本发明涉及重组生长因子及其合成方法，尤其涉及具有表皮生长因子生物活性的重组分子。 各种多肽生长因子已由不同的哺乳类动物中分离得到，并且具有广谱活性，其中表皮生长因子（EGF）和转移生长因子（TGFα）已经进行了广泛深入的研究。
表皮生长因子涉及多种活性，包括促进肠子成熟，从而刺激幼龄动物的生长，以及伤口的愈合。
Moore及其同事们（1982a，b;1983）业已发现，表皮生长因子是一种非常有希望的脱羊毛剂。
羊注射鼠表皮生长因子（mEGF）后，可使羊毛纤维变得很松软，因此很容易迅速地手工去除全部羊毛（Moore等，1983）。采用这种方法可以期望避免传统的剪羊毛方法中所需昂贵的劳务费用和伤害羊的危险。但是从老鼠涎腺中纯化得到的表皮生长因子的量非常有限，费用也过高。
后来在大肠杆菌中通过重组手段产生鼠表皮生长因子的方法的成功，促进了在羊体内进行大量的研究（Allen等，1985;1987）。
这种制备重组鼠表皮生长因子的方法受到许多限制。首先，为了得到稳定的细胞内产物的高水平的表达，需要将鼠表皮生长因子制备成一部分大的融合蛋白，由于该产物仅约含15%的鼠表皮生长因子，其余均为非表皮生长因子载体蛋白。因此，需要表达非鼠表皮生长因子部分减少的融合蛋白。在控制tac启动子-操纵子和具有TrpE核糖体结合位点的条件下，制备Met表皮生长因子和超过表皮生长因子6或7个N端的结构，但是检测不到表达，这是由于宿主细菌中蛋白质迅速分解地缘故（Allen，私人通讯）。其次，融合蛋白必须用特殊的酶或化学方法予以裂解。尽管作了种种认真的努力，将对各种裂解剂敏感的顺序结合到邻近表皮生长因子的顺序（Allen，私人通讯），这项足够有效和专门的技术是使用赖氨酸特异蛋白酶，但也不能在化学上改变鼠表皮生长因子本身，这证明非常不易，而且酶也不能得到可靠的供给。
业已证明，TrpE-表皮生长因子的融合失去了生物活性（参阅本说明书表3），这说明融合蛋白需要裂解。已经发表的工作证明，相关的生长因子TGFα是在体内产生的，这是一种大的前体分子。其大小约为TGFα1的3倍。然而TGFα生物活性仅为游离生长因子活性的1-2%。这说明类似大融合可能也相对失去生物活性（Brachmann等，1989）。
就脱羊毛方法而言，采用该方法生产重组的或质粒衍生的鼠表皮生长因子（rec-mEGF）的费用远高于开发市场商品所容许的费用。其他许多研究工作者也已研究了生产重组体表皮生长因子的方法（例如Oka等，1985;Smith等，1982;Urdea等，1983;Sumi等，1985）。然而这些方法的费用也都很高，一般说来适宜于生产每单位表皮生长因子的价格可以显着高于脱羊毛用的表皮生长因子的那些产品。
已知上述的一个例外是日本专利6240924，其要求保护高水平的表达，但是在明显相似内容的文献中（Oka等1985），却报导了低水平的表达。因此，看来该专利的方法可能仅仅取得部分的成功。
表皮生长因子的应用并不限于脱除上述的绵羊毛，也可应用于其他动物的脱毛，例如可用于收获山羊和兔子的毛，骆驼科动物的毛（如羊驼，无峰驼或骆马），以及在屠宰前去除牛、鹿和猪的鬃毛或其他皮毛。
将表皮生长因子由母体的奶中转移到幼龄哺乳动物，能起到促进肠子生理成熟的作用。对幼龄动物施用表皮生长因子可以加速其成熟，因此可以加速小猪和其他动物的早期生长和提早断奶。在医学上，人表皮生长因子可以促进胃溃疡的愈合，还可用于皮肤和眼睛的伤口愈合。在动物治疗方面，也可进行类似的施用，例如为了避免羊两腿间绿绳叮咬而切除过份松驰的皮肤后，可以加速由此引起的伤口的愈合，尤其是马或狗的溃疡和伤口的愈合。生长因子还可用于细胞和组织的合成或半合成培养基中，尤其用于含有少量血清或不含血清的培养基中。
本发明提供的分子涉及表皮生长因子，但结构上与其不同，基本上具有类似的生物活性，但易于低成本大规模地进行生产。这些特征使这类分子特别适用于某些动物的治疗，可以广泛使用，但单位成本很低。此外，本发明还提供克服以往已知合成方法中存在的问题的方法，而又能连续在重组宿主细胞中大量产生。
