抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法.pdf

本发明提供一种抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法，其包括用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，即构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；将构建的载体导入乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；利用制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。从制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。本发明的生物反应器可以大量、稳定和高效地制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸，实验表明本发明制备的抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸可以在HCV感染者体内招募沉默复合体，特异性切割HCV基因组，从而杀灭病毒。

1.  一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；
(3)利用步骤(2)制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体还包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、sl-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。

3.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。

4.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒；
(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导入乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。

5.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛胚胎干细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛；优选地，可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系。

6.  一种抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导人受体细胞，所述受体细胞为乳牛受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；
(3)利用步骤(2)制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

7.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述载体还包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、sl-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。

8.  根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

9.  根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒；
(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导入乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

10.  根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛胚胎干细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛；优选地，可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法以及利用该生物反应器制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的方法，通过建立能够特异性表达针对丙型肝炎病毒基因组的干扰核糖核酸(siRNA)的乳腺生物反应器，为治疗丙肝的siRNA药物的研制和生产奠定基础。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus)简称丙肝病毒(HCV)，于1978年被发现，其由外壳和其中的单链RNA组成。1989年，HCV基因组序列被首次获得。HCV主要经血源传播，此外还可以通过其他方式传播，如母婴垂直传播和性传播等。HCV感染可引发丙型肝炎，但发病机理仍不十分清楚。临床观察资料表明，人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，临床上50％的丙型肝炎病人可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会发展为肝硬化及肝细胞癌。
目前尚无针对丙型肝炎的疫苗，唯一的预防措施是防止血液接触。被发现感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干扰素α-2a或α-2b(peginterferon)联合病毒唑(ribavirin)治疗。这也是迄今为止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干扰素与病毒唑单独和/或联合使用治疗丙型肝炎带来的毒副作用不容忽视，其在适宜人群和与其他药物联用方面也面临诸多限制。
近年来出现了多种辅助抗病毒药物治疗的新型技术，包括核酶技术、细胞内干扰性多肽或蛋白质疗法，以及DNA免疫疗法等。其中，核酶(ribozyme) 技术是指通过人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的单链RNA分子，例如发夹状核酶，与靶RNA中的互补序列特异性结合进而进行切割。在上述新型技术中，小干扰核糖核酸(small interfering RNA，缩写为siRNA)药物又是一大热点。RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导人与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解，从而导致基因表达沉默。此现象可对外来基因材料，如转位子、病毒等对基因组的破坏起到防御作用。通过RNAi机制，siRNA可特异性地、有效地沉默靶基因。已有研究证明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表现出抗病毒作用(Nat.Biotechnol.21(6)：639-644(2003)；S.B.Kapadia，et a1.Interference of hepatitis C virus RNA repli cation by short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)：2014-2018(2003)；J.A.Wilson.et al.RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(5)：2783-2788(2003)；A.P.McCaffrey，et a1.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.G.A.Coburn and B.R.Cullen.Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type1replication by RNA interference.J.Virol.76(18)：9225-9231(2002))。
虽然使用siRNA治疗丙肝的疗效前景乐观，但仍需克服诸多方面的技术难题，包括siRNA的靶向性有效释放、siRNA的制备等。目前，制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶切长链dsRNA法、siRNA表达载体法和PCR表达框法。这些方法普遍存在产出率较低、生产成本较高的缺点。
动物乳腺生物反应器的研究则始于1987年，Gordon等将组织型纤溶酶原 激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠。同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶(AAT)的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。Simons等(Simons等，1987年)将带MT启动子的β-乳球蛋白-凝血因子IX(BLG-FIX)、BLG-AAT等重组DNA片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。Wilmut等将羊乳球蛋白基因片段与F-IX和AAT-cDNA融合质粒注入小鼠及绵羊受精卵中，获得乳汁中含F-IX和AAT的转基因小鼠及绵羊。Wright等将绵羊BLG基因调控区与人AAT基因相连，获得了4只转基因绵羊。Velander等利用WAP基因启动子与人蛋白质C(hPC)cDNA重组基因获得转基因猪，重组hPC的表达量(1g/L)此人血中hPC浓度还高200倍。Ebert等用β-CA基因的启动子引导tPA在山羊乳汁中得到表达(1-3g/L)。Wilmut等(Wilmut等，1997年)首创体细胞克隆r1并表达人F-IX的转基因克隆绵羊。2000年，英国PPL公司将人类AAT基因定点整合到胎儿成纤维细胞的前胶原基因座上，用转基因细胞生产转基因打靶绵羊(McCreath等，2000年)；2001年，他们又利用基因打靶技术生产出了AAT、3-GT和朊病毒双剔除的克隆绵羊。上述研究可以看出，从模式动物-小鼠的转基因研究开始，研究人员逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。
