本发明涉及通过胃泌素/胰酶分泌素（CCK）受体配基（特别是胃泌素）和表皮生长因子（EGF）受体配基（特别是转化生长因子α（TGFα））的联合协同刺激作用，影响胰岛前体细胞向成熟的胰岛素生成细胞的分化，以治疗幼年型糖尿病。 胰岛由存在于胎儿小管胰内皮中的内胚层干细胞发育而成，后者还包含发育成外分泌胰腺的多潜能干细胞（Teitelman，G. and J.K.Lee，Developmental Biology，121∶454-466（1987）;Pictet，R. and W.J.Rutter，Development of the embryonic endocrine Pancreas，in Endocrinology，Handbook of Physiology，ed.R.O. Greep and E.B.Astwood（1972），American Physiological Society:Washington D.C.，p.25-66）。胰岛在胎儿妊娠期间通过非连续的发育状态发育，这些非连续发育因鲜明的（多次）转变而加强。如由胰岛素和胰高血糖素的表达所显示的，初始期是以这些多潜能干细胞投入胰岛细胞谱系为特征的原始分化状态。这些原始分化的细胞只表达低水平胰岛素特异性基因产物并缺少成熟胰岛细胞之细胞分化的定型胰岛前体细胞群体（Pictet，R.and W.J.Rutter，文献同上）。在小鼠体内妊娠约16天，原始分化胰腺开始进入以胰岛细胞的细胞分化为特征的迅速生长和分化阶段，并且胰岛细胞特异性基因表达呈数百倍增加。从组织学上看，胰岛形成（新生）因源于胰管的增殖胰岛芽（胰岛胚芽生成）而变得明显。临出生之前，胰岛生长速度变慢，并且胰岛新生和胰岛胚芽生成变得极不明显。与此相随的是，胰岛达到一个充分分化的状态，同时出现最大水平的胰岛素基因表达。因此，与许多器官相似，细胞分化的完成是与降低了的再生潜力相关联的。
因为原始分化之前体地分化发生在胰的胚胎发育晚期，所以调节胰岛分化的因子很可能是在这个阶段在胰中被表达的。在胰岛发育期间表达的基因之一编码胃肠激素肽，即胃泌素。虽然胃泌素在成人体内作为调节酸分泌的胃激素发挥作用，但在胎儿体内胃泌素表达的主要部位却是胰岛（Brand，S.J.and P.J.Fuller，J.Biol.Chem.，263∶5341-5347（1988））。胃泌素在胰岛中的表达是短暂的，它被限制在原始分化的胰岛前体形成分化的胰岛这一阶段。虽然尚不明了胰胃泌素在胰岛发育中的重要性，但一些临床观察提示胃泌素在该胰岛发育中具有下述作用。例如，由表达胃泌素的胰岛细胞肿瘤和萎缩性胃炎引起的高胃泌素血症与相似于分化胎幼胰岛中所见的胰岛胚芽生成相关（Sacchi，T.B.，et al.，Virchows Archiv B，48∶261-276（1985）;和Heitz，P.U.et al.，Diabetes，26∶632-642（1977））。另外，在胎儿胰岛胚芽生成的病例中记录过异常长时间持续的胰胃泌素（Hollande E.，et al.，Gastroenterology， 71∶255-262（1976））。然而，在两种情况下都没有确立胰岛胚芽生成和胃泌素刺激间的因果关系。
不应把本文引用的参考文献看作是承认这些参考文献为本发明的现有技术。
本发明提供了以足以影响胰腺胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞的量给药提供胃泌素/CCK受体配基（如胃泌素），和EGF受体配基（如TGFα）的组合物，以治疗糖尿病的方法。该组合物可以全身给药或由补充有于表达载体中之核酸融合构建体的细胞在原位表达。该融合构建体包含前原胃泌素肽前体编码顺序，且还可包含EGF受体配基的编码顺序。