虽然本发明着重介绍表皮生长因子，但是表皮生长因子（EGF）和转化生长因子（TGF）之间顺序的同源性说明，本发明还可应用于TGF，应理解为这也属于本发明的范围。
出乎意料的是我们已经发现，表皮生长因子能以衔接重复分子产生，而且该产物具有生物活性，不需要裂解融合蛋白或释放天然表皮生长因子。此外，该产物还能在大肠杆菌中以包涵体产生。
本发明的任务之一，在于提供重组DNA分子，其顺序能编码具有动物生长因子生物活性的蛋白（生长因子顺序），所述动物生长因子选自表皮生长因子（EGF）和转化生长因子（TGFα），所述重组DNA包括主要顺序和至少一个编码生长因子的顺序。
TGFα在结构和功能上与EGF相似，与EGF一样，TGFα具有3个链内二硫键（Marguardt et al，1983 & 1984;Massague，1983a;Smith et al.，1985;Lee et al.，1985）。通过若干离体分析，说明TGFα在功能上与EGF可以互相取代（Pike et al.，1983;Massague，1983b;Derynck et al.，1984;Tam et al.，1984）。在本文中术语TGF也应被视为TGFα。
当编码生长因子的顺序多于一个时，这些顺序相互连接。生长因子最好源于哺乳动物，尤以源于羊、鼠、人或猪为佳。
编码生长因子顺序的适宜数目为1-30个，1-10个较好，1-5个更好，尤以1-2个为最佳。
主要顺序可由各种来源得到，例如可源于质粒或其他有机体，也可进行合成。主要顺序的适宜长度为1-50个氨基酸，12-50个氨基酸较好，15-30个氨基更好，尤以21个氨基酸为最佳。
本申请说明书中所述“生长因子顺序”意指编码具有鼠、其他哺乳动物或鸟类生长因子生物活性的蛋白的DNA顺序，该顺序可以是天然的，也可以是合成的。生长因子应理解为包括等位的、突变的、减短的、延长的或其他各种形式。采用本领域中的常规方法都可得到各类形式的生长因子，例如采用位点诱变剂，限制酶，连接酶，寡核苷酸合成方法。例见Maniatis等编着的一书（1982）。
本发明的任务之二，在于提供含有上述重组DNA分子的质粒。质粒尤以下面将要详述的pCW9-RI为佳。
本发明的任务之三，在于提供由含上述重组DNA分子的质粒转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，但以细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞较好，大肠杆菌则更好，出乎意料的最佳宿主细胞为lac Ⅰσ-（-）株的大肠杆菌，例如BL21，HB101和N5151。业已证明，某些菌株是不适宜的，例如SG936，DH5。本领域的专业人员能很容易通过常规的筛选方法确定适宜的宿主细胞。
本发明的任务之四，在于提供合成具有选自EGF和TGF的动物生长因子生物活性的蛋白的方法，包括将含有上述重组DNA的微生物或细胞系培养在可同化的营养物质中，分离由微生物或细胞系产生的生长因子，以及回收具有活性的生长因子。
本发明的任务之五，在于提供上述质粒的合成方法，该方法包括下列步骤：
（a）用核酸内切限制酶裂解含编码具有选自EGF和TGFα动物生长因子生物活性蛋白的顺序的DNA顺序（生长因子顺序），切断所述的生长因子顺序;
（b）用同样的核酸内切限制酶裂解表达质粒;
（c）用DNA连接酶将至少一个生长因子顺序插入已裂解的表达质粒;
（d）回收重组质粒。
步骤（a）中的DNA顺序最好是一种质粒，尤以pEGF3为最佳。
较好的方法包括下列步骤：
（a）用核酸内切限制酶消化含编码EGF或TGFα的DNA顺序的质粒，切断编码EGF或TGFα的顺序或其生物活性片段;
（b）用同样的核酸内切限制酶消化表达质粒;
