积严重烧伤病人则具有皮片转红快，无水泡出现，移植于肉芽创面的成活率明显高于慢冻组。同时还节省了应用低温冰箱，可控降温器等贵重设备，简化了操作步骤，缩短了操作时间。

    实施例：

    将异体皮切成0.4-0.6mm厚，500-600cm3左右大小皮片置于无菌容器内。取氯化钠0.52g，氯化钾0.027g，氯化钙0.021g，硫酸镁0.022g，磷酸氢二钠0.414g，1N盐酸0.23ml，混合加蒸馏水至100ml，经高压灭菌，冷却后加入二甲亚砜及丙二醇，将PH调至7.4使二甲亚砜的浓度为25%，丙二醇的浓度为8%。在0℃将皮片放入H速冻液中浸泡30分钟后取出，放入塑料袋中热合封口，在常压下迅速直接放入液氮罐中速冻，长期贮存。需用时，从液氮罐中取出塑料袋装的皮片直接放入40℃水温中至塑料袋及皮片变软时拿出，用无菌方法取出皮片放入生理盐水中洗去抗冻液即可供植皮使用。