总地说来，下文报导的研究工作证明，现已用胃泌素/CCK受体配基（如胃泌素）和EGF受体配基（如TGFα）刺激，在动物体内的成年人胰脏的小管上皮中重新激活完全胰岛细胞新生。这些研究证明并确信为达到预想的目的，需要两种类型的生长因子，单用那一种都是不够的。有关胰脏中TGFα和胃泌素的转基因过表达，用于阐述胰胃泌素表达在胰岛发育中所起作用的研究工作已有报道，并表明了TGFα和胃泌素在调节胰岛发育中各自发挥作用。
因此，以这种不同因子组合物或提供在胰内原位表达这些因子的组合物进行治疗给药，使残余的多潜能胰管细胞再生分化为成熟的胰岛素分泌细胞，现已成为一种治疗糖尿病特别是青年型糖尿病的可行临床选择。
图1A照片显示在免疫过氧化物酶染色后来自TGFα转基因胰的组织转化管中的大量胰岛素染色细胞。
图1B照片显示对于胰岛素来说大多数小管细胞染色强度较小，而在某些场合下小管细胞确以相邻胰岛一样的胰岛素染色强度染色。
图2A图解显示嵌合胰岛素启动子-胃泌素（INSGAS）转基因的结构。
图2B图解显示得自INSGAS转基因小鼠之胰提取物的放射免疫检测，显示胃窦中超过内源性鼠基因表达的胃泌素含量的高水平胃泌素免疫反应活性。INSGAS转基因小鼠出生后胰脏中具有高表达的胃泌素。
图3A是用于实施例3所述研究工作中的INSGAS/TGFα小鼠之胰组织的照片。INSGAS/TGFα胰具有小管复合物增加和间质细胞化稍微增加的某些区域。在所使用的5只动物中，显示此区域为最严重的组织学异常。
图3B是实施例3中对照小鼠的胰组织学照片。
图3C是实施例3中TGFα小鼠的胰组织学照片。实施例3所述研究工作中，TGFα胰腺的该区域是典型的，并且显示了间质细胞化和纷繁的小管组织转化相合并存在的纤维化，并已由Jhappan等人（文献同上）描述。
图4A直方图显示基于实施例3所作研究给出的点计数形态度量数据，这些数据进一步证实了在17周时INSGAS/TGFα小鼠的胰腺比TGFα小鼠的胰腺有较低的导管质量。
图4B直方图显示的点计数形态度量数据表明与相应非转基因对照小鼠相比，INSGAS/TGFα胰腺中胃泌素和TGFα的共表达明显地增加了胰岛质量。另外，单独的TGFα表达不能增加胰岛质量。这些数据是基于实施例3所述研究工作给出的。
本发明部分基于证明在TGFα诱导的间质小管中有大量的胰岛素染色细胞这类研究工作。组织变形管细胞中的低水平外分泌和内分泌基因表达相似于在胚胎胰发育的早期阶段见到的原始分化的管细胞。胰岛的形成（新生）是由这些原始分化的胰岛素表达细胞的增殖和分化导致的。从组织学上看，这一过程表现为由胰管显现胎芽（胰岛胚芽生成）而形成胰岛。在MT-42TGFα转基因小鼠中，在刚出生后期间看不到小管组织变形，而只在4周龄才可看到。这表明TGFα过表达诱导腺管上皮中的胰岛素表达，而不是长期维持胎儿胰腺管中的胰岛前体。
虽然组织变形管含有大量胰岛素阳性细胞，但TGFα转基因小鼠的胰岛质量并不多于对照组。因此，单单是TGFα过表达不能影响这些原始分化管细胞向充分分化之胰岛的转变。这就暗示胰岛分化需要有不存在于TGFα转基因小鼠之成年胰中的其他因子。因为原始分化胰岛前体的分化发化在胚胎发育晚期，所以调节这种转变的因子很可能是这个期间在胰岛中表达的。在发育期胰岛中表达的因子有一类是胃肠肽，即胃泌素。临床观察也已证实了胃泌素表达与胰岛胚芽生成（即胎儿胰管的增殖胰岛出芽）的关联（参见Hollande，etal.，Gastroenterology，71∶255-262（1976）and Sacchi，T.B.et al.，Virchows Archiv.B，48∶261-276（1985））。