（c）纯化步骤（a）和（b）的产物;
（d）将所述产物混合和连接;
（e）用连接的混合物转化微生物;
（f）鉴定编码EGF或TGFα顺序是否正确位置上的转化株;
（g）用核酸内切限制酶消化含编码EGF或TGFα的DNA顺序的质粒，切断编码EGF或TGFα顺序或其生物活性片段;
（h）用同样的核酸内切限制酶消化步骤（d）的产物;
（i）将步骤（g）和（h）的产物混合，通过N端和/或C端上短外顺序的两侧连接形成编码一个或多个EGF或TGFα的衔接拷贝或其生物活性片段;
（j）回收由此形成的质粒。
最好步骤（a）中的质粒是pEGF3，步骤（b）中的质粒是pUC19，步骤（a）和（b）的产物在步骤（d）中用DNA连接酶连接，步骤（c）中的微生物是大肠杆菌，步骤（g）中的质粒是pWRL525。
在一个特别优选的实施例中，质粒合成方法包括下列步骤：
（a）将质粒pEGF3用核酸内切限制酶消化，切断EGF编码片段;
（b）将质粒pUC19用同样的核酸内切限制酶消化;
（c）纯化所述EGF编码片段和经过消化的5′-磷酸盐裂解的pUC19;
（d）混合经纯化的产物，并将其用DNA连接酶连接;
（e）用连接的混合物转化宿主微生物;
（f）鉴定具有EGF片段的重组质粒是否在正确的位置上（pUC19-EGF）;
（g）将质粒pWRL525用核酸内切限制酶消化，并纯化由此产生的EGF片段;
（h）将pUC19-EGF用与步骤（g）相同的核酸内切限制酶消化，并纯化由此产生的片段;
（i）混合EGF片段和pUC19-EGF，并用T4 DNA连接酶连接，产生质粒PCW9;
（j）回收质粒pCW9。
步骤（a）和（b）中的核酸内切限制酶最好是EcoRⅠ。
步骤（g）和（h）中的核酸内切限制酶最好是BstEⅡ。
步骤（b）中的消化也可以用碱性磷酸酶处理，防止再连接。
本发明的任务之六，在于提供去除动物体上的皮毛，该方法的步骤包括给所述动物施用有效量的新的上述去毛重组EGF或由其所产生的EGF。
为了方便起见，下面将着重介绍鼠表皮生长因子（mEGF），但是应明确地理解为本发明同样也适用于其他EGF和TGFα。
简要地说，所产生的mEGF是一种衔接二聚体，其中在2个mEGF顺序之前是1个由细菌质粒DNA编码的氨基酸短顺序。与由许多其他短融合蛋白所得结果相反，该产物是在大肠杆菌中有效地产生的，并且非常稳定。此外，其主要是由mEGF顺序组成，因而极少产物被废弃。出乎意料的是如同mEGF一样，该产物几乎在分子对分子的水平上具有生物活性，使被融合的二聚体mEGF的裂解不需要释放天然的mEGF。应该注意的是含EGF的常规融合蛋白并无生物活性。在生物测定中，已经证明TrpE-EGF和谷胱甘肽-S-转移酶-EGF没有活性（分别参阅表3和6）。最后，还发现该产物在细菌细胞中几乎是不溶解的包涵体。这就可以有效地收集和在早期进行纯化。
mEGF衔接二聚体即以上所述的“蛋白-pCW9”的发现是出乎意料的。为了生产非融合mEGF、其他的含mEGF的短融合多肽和含mEGF多重衔接拷贝的长融合蛋白，进行了一系列的试验，在不同产物之间，大肠杆菌中的表达水平差别很大，但任何一种方法都不涉及分子量或mEGF拷贝数。根据与低分子量相一致的高水平表达，选择了较佳产物“蛋白pCW9”，而且无需进行任何裂解但却具有生物活性。
现就参考下述非限制性实施例和附图说明本发明，附图说明如下：
图1 表示由pWRL525和pEGF3构建质粒pCW9-RI;
图2 说明用于pWRL525起始原料的质粒pWRL500的结构;
图3 表示质粒pWRL525的构建;
图4 表示质粒pET3b-1和pET3b-2的构建;
实施例1：由质粒pEGF3和pWRL525制备质粒pCW9
起始遗传物质是由Wellcome Biotechnology Ltd.获得的质粒pEGF3、pWRL500和pWRL525和由Pharmacia South Seas Pty.Ltd.得到的质粒pUC19（Yanisch-Perron等，1985）。