发明内容
目前，治疗HCV感染采用的干扰素和核苷类似物普遍存在副作用较大，疗效不理想，且几乎不可避免出现病毒耐药变异性等缺陷，而自上世纪90年代兴起的RNAi技术以其对病毒抑制作用的靶向性、特异性和高效性，为HCV 感染的治疗带来新的希望。但是，现有RNAi技术所必需的siRNA的制备技术尚存在产出率低和生产成本高等缺陷，而动物乳腺生物发生器技术以其天然、高效和低成本的特征，可以克服上述siRNA制备技术的缺陷。本发明人将目光锁定在牛乳腺生物发生器在生产抗HCV siRNA方面的应用前景，通过转基因技术形成可在牛乳中表达抗HCV siRNA的乳牛，使其稳定而高效地生产抗HCV的siRNA，为HCV的基因药物研发提供稳定的物质基础。具体来说，将外源目的基因导入乳牛基因组并定位表达于牛乳腺中，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌有机物的能力，从牛乳中生产出具备抗HCV能力的siRNAs。
本发明所述的生物反应器是指采用转基因方法将外源性目的基因转入生物，例如乳牛，形成的能够分泌外源性目的基因产物的生物体，例如乳牛。
本发明提供一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；具体来说，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸为能够导致丙型肝炎病毒基因组发生特异性降解的小干扰核糖核酸；
(2)将步骤(1)构建的载体导入受体细胞，所述受体细胞为乳牛受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；
(3)利用步骤(2)制得的受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。
在上述生物反应器中，载体还可以包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、s1-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。
在本发明的一个实施方案中，上述生物反应器的制备方法采用显微注射法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。
在本发明的另一个实施方案中，上述生物反应器的制备方法采用逆转录病毒法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒。
(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导人乳牛受精卵细胞；这样包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒基因被整合到乳牛受精卵细胞的基因组。
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。
在本发明的又一个实施方案中，上述生物反应器的制备方法采用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛胚胎干细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛。优选地， 可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系。
对上述技术方案获得的转基因乳牛的遗传性能进行观察和研究，结果显示这些转基因乳牛均可以作为生物反应器高效、稳定地生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。
本发明还提供了一种抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；具体来说，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸为能够导致丙型肝炎病毒基因组发生特异性降解的小干扰核糖核酸；
(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；
(3)利用步骤(2)制得的受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。
在上述制备方法中，载体还可以包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、s1-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。
在本发明的一个实施方案中，上述制备方法优选采用显微注射法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受精卵细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并 获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。例如，采用超滤和/或差速离心法从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸
在本发明的另一个实施方案中，上述制备方法采用逆转录病毒法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒。
(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导入乳牛受精卵细胞；这样包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒基因被整合到乳牛受精卵细胞的基因组。
(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛；
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。
在本发明的又一个实施方案中，上述制备方法采用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)法，具体包括以下步骤：
(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛胚胎干细胞；
(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛；优选地，可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系。
(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。
对上述技术方案获得的转基因乳牛的遗传性能进行观察和研究，结果显示这些转基因乳牛均可以作为生物反应器高效稳定地生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。
本发明制备的生物反应器可以大量、稳定和高效地制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸，实验表明本发明制备的抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸可以在HCV感染者体内招募沉默复合体，特异性切割HCV基因组，从而杀灭病毒。可以将其制备成药物，例如注射剂；食品，例如乳制品以及保健品用于丙型肝炎病毒患者或者HCV病毒感染者的治疗。也可以将其应用于受体细胞，包括被HCV感染的细胞株、细胞系、细胞原代培养物或组织，进行HCV的研究和实验。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1构建的载体的结构示意图。
具体实施方式
可以理解的是，在此描述的特定实施方式是通过举例的方式来说明的，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认.仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本发明所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
实施例1
为了使siRNA表达基因插入到受体细胞中，本实施例通过构建siRNA永久性表达载体，用其转染宿主细胞，同时选择载体成功插入到宿主细胞基因组的转基因克隆，为转基因乳腺生物发生器的建立奠定基础。
具体步骤包括：
(1)针对HCV病毒基因组，人工合成的编码siRNA的序列；
(2)构建慢病毒载体：将人工合成的编码siRNA的序列插入到病毒载体pLenti6.3/V5-DEST(invitrogen，美国)，构建重组载体。载体结构示意图如1所示；
(3)病毒包装：采用重组载体转染293T细胞以包装病毒。具体包括以下步骤：
1)293T细胞(美国标准菌种收藏所，American Type Culture Collection，)的培养：在添加10％胎牛血清(Gibco，美国)的高糖DMEM培养基(Gibco，美国)中5％CO₂、37℃下培养293T细胞。
2)将合适数量的细胞接种于4×10cm培养皿，过夜培养。
3)用包装质粒(Invitrogen，美国)和病毒载体共转染；
4)换液，继续培养；
5)收集病毒液；2000g离心10分钟去除细胞及碎片，并过0.45μm滤膜，获得病毒原液，浓缩病毒液，重悬于400μl培养基中。
6病毒活性滴度的测定：将HEK293细胞(美国标准菌种收藏所，American Type Culture Collection)接种于96孔板，梯度稀释病毒液，加入HEK293细胞中，72小时后观察带GFP荧光的细胞，计算病毒活性滴度。HEK293细胞 采用添加了10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，美国)，在5％CO₂、37℃下培养。
(4)病毒侵染及单克隆阳性克隆筛选。具体包括以下步骤：
1)培养受体细胞，具体为牛早期胚胎细胞；
2)将合适数量的细胞接种于培养皿，过夜培养；
3)用前期制备的病毒侵染受体细胞；
4)换液，继续培养；
5)加抗性筛选(必要时采用流式分选阳性细胞)；挑多个单克隆筛选阳性克隆；
6)得到基因整合成功的受体细胞。