本文所用的术语“胃泌素/CCK受体配基”包括那些刺激胃泌素/CCK受体的化合物，这样当同一或相邻组织中或同一个体中的EGF受体也受到刺激时，即可诱导产生胰岛素的胰腺胰岛细胞新生。这类胃泌素/CCK受体配基的例子包括各种形式的胃泌素如胃泌素34（大胃泌素）、胃泌素17（小胃泌素）和胃泌素8（极小胃泌素）;各种形式的胰酶分泌素如CCK58、CCK33、CCK22、CCK12和CCK8;以及证明与EGF受体配基有协同作用活性，并具有当与EGF受体配基协同起作用时可诱导成熟胰中的细胞分化形成分泌胰岛素的胰岛细胞的羧基末端肽Trp-Met-Asp-过的胰组织重新引入哺乳动物体内。同样胃泌素/CCK受体配基最好是胃泌素，EGF受体配基最好是TGFα。
在另一实施方案中，胃泌素/CCK受体配基刺激作用是通过表达经转基因引入这些前体细胞中的嵌合胰岛素启动子-胃泌素融合基因构建体而达到的。在另一实施方案中，EGF受体配基刺激作用是表达经转基因引入哺乳动物体内的EGF受体配基基因而产生的。EGF受体配基最好是TGFα，而EGF受体配基基因是TGFα基因。
在另一实施方案中，通过共表达已稳定地引入哺乳动物体内的（ⅰ）前原胃泌素肽前体基因和（ⅱ）EGF受体配基基因来达到由胃泌素/CCK受体配基的EGF受体配基引起的刺激作用。应再次指出的是，EGF受体配基较好是TGFα，而EGF受体配体基因较好是TGFα基因。
另一方面，本发明涉及联合使用胃泌素/CCK受体配基（特别是胃泌素），和EGF受体配基（特别是TGFα）刺激哺乳动物的胰脏胰岛前体细胞，以使这些细胞分化的方法。在该方面一个优选实施方案中，胃泌素刺激作用是经表达已稳定地引入哺乳动物体内的前原胃泌素肽前体基因而实现的该表达在胰岛素启动子控制下进行。EGF受体配基（如TGFα）刺激作用则是通过表达经转基因引入哺乳动物体内的EGF受体配基基因达到的。上述由胃泌素和TGFα引起的刺激作用，最好是通过共表达已经稳定地引入哺乳动物体内的（ⅰ）前原胃泌素肽前体基因和（ⅱ）EGF受体配基（例如TGFα）基因实现的。
本发明的另一方面是核酸融合构建体。该构建体包括编码前原Phe-酰胺的其他胃泌素/CCK受体配基。还包括这些受体配基的活性类似物、片段或其他修饰产物。这类配基还包括增加从组织贮存部位分泌内源性胃泌素、胰酶分泌素或相似活性肽的化合物。这些化合物的例子包括抑制胃酸分泌的omeprazole和提高CCK刺激作用的大豆胰蛋白酶抑制剂。
本文所用的术语“EGF受体配基”包括刺激EGF受体，这样当同一或相邻组织中或同一个体中的胃泌素CCK受体也受到刺激时，即可诱导生成胰岛素的胰腺胰岛细胞新生的化合物。这类EGF受体配基的例子包括EGF1-53、EGF1-48、EGF1-52、EGF1-49以及其片段和活性类似物。其他例子包括TGFα受体配基（1-50），其中有1-48、1-47及其他EGF受体配基如两性调节素（amphiregulin）和痘病病毒生长因子，和证明与胃泌素/CCK受体配基有同样协同作用活性的其他EGF受体配基。它们包括上述配基的活性类似物、片段及修饰产物。有关更详细背景材料可参见Carpenter and Wahl，Chapter4，"Peptide Growth Factors"（Eds.Sporn and Roberts），Springer Verlag，1990。
本发明的一个基本方面是通过给需要进行治疗的个体，以足可使胰腺胰岛前体细胞分化成熟的分泌胰岛素细胞的量，施用包括胃泌素/CCK受体配基和EGF受体配基的组合物以治疗糖尿病的方法。分化的细胞是胰导管中残留的隐性胰岛前体细胞。该方法主要是用于治疗幼年发作型糖尿病。一个实施方案包括给个体使用（最好是全身用药）分化再生量的胃泌素和EGF受体配基，（优选TGFα）。
另一个实施方案包括在移出的哺乳动物胰组织的胰腺胰岛前体细胞中投入胃泌素/CCK受体配基和EGF受体配基，并将如此刺激胃泌素肽前体的核酸顺序和胰岛素转录调节顺序，后者位于编码前原胃泌素肽前体之顺序的5’端并用于有效地支持该顺序的转录。胰岛素转录调节顺序最好包含至少一个胰岛素启动子。在一优选的实施方案中，编码前体肽前体的核酸顺序包括其中含有人胃泌素基因之外显子2和3，且还可任意含有内含子1和2的多核苷酸顺序。