所有其他原料，包括限制酶和其他酶均由商业途径得到，分析级试剂是可用由任何途径得到的试剂。
遗传操作方法基本按Maniatis等（1982）所述方法进行。
pEGF3由Wellcome Biotechnology Ltd.按G.Allen等（J.Biote chnology 5（1987）93-114，p.102）所述方法制备。pEGF3除一个碱基不同外，其他都与pEGF6相同。在pEGF6中编码Cys 42的密码子TGC，在pEGF3中已改为TGT。在由此改变所产生的编码氨基酸并没有任何改变。
pWRL500由Wellcome Biotechnology Ltd.按G.Allen等（J.Cell Sci.Suppl.3（1985）29-38）所述方法制备。设计该质粒是用于表达TrpE-lys-EGF融合蛋白（参阅图2）。
所有上述起始原料都可通过商业途径得到，也完全可按本文引用的参考文献所述方法制备。
pWRL525按图3所示由pWRL500制备，该质粒基本上为合成的寡核苷酸，当其与pWRL500的BstEⅡ/EcoRⅠ片段连接时，形成了编码EGF的C端部分的顺序，末端由Lys53取代Arg53，其后为EGF顺序的N端残余部分。该顺序通过BstEⅡ限制位点连接，标记为B-E-B（EGF），再由1-4拷贝插入到由BstEⅡ切割的pWRL500中。最终的结构含有1-5个EGF的衔接拷贝，其中1个是（Arg53）和残余部分（Lys53）。关于这个5拷贝结构，我们称之为pWRL525。
pCW9是由Wellcome所得的原料按下述方法制备的（参阅图1）：
1.用EcoRⅠ消化pEGF3，并经由琼脂糖电泳凝胶切下纯化EGF片段，然后用GenecleanTM处理;
2.用EcoRⅠ切割pUC19，并用牛肠碱性磷酸酶处理，除去5′端磷酸盐基团，从而防止再连接，按同样方法纯化;
3.将2个片段混合，并用T4DNA连接酶连接，连接后的混合物用于转化大肠杆菌株JM101;
4.以由pUC19得到多连接子区中的限制位点为标准，绘出内SphⅠ和BstEⅡ位点的位置图，鉴定含有插在正确位置上的EGF片段的重组质粒（pUC19-EGF）;
5.用BstEⅡ切割pWRL525，并纯化B-E-B（EGF）片段;
6.用BstEⅡ切割pUC19-EGF，并按同样方法进行纯化;
7.将2个片段混合，并用T4DNA连接酶连接，产生质粒pCW9-RⅠ。
所有上述步骤均采用本领域专业人员熟悉的标准常规方法和条件（参阅Maniatis，见本文引用的参考文献）进行。
实施例2：蛋白pCW9的制备
将质粒pCW9-RⅠ转移到大肠杆菌株JM101、JM109或XL-lBlue中。
用由pUC19衍生的并通过加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子产生表达。
还可以使用在结构上可进行表达的其他大肠杆菌株：BL21，BL21（DE3），BL21（DE3）plysE，BL21（DE3）plysS和DHS。
所有这些大肠杆菌株，对本领专业人员而言都很容易得到。
实施例3：转化细菌的培养
将由质粒pCW9-RⅠ转化的大肠杆菌株JM109（JM109（pCW9-RⅠ））培养在装有适宜培养基的发酵罐中（例见表1）。溶解氧保持在25%以上的饱和空气中，按需要加入2M NaOH，将pH保持在6.8。按基本需要量加入葡萄糖（5%）。
在收集前5小时，将IPTG加至最终浓度为0.2mM，促进pCW9的合成。所产生的蛋白质很难溶解，以包涵体形成几乎完全控制在细胞内。24小时后收集细胞。在pH7.2的0.03M磷酸盐缓冲盐水中（8g/L NaCl，0.8g/L KCl，1.15g/L Na2HPO4，0.2g/L KH2PO4）均匀化，再悬浮于水中。将尿素加到悬浮液中，最终浓度为8M。