本发明的另一个方面是包括（ⅰ）编码哺乳动物EGF受体配基（如TGFα）的核酸顺序和其转录调节顺序，以及（ⅱ）编码前原胃泌素肽前体的核酸顺序和其转录调节顺序的组合物。EGF受体配基的转录调节顺序较好是强的非组织特异性启动子，如金属硫因启动子。前原胃泌素肽前体的转录调节顺序较好是胰岛素启动子。本实施方案的一个优选形式是其中编码前原胃泌素肽前体的核酸顺序包括含有人胃泌素基因之内含子1和2及外显子2和3的多核苷酸顺序。
本发明的另一个方面涉及包含融合基因构建体的载体，其中所说的构建体包括前胃泌素肽前体编码顺序。该载体可以是质粒如pGeml，或者是具有包括胰岛素启动子在内的转录调节顺序的噬菌体。
本发明的另一个方面涉及包含（ⅰ）处于强的非组织特异性启动子如金属硫因启动子控制下的编码哺乳动物EGF受体配基（如TGFα）的核苷酸顺序，和（ⅱ）处于胰岛素启动子控制下的前原胃泌素肽前体编码顺序的载体组合物。就本发明的这个方面来说，各载体可以是质粒如质粒pGeml，也可以是噬菌体。
本发明的另一个方面涉及能够表达被稳定整合的编码前原胃泌素之基因的非人哺乳动物或组织（包括细胞）。该方面的另一个实施方案是能够共表达已被稳定地整合到哺乳动物、哺乳动物组织或细胞内之（ⅰ）前原胃泌素肽前体基因，及（ⅱ）EGF受体配基（如TGFα）基因的非人哺乳动物。
治疗给药和组合物
给药方式包括（但不限于）透皮、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内和口服等途径。化合物可通过任何方便途径给药，如通过上皮或粘膜下衬（如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等）的吸收进行输注或批量注射，并可以连同其他生物学活性剂一起给药。最好是进行全身给药。
本发明还提供医药组合物。这些组合物包括治疗有效量的治疗剂和医药上可接受的载体或赋形剂。载体包括（但不限于）盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇或它们的组合。配方应与给药方式相适应。
必要时组合物还可含有小量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂型或粉末型。组合物可与常规粘结剂和载体物质如甘油三酯配制成栓剂。口服配方可包含药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等标准载体。
各种药物输送系统是已知的，并可用于施用本发明的治疗剂，如以脂质体、微颗粒、微胶囊等方式进行胶囊包裹。
在一优选的实施方案中，组合物是按照适于对人进行静脉内给药之医药组合物的常规方法配制的。一般说来。适于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水缓冲液中制成的溶液剂。必要时，组合物还可包含增溶剂和用来减轻注射部位疼痛的局部麻醉剂。通常，各成分可以单位剂量形式分别或混合在一起添加，例如以密封容器如标有活性剂量的安瓿或小药囊内的干燥的冻干粉末或无水浓缩制剂形式加入。当组合物是以输注方式给药时，可以用含有无毒药品级水或盐水的输注瓶进行。当组合物是以注射方式给药时，可提供含注射用无菌水或盐水的安瓿，以便在给药前混入各成分。
可作为中性或盐制剂形式配制本发明的治疗剂。药理学上可接受的盐包括与衍生于盐酸铵、磷酸铵、醋酸铵、草酸铵、酒石酸铵等的游离氨基形成的盐，和与衍生于羧酸钠、羧酸钾、羧酸铵、羧酸钙、羧酸铁、羧酸异丙胺、羧酸三乙胺、羧酸2-乙氨基乙醇、羧酸组氨酸、羧酸普鲁卡因等的游离羧基形成的盐。