将悬浮液离心，滗出碎片，将上清液涂在Q-琼脂糖柱（Pharmacia）上，再将该柱用8M尿素的NaCl（0-2.0M）洗脱溶液，用20mM Tris-HCl缓冲至pH6.0，含有pCW9蛋白（经SDS-PAGE）的部份经离心后，涂在经8M尿素的缓冲液平衡过的Sephadex G-75柱（Pharmacia）上。将峰值的各部份合并，通过透析过滤缓慢除去尿素。
实施例4：提取和纯化蛋白pCW9的另一方法
通过本领域已知的各种方法，收集和破碎细胞，包括使用机械匀化器或球磨机，或溶菌酶的内生生产。
根据所用的细胞破碎方法，需要用DNA酶处理减低粘稠度。在37℃下，用2mM MgCl2和0.2μg/ml DNA酶对匀浆温育2-3小时。
通过离心收集含包涵体的细胞浆，并用2体积的缓冲液B（10mMDETA，0.2M NaH2PO4，pH7.5）洗涤细胞浆，然后将其溶解于重量为包含物40倍的缓冲液C（6M尿素，5mM半胱氨酸，25mM碳酸氢钠，21mM碳酸钠，pH9.8）中。包涵物碎片用机械捣碎机充分分散。
在室温下，将溶液缓慢搅拌3小时，然后用1/2体积的缓冲液CB（25mM碳酸氢钠，21mM碳酸钠，pH9.8）稀释。在室温下缓慢搅拌24小时，将蛋白质氧化。
加入pH为9.0的20mM乙醇胺缓冲液（与缓冲液C体积相同）进一步稀释该溶液，继之先后通过100000标称分子量截止（NMWC）过滤器和10000 NMWC过滤器进行过滤。
半纯化的浓缩pCW9蛋白还可通过各种常规的层析方法进一步纯化，例如用离子交换层析法。
对本发明而言，还应该明确理解的是，用于提取和纯化pCW9的方法并不严格限制，本领域中许多可能取得本发明结果的方法都可使用。
能够进行纯化的蛋白pCW9的优点之一是其在宿主细胞中的溶解度很低，基本上限制在包涵体之内。
实施例5：离体pCW9蛋白的生物活性
将蛋白pCW9与ree-m EGF（Wellcome Biotechnology Ltd.）的生物活性进行比较。
对试验中的各种物质都在瑞士Albino 3T3静置纤维细胞生成器（国家血清实验室）中测定其在刺激DNA合成中的刺激作用。
将细胞连续培养在组织培养穴中，其培养基为经过Dulbecco改进的含有10%胎牛血清的3ml Eagles培养基（DMEM）。24小时后，用新鲜的DMEM稀释培养基，得到的最终血清浓度为1%。培养3天后，加入试验物质，测定其结合DNA的速率。pCW9蛋白的效果至少应与刺激胸苷结合中的EGF相同。胸苷结合完全被羟基脲抑制（Steinert，1969），该结合是测定DNA合成的方法。结果列于表2-5。
实施例6：pCW9蛋在鼠体内的活性
EGF能诱导幼鼠的生理应答。最明显的是加速出牙和眼睛张开，变化较大而通常又被公认的是皮毛的改变。皮肤上的皮屑、皮毛卷曲和皮毛生长降低都是表现出来的特征。所有这些作用都是由蛋白pCW9引起的，而且提前张开眼睛和长牙，完全类似于由rec-m EGF引起的那些特征。结果示于表6和7。
将EGF衍生物与Methocel A-15载体配制成配制剂，施用于羊。该标准载体按下述方法制备：
1.将18.375 g Methocel A-15分散在120ml热水（80-90℃）中;
2.加入240ml冷水，将该溶液冷却至5℃;
3.加入10ml苄醇后混匀;
4.加水混合至500ml。
将冻干的EGF衍生蛋白（例如pCW9）加到标准载体中，得到的最终浓度为1-10mg/ml。经Turrax超匀化器处理3分钟，使其分散。
实施例7：蛋白pCW9在羊体内的生物活性
按与rec-mEGF的同样方法和剂量范围，将蛋白pCW9施用于羊，在与rec-m EGF同样剂量使用时，可以看到所有相同的作用，即：食物吸入量短暂减少，在一周内羊毛纤维的稀少达到最高程度，因此很容易手工去毛。
结果示于表8和9。
在处理1至8中的蛋白pCW9制剂完全不同的纯化方法制备的，除制剂7外，所有制剂的活性都很高。应该注意的是制剂7在配制时产生严重的沉淀。