在治疗具体疾病中有效的本发明治疗剂的量将取决于疾病或症状的性质，并可用常规临床技术确定之。在配方中使用的精确剂量将也取决于给药途径和疾病或紊乱的严重程度，并应根据医生的判断和各病人所处环境来决定。但如果静脉内给药时，适当的剂量范围一般大约为每公斤体重20-500微克活性化合物。鼻内给药时，适当的剂量范围一般是大约每公斤体重0.01Pg至1mg。可由体外或动物模型试验系统得出的剂量-反应曲线来外推得出有效剂量。
栓剂一般含有0.5%至10%（重量）的活性成分;口服配方较好含有10%至95%的活性成分。
本发明还提供包括一个或多个容器的医药包或药盒，所说的容器内装有一种或多种本发明医药组合物成分。与这些容器相随的是一张由控制医药或生物制品的制造、使用或出售的政府机构所出具的申明，该申明反映已由药品生产、使用或出售机构批准可以用于人体。
材料和方法
除另有注明者外，下文实施例中所报告的研究工作中使用下列材料和方法。
动物。小鼠，FVB和CD品系，得自Taconic Farms，Inc.，Germantown，NY.Jappan等人（Cell，61∶1137-1146（1990））描述了由金属硫因启动子高水平表达TGFα的本发明使用的TGFα转基因系MT-42小鼠。
INSGAS转基因构建体。将包括大鼠胰岛素1基因之核苷酸-370至+38的Pvu11-Rsal片段（Cordell， B.G.et al.， Cell， 18∶533-543，1979）连接到pGem1（Promega Corp.，Madison，WI）中。分离含有编码前原胃泌素肽前体之人胃泌素基因的1.5Kb内含子1和2及外显子2和3的4.4Kb Bam HI-EcoR1片段，并再克隆到pGem1（Promega）中大鼠胰岛素I片段的下游。Wiborg， O.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81∶1067-1069 （1984）和Ito， R. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81∶4662-4666（1984）中描述了该片段。胰岛素启动子-前原胃泌素INSGAS转基因构建体被切成为4.8Kb Xba 1-EcoR 1片段。
转基因小鼠的繁殖和表征。按上述方法制备用于下述微量注射的片段。用琼脂糖凝胶电泳法分离，并用CsCl梯度纯化法纯化该片段，然后对注射缓冲液（5mM NaCl， 0.1mMEDTA， 5mM Tris-HCl pH7.4）彻底透析。使用标准技术微量注射处于单细胞阶段的FVB近交小鼠（Taconic Farms，Inc.，文献同上）的已受孕之卵母细胞（参见Hogan，B.et al.，Manipulating the mouse embryo:A laboratory manual，Cold Spring Harbor，NY，1986）。然后按照Hogan等人所述方法将存活的胚胎植入CD1（Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington， MA）“寄母”的输卵管中。使用分离自个体小鼠尾部的DNA，经DNA印迹分析技术，和经随机引导用32dCTP标记的人胃泌素外显子2探针，鉴定转基因“建立者”小鼠。以相似方法鉴定F1小鼠及其同胞。
使含有衍生于CD-1小鼠系（Jappan，文献同上）之MT-TGFα转基因的纯合MT-42小鼠与杂合INSGAS小鼠杂交。断奶后，将子代小鼠放在前面描述的酸化50mM ZnClz上，以诱导金属硫因启动子（Jhappan，文献同上）。
Northern印迹杂交试验。为了进行Northern分析，按Cathala等人（DNA，2∶329-335（1983））所述方法从组织中提取总RNA。在1%琼脂糖变性凝胶上分离20μg总RNA样品并转移到硝酸纤维素膜上。使RNA印迹与32P标记的TGFα核蛋白探针（riboprobes）或不与内源性小鼠胃泌素mRNA交叉杂交的人胃泌素的外显子2杂交。
胃泌素的肽放射免疫试验。提取组织并按Rehfeld，J.F.，Scand.J.Chin.Lab.Invest，30∶361-368（1972）所述使用胃泌素放射免疫试验中对生物学活性C末端酰胺化胃泌素特异的抗体2604，以前已描述的放射免疫法，检测胃泌素免疫反应活性。所有试验中均使用酪氨酸单碘化的人胃泌素17示踪物，并使用合成的人胃泌素17作为标准品。
TGFα的肽放射免疫试验。在液氮中冷冻组织，用研钵和研杆研成粉末，并按Todaro，G.J.等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77∶5258-5262（1980））所述方法进行酸-乙醇提取。加水恢复提取物水分，并用考马斯兰染料结合法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）确定蛋白质浓度。在TGFα放射免疫试验中，以一式两份试验胰组织的等分样品，检测与125I TGFα竞争，结合到固相抗大鼠TGFα之C末端的免抗体上的能力（Biotope，Seattle，WA的药盒）。
组织学分析。切除胰脏，称重，使之相似地在暗盒中取向，在Bouin氏溶液中固定并以常规操作程序包埋在石腊中。
组织制备和免疫组织化学。剪碎新切下的胰脏，清除脂肪和淋巴结，在Bouin氏固定液中固定，然后包埋在石腊中进行切片。按标准方法用精木精和曙红着染常规切片。对得自成年17周龄MT-TGFα（MT-42）转基因小鼠的胰组织进行胰岛素免疫染色，以检测TGFα过表达对胰岛发育的影响。使用免疫过氧化物酶染色豚鼠抗人胰岛素血清（Linco，Eureka，MO）着染TGFα诱导的组织变形小管中的胰岛素阳性细胞;用预免疫豚鼠血清作为对照。使用单克隆免抗胃泌素抗体，按Sternberger的过氧化物酶/抗过氧化物酶法对5μ石腊切片进行免疫组织化学检查（参见Sternberger，L.A.，Immunocytochemistry，2nd ed.1979，NY，Wiley，PP.104-170）。
点计数形态量度。使用Weibel，E.R.Lab.Investig.，12∶131-155（1963）中所述的点计数方法定量胰岛、导管或间质细胞的相对体积。使用25点目镜格栅，以400倍放大率，从切片的一个角的随机点处开始记录每个其他区域的点数。使用载物台测微尺的标志完成不偏而有规则的区域选择。减去血管、脂肪、导管、淋巴结或小叶间空隙截取的面积即得出总的胰腺面积。各组织块中最少以108个区域（使用载物台测微尺有规则选择的）计数5000个点，相对胰岛体积是以胰岛组织截取的点数除以胰组织的点数得出的。绝对胰岛质量是相对胰岛体积乘以胰组织重量计数出的（参见Lee，H.C.et al.，Endocrinology，124∶1571-1575，1989）。
统计学分析。使用针对不成对数据的Student试验来比较平均值间之差，求出有意义差值。
实施例1
检测TGF转基因胰中的胰岛素产生
免疫过氧化物酶染色显示TGFα转基因胰的组织变形导管中有大量的胰岛素染色细胞（图1A），而非转基因导管内则实际上没有胰岛素染色细胞（少于6.1%）。当以400倍放大倍数观察每只动物至少记录600个小管细胞时，在TGFα转基因小鼠的组织变型小管中则可以6.0+/-0.9%的频率（n＝5）看到胰岛素阳性细胞。偶有小管细胞以相邻胰岛胰岛素染色同样强度着染，但是大多数还是具有较小的着染强度（图1B）。小管细胞的低水平胰岛素染色与报导的发育胰之导管中原始分化细胞的着染水平相似（Pictet，R.and W.J.Rutter，Development of the embryonic endocrine Pancreas，in Endocrinology，Handbook of Physiology，ed.R.0.Greep and E.B.Astwood，1972，American Physiological Society:Washington，DC，PP.25-66;and Alpert，S.，et al.，Cell，53∶295-308，1988）。