根据体内和体外的生物测定，本发明的重组EGF在活性方面完全可与已有技术的rec-m EGF相比拟，而且还可与天然的EGF相比拟。
实施例8：met EGF和met EGF二聚体结构的制备
蛋白pCW9在大肠杆菌中表达良好，而较短的类似物，例如含有与2个衔接拷贝的EGF相连接的质粒pUC18的3个氨基酸的蛋白质，表达却很差。此外，先前企图用tac启动子系统表达met EGF已告失败。然而出乎意料的是作为本发明的一部分，已经发现一种方法，能够在大肠杆菌中非常有效地表达含有与2个衔接拷贝的EGF相连接的蛋氨酸的蛋白（“met EGF二聚体”）。
成功的结果是由2个分离的因子中得到的。第一，启动子选择所起的作用。使用T7表达系统（Rosenberg，A.H.等，1987）使met EGF在大肠杆菌中显著地表达。第二，在相同的系统中，以显著高于met EGF的水平表达met EGF二聚体。
起始遗传物质pEGF3和pUC19已在实施例1中介绍过，pUC18与pUC19的来源相同。
pUC19载体通过在合成的小片段DNA中的克隆进行修饰，pUC19 DNA先用EcoRⅠ和SacⅠ消化，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶上切下大片段，并用GenecleanTM纯化。合成的DNA具有下列顺序：
5′CCATGGCTAGCCATATG 3′
3′TCGAGGTACCGATCGGTATACTTAA 5′
混合后，在适当的条件下用T4DNA连接酶连接经切割的pUC19载体片段（Maniatis，参阅本文引用的参考文献）。回收大肠杆菌株JM101中的转化株。形成的质粒pUC19-L用EcoRⅠ消化，并将由含EGF基因的pEGF3中的EcoRⅠ片段进行克隆。分析转化株中的DNA，并选择EGF片段已经插在pUC19 Lac启动子中表达所需正确位置的克隆（pUC19-2-1）。
在pUC18中进行类似的构建。将EGF EcoRⅠ片段插入在pUC18 Lac启动子中表达所需的正确位置中，得到质粒pUC18-8b。
用Eco 0109Ⅰ和BstEⅡ消化pUC19-1-1和pUC18-8b，将pUC18-8b的小片段与pUC19-L-1的大片段相连接，得到质粒pUC19-L-1-2。用酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ从pUC19-L-1-2上切下含EGF基因的片段，并将其连接到与已经由同样的酶消化过的质粒pET3b中。连接产生了能够表达met-EGF的质粒pET3b-1。通过用Bst EⅡ和连接含EGF基因的pWRL525的BstE Ⅱ片段，构建表达met-EGF二聚体（pET3b-2）的质粒（如同实施例1中pCW9-RⅠ的构建）。质粒pET3b-1和pET3b-2的构建说明示于图4。
实施例9：met-EGF和met-EGF二聚体的表达、提取和纯化
在pET3b-Ⅰ和pET3b-2中，met-EGF和met-EGF二聚体的表达分别在由T7 RNA聚合酶转录的启动子控制下进行的。因此，对需要表达的蛋白而言，质粒应用于能产生T7 RNA聚合酶的宿主细胞中。我们选择使用的宿主是BL21（DE3）（Rosenberg等，1987，参阅本文引用的参考文献）。在该菌株中，当加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶表达时，产生T7启动子的表达。
met-EGF和met-EGF二聚体的提取和纯化采用与纯化蛋白pCW9同样的方法（参阅实施例4）。met-EGF生物活性的测定如实施例7，并且已经发现其活性可与蛋白pCW9相比拟。
实施例10
为了有效地表达二聚体的EGF类似物及其出乎意料的生物活性，对具有大量EGF衔接重复的其他类似物进行了构建和研究。
表达相当于蛋白pCW9的蛋白但具有3，4和5拷贝数的EGF的质粒，可按类似于构建质粒pCW9-RⅠ（实施例1）的方法进行构建。其区别仅在于进行部份消化，而不是用Bst EⅡ将pWRL525完全消化。采用该方法，可以分离到含2，3和4个衔接拷贝的EGF基因的片段，并将其克隆到经Bst EⅡ裂解的pUC19-EGF中，得到具有3，4和5拷贝EGF基因的质粒（pUC19-11-4，pUC19-11-5和pUC19-11-6）。
由pUC19-11-4表达的EGF-三聚体蛋白基本上按与蛋白pCW9同样的方法（参阅实施例4）提取和纯化。该蛋白在羊体内也具有活性。
显然本领域的专业人员采用各种重组和合成DNA构建的方法，都能够制备本发明的重组生长因子，而且根据生长因子的重复数和N端附加（主要）顺序的长度和性质，所产生的重组生长因子能具有各种氨基酸顺序。
虽然我们还不能对精确的重复数或主要顺序的长度或性质的生物活性给予任何预测，但是能很简单地测定任何特定的氨基酸顺序是否能产生具有活性的生长因子。例如所需蛋白的量能用免疫测定方法进行测定，而其生物活性可用生物测定方法进行测定，这种最简单快速测定方法就是细胞有丝分裂测定法，例如上述实施例5所用方法。
阶层筛选法可用于测定：
（a）表达量;
（b）体外活性;
（c）体内活性。
其他适宜的方法也是本领域专业人员所熟知的，他们无需过多的试验即能鉴定具有“活性”的顺序。
应该明确地理解本发明的普通意义，而不限于上述特定的细节。
本文所引用的文献列后。
表1：适宜于表达蛋白pCW9的大肠杆菌株JM109生长的培养基
per L
（NE4）2SO420g
KH2PO43g
柠檬酸兰钠 0.5g
加
痕量元素溶液＊ 2ml
50% MgSO47H2O 3ml
50%葡萄糖20ml
0.2g/ml氨苄青霉素 1ml
＊痕量元素溶液 （g/L）
CaCl2·6H2O 20
FeCl·26H2O 25
CaCl2·6H2O 2.5
MnSO4·nH2O 5
ZnSO4·7H2O 5
（NH4）6MO7O24·4H2O 2.5
AlCl3·6H2O 5
CuSO4·4H2O 1
H3BO30.5
表2：蛋白pCW9对离体细胞的生物活性
（Swiss Albino 3T3 细胞系，DMEM+1%胎牛血清）
3H-胸苷的结合
（总量cpm） 刺激指数 P
处理 （Lord范围的测定）
对照
1.不加 13，966 1.00 -
2.尿素对照 13，936 1.00 -
rec-m EGF
1.10 ng/ml 24，059 1.72 ＜0.05
蛋白 pCW9
1.不纯制剂 26，353 1.89 ＜0.01
表3：在离体细胞中蛋白TrpE-EGF生物活性的缺失
（Swiss Albino 3T3 细胞系，DMEM+1% 胎牛血清）
3H-胸苷的结合（总量cpm） 刺激指数
处理
对照 12，632 -
EGF（10ng） 34，495 2.73
TrpE-EGF（10ng） 12，228 -
TrpE-EGF（100ng） 13，317 -
表4：蛋白pCW9在离体细胞中的生物活性
（Swiss Albino 3T3 细胞系，DMEM+1% 胎牛血清）
3H-胸苷的结合
刺激指数
处理 （受羟基脲的抑制）
对照
1.不加 6，938 （1.00）
2.对照细菌产物（a） 4，046 0.58
3.对照细菌产物（b） 4，044 0.58
rec-m EGF
1.10 ng/ml 12，417 1.79
2.1000 ng/ml 5，690 0.82
蛋白 pCW9
1.250 ng/ml 15，754 2.27
（a）含有β-半乳糖苷酶和牛蜱蛋白顺序的融合蛋白。
（b）重组β-半乳糖苷酶。
表5：蛋白pCW9在离体细胞中的生物活性
（Swiss Albino 3T3 细胞系 in DMEM+0.25% 胎牛血清）
3H-胸苷的结合