然而，尽管组织变形导管中胰岛素阳性细胞的数目增加了，但并没增加TGFα转基因小鼠的胰岛质量。用点计数形态量度法定量，TGFα转基因胰脏中胰岛质量为2.14mg+/-0.84（均值±标准差，n＝5），此与非转基因的交配仔的1.93mg+/-0.46（n＝6）差不多。
对这些发现的一种解释是，TGFα过表达引起原始分化之前体增殖，但不能单独影响这些原始分化细胞向充分分化之胰岛的转变，分化要受到成年胰中所没有的其他因子的调节。
实施例2
INSGAS转基因得到的胰胃泌素表达
为了检验胃泌素在调节胰岛分化中的可能作用，培育可表达嵌合胰岛素启动子-胃泌素（INSGAS）转基因的转基因小鼠，所说的嵌合体中胰岛素启动子指导胃泌素转基因的胰特异性表达（图2A）。与胃泌素基因不同的是，胰岛素基因表达没有在出生后停止。因此，INSGAS转基因导致了成年胰中的持久性胃泌素表达。
INSGAS转基因包括5’侧翼DNA的370bp，和大鼠胰岛素I基因的第一个非编码外显子（Cordell，B.et al.，Cell，18∶533-543，1979）。将其连接到含有人胃泌素基因（编码前原胃泌素肽前体）之1.5Kb内含子1和外显子2及3的Bam HI-EcoRI片段上（Wiborg，O.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶1067-1069，1984;Ito，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶4662-4666，1984）。分离4.8Kb INSGAS片段并微量注射到纯系FVB单细胞小鼠胚胎（Hogan，B.et al.，Manipulating the mouse embryo:A laboratory manual，1986，NY，Cold Spring Harbor）。
使用对胃泌素的生物活性酰胺化C末端特异的抗血清2604（Rehfeld，J.et al.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，30∶361-368，1972），以放射免疫法检测转基因和非转基因小鼠之胰和胃提取物中的胃泌素免疫反应活性。
基于胃泌素单克隆抗体对胰组织的免疫染色来观察由INSGAS转基团导致的β细胞特异性胃泌素表达。
将分离自8周龄INSGAS转基因小鼠之不同组织的RNA的Northern印迹与人胃泌素外显子2探针进行杂交。只在胰中而不是任何其他组织中见有高水平的胃泌素转基因mRNA。该探针是对人胃泌素基因特异性的;在INSGAS转基因小鼠的窦RNA中未见有杂交现象，且非转基因FVB小鼠表达了高水平的小鼠胃泌素mRNA。对INSGAS转基因小鼠之胰提取物的放射免疫检测显示，高水平的胃泌素免疫反应活性超过了胃窦中由内源性小鼠基因表达的胃泌素含量（图2B）。在非转基因对照小鼠的胰提取物中未测得胃泌素免疫反应活性。胃泌素放射免疫检测法是对羧酰胺化前体特异的，此表明胃泌素肽前体在转译后被有效地加工成生物活性肽。用胃泌素单克隆抗体完成的免疫组织化学分析显示胰β胰岛细胞特异地表达胃泌素（图2C）。
虽然INSGAS转基因小鼠在新生后胰中具有胃泌素的高表达（图2B），但INSGAS转基因小鼠有与对照组动物完全相同的胰组织学特征。5-6周龄INSGAS小鼠（1.78+/-0.21mg，n＝11）和相同周龄的非转基因对照小鼠（1.74+/-0.19mg，n＝11），用点计数形态度量法定量的胰岛质量是相同的（Weibel，E.R.，Lab Investig.，12∶131-55，1963）。因此，单单是出生后胰中的胃泌素继续表达并不能刺激胰岛细胞生长。
实施例3
TGFα和TGFα/INSGAS胰的组织学检查
胃泌素刺激胰岛生长可能需要有其他生长因子的刺激，以产生反应性细胞群体。因此，在具有组织变形导管的TGFα转基因小鼠体内研究胃泌素刺激作用的效果，其中组织变形导管含有相似于原始分化之胰岛前体的胰岛素表达细胞。为了估计胃泌素和TGFα间的相互作用，繁殖三组有相等FVB/CD1品系遗传背景的小鼠：非转基因对照组、单一TGFα转基因组和双重INSGAS/TGFα转基因组。于3周龄时将所有三组小鼠置于50mM ZnCl2上。于17周龄杀死动物并切除胰腺进行组织学评估。TGFα和INSGAS/TGFα小鼠的胰腺具有相似的大体形态学表现，与柔软松散的对照组胰腺相反，这些胰组织富于弹性、组织坚实而且致密。用Northerm印迹分析法（数据未示出）和放射免疫检测法测知TGFα和INSGAS/TGFα组小鼠的TGFα表达是等同的。TGFα和INSGAS/TGFα小鼠中，胰TGFα免疫活性肽水平分别为12.2+/-1和18.9+/-8ng/mg蛋白质（均值±SD）。
制作出所研究的三组小鼠（A：INSGAS/TGFα;B：FVB/CD1对照组;C：TGFα）胰腺的苏木精染色石腊切片的光照显微镜照片。INSGAS/TGFα胰腺有某些区域增加了小管复合物并稍微增加了间质细胞化;5只动物中所示的区域（图3A）具最为严重的形态学异常;大多数胰腺则不能与对照组分辨开（图3B）。相反，TGFα胰腺区域（图3C）呈现一般状况，并显示出结合有Jhappan等人（文献同上）所述之鲜明的小管组织转化相结合的间质细胞化和纤维变性（文献同上）。
胰胃泌素与TGFα相互协同作用以增加胰岛质量，并抑制由TGFα过表达所诱导的小管组织转化。使纯合MT-TGFα（MT-42）小鼠（TGFα）与杂合INSGAS小鼠交配，得到杂合TGFα单一转基因或含有INSGAS与TGFα两种转基因（INSGAS/TGFα）之双重转基因的子代。因为INSGAS是FVB品系的，而TGFα是CD1品系的，所以对于所有三组小鼠来说，TGFα纯合小鼠和CD1对照小鼠（CON）两者与FVB交配即产生出FVB/CD1品系背景。从3周龄到17周龄杀死动物时，用50mM ZnClz处理小鼠。切除胰脏，称重，相似地定向在暗盒内，在Bouin溶液中固定并在石腊中包埋之。使用来自每只动物的一个随机切片，以点数形态度量法（Weibel，E.R.，Lab Investig，12∶131-155，1963）定量小管和胰岛的相对体积。在放大170倍时，以50点格栅截取，来计数组织上至少2000个点;在没有重迭的条件下复盖整个切片。将相对体积乘以动物的胰腺重量，计算出小管和胰岛的质量。为使不同的平均体重标准化，以μg/g体重为单位来表示质量。结果为每组5-6只动物的平均值加标准误差。＊P＜0.05（Student不配对数据）。
由INSGAS转基因表达胃泌素降低了TGFα过表达引起的小管组织变形。在17周时，INSGAS/TGFα小鼠的胰组织学改变相似于对照胰（图3B），而多于TGFα小鼠的胰组织改变（图3C）。
这一点可通过用点计数形态度量法定量TGFα和INSGAS/TGFα转基因小鼠和FVB1/CD1对照组的胰小管质量得以证实（图4A）。与对照组相比，INSGAS/TGFα胰腺中胃泌素和TGFα的共表达也显著地增加了胰岛质量（图4B），而单独TGFα或胃泌素转基因的表达则没有增加胰岛质量。三组小鼠间的血葡萄糖浓度没有显著差异。
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