刺激指数
处理 （受羟基脲的抑制）
对照
加缓冲液 1，850 1.00
rec-m EGF
1 ng/ml 3，667 1.98
0.3 ng/ml 3，430 1.85
0.1 ng/ml 2，343 1.27
蛋白 pCW9
次数 14
1 ng/ml 3，004 1.62
0.3 ng/ml 3，609 1.95
0.1 ng/ml 3，439 1.86
次数 2，28/5
1 ng/ml 4，465 2.4
0.3 ng/ml 2.685 1.45
0.1 ng/ml 1，725 0.93
表6：蛋白pCW9在新生鼠中的生物活性
组（n-3）
1
窝 其他 剂量 出牙天数 张眼天数
3 对照-未处理 10 13/14
1 pCW9-a 12 μg x 4 9 10/11
3，4，5，6天龄 2 pCW9-b 12 μg x 4 9 10/11
3 pCW9-c 12 μg x 4 9 9/10
的剂量 4 pCW9-d 12 μg x 4 9 10
15 对照1-未处理 11/12 14/16
1 1β-a半乳糖苷酶 10/12 14/16
3，4，5，6天龄 2 1大EGF 融合-a211 14/16
3 1大EGF 融合-b 11/12 14/16
的剂量 4 大融合的对照311/12 14/16
21 对照-未处理 10 14
1，2，3，4天龄 rec-mEGF 12 μg x 4 7 9/10
的剂量
1.仅测定（不纯制剂）
pCW9-a，-b，-c，-d是不同次数的蛋白pCW9。
用pUR288在细菌中产生β-半乳糖苷酶。
2.大EGF融合-a，b是含有与EGF顺序融合的谷胱苷肽-S-转移酶的融合蛋白δ。
3.大融合对照是含有与牛蜱蛋白顺序融合的谷胱苷肽-S-转移酶的融合蛋白。
表9：蛋白pCW9在羊体内的生物活性
羊的处理＊ 去毛效率（5个读数的平均值）N/ktex
No. 剂量 天数，剂量
μg/kg -4 0 +6 +10 +14 121
650 1-120 8.81 11.78 2.01 2.19 0.85 0.37 去毛
647 1-150 7.67 9.52 3.57 2.72 1.99 0.63
669 1-300 10.85 13.62 4.38 2.16 0.75 0.21 去毛
666 2-150 7.38 7.21 2.02 0.93 0.39 0.72
646 3-120 6.86 6.29 1.88 0.68 0.31 去毛
645 3-150 7.68 7.95 1.72 1.79 1.38 1.06 去毛
659 3-300 7.52 8.77 1.97 1.66 0.88 去毛
658 4-120 6.29 7.92 0.91 0.20 去毛
677 4-150 14.79 13.51 2.08 1.01 0.24 去毛
668 4-300 6.31 6.40 1.70 0.97 0.63 0.61
679 5-150 11.86 15.95 4.83 1.73 1.31 2.09
663 6-136 11.19 10.56 0.55 0.70 去毛
674 7-120 14.54 15.88 14.17 21.33 16.59 20.61
654 7-150 7.94 6.70 7.20 6.96 8.09 8.68
657 7-300 7.49 7.06 5.89 6.02 5.32 6.00
676 8-120 7.47 8.62 1.68 0.81 去毛
665 8-150 6.86 6.89 2.85 1.48 0.77 0.31
667 8-300 9.94 11.29 2.21 1.51 0.53 去毛
＊连字符号“-”前的数字（1-8）表示所用蛋白pCW9制剂（参阅说明书）。
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