氮离子注入的三维自组装石墨烯的制备方法及其应用.pdf

本发明提供了一种氮离子注入的三维自组装石墨烯的制备方法及其应用。该方法用水热法合成的三维自组装石墨烯作为基底，使用湿态切片与冷冻干燥结合的方式对三维石墨烯进行形态改造，然后使用离子注入机在三维自组装石墨烯切片上引入氮离子。该材料在充分利用三维石墨烯的立体结构的同时，为细胞及其表面活性蛋白提供了丰富的结合位点，使得该材料可作为组织支架等在生物医学材料领域广泛应用。

1.  氮离子注入的三维自组装石墨烯，其特征在于它的孔径大小范围在5～15 μm，2μm量级观察下可以看到明显的石墨烯片状结构，氮含量在0.6%-4.24%之间。

2.  权利要求 1所述氮离子注入的三维自组装石墨烯的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行： 
（1）将湿态的三维自组装石墨烯直接切片，切片厚度2-3.2 mm；然后吸干表面水分在0℃以下冷冻12 h以上；最后在-40 ℃至-80 ℃，小于10 Pa的条件下冷冻干燥10-48 h；
(2)氮离子的注入密度为1×10¹⁶ - 1×10²⁰个/ cm²；离子能量为5-25keV；所述材料中氮原子的百分数为0.6% - 4.24%。

3.  权利要求1所述氮离子注入的三维自组装石墨烯在制备作为组织支架生物材料方面的应用。

4.  权利要求3所述的应用，其中作为组织支架生物材料方面的应用指的是：提高细胞在材料表面的粘附和生长；改善材料的亲水性能和蛋白吸附性能；提高材料本身的生物相容性。

氮离子注入的三维自组装石墨烯的制备方法及其应用
本发明得到国家自然科学基金资助项目(51272176)；国家高技术研究发展计划项(863，No. SS2015AA030802)；国家重大科学研究计划资助项目(2012CB933600)的资助。
技术领域
 本发明属于离子修饰的三维石墨烯在生物医用材料中应用的新型学科领域。涉及使用离子注入机将氮离子注入三维自组装石墨烯表面，以达到使其作为组织支架材料应用于生物医学领域的新技术。
背景技术
石墨烯是一种由碳原子以sp²杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，仅有几个至几十个碳原子厚度的二维材料。三维石墨烯作为二维石墨烯材料的宏观体，由二维石墨烯堆叠形成。三维石墨烯在2009年由Vickery和Wang两个团队分别独立完成制备。目前常用的三维石墨烯制备方法分为自组装法与模板法两类。本发明选用水热合成自组装法，利用氧化石墨烯O离子与水中的H离子之间的离子力及范德华力形成微米级孔洞，搭建三维石墨烯宏观体。
自三维石墨烯问世以来，它巨大的比表面积、微米级的孔洞结构、良好的机械、电性能即受到科学界的追捧。但对它的应用研究，目前则主要集中在以储能材料为代表的电化学领域，鲜有研究涉及其生物学性能。而使用离子注入技术对其进行表面活性修饰，并将这一复合材料应用于以组织支架为代表的生物医学领域则未见报道。
本发明利用三维自组装石墨烯在结构上具有丰富孔隙的优势，为细胞生长与增殖提供丰富的立体空间；又通过离子注入方式引入氮离子这一生物活性基团，在生物性能角度克服了石墨烯疏水性、易团聚、生物相容性差的缺陷，使氮离子注入的三维自组装石墨烯具有良好的细胞相容性，为三维石墨烯的生物学应用提供了开创性引导。同时，三维自组装石墨烯是通过自组装成型的，体直径平均值为1.2 cm，高度平均值为1.7cm的固定形貌柱体直径。本发明提供了一种在不破坏其三维结构的条件下对其进行形貌加工的方法，改进后的氮离子注入三维自组装石墨烯有效拓展了三维石墨烯的应用领域。
表1自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯生物相容实验结果
 
发明内容
本发明的一个目的是首次公开了三维自组装石墨烯切片的制备方法。
本发明的另一个目的是公开了使用离子注入技术将氮离子成功引入三维自组装石墨烯的技术参数。
本发明的再一个目的是公开了氮离子注入的三维自组装石墨烯在生物材料领域的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下的技术内容：
一种氮离子注入的三维自组装石墨烯，其特征在于它的孔径大小范围在5～15 μm，2μm量级观察下可以看到明显的石墨烯片状结构。所述氮离子注入的三维自组装石墨烯的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)将湿态的三维自组装石墨烯直接切片，切片厚度2-3.2 mm；然后吸干表面水分在0℃以下冷冻12 h以上；最后在-40 ℃至-80℃，小于10 Pa的条件下冷冻干燥10-48 h；
(2)氮离子的注入密度为1×10¹⁶ - 1×10²⁰个/ cm²；离子能量为5-25keV；所述材料中N的百分数为0.6% - 4.24%。
本发明进一步公开了氮离子注入的三维自组装石墨烯在作为组织支架生物材料方面的应用，其中作为组织支架生物材料方面的应用指的是：在提高了小鼠成纤维细胞在材料表面的生长，提高了材料的亲水性和蛋白吸附，提高了材料的生物相容性的应用。
本发明更加详细的描述如下：
氮离子注入的三维自组装石墨烯，其特征在于在切片后的自组装石墨烯上注入氮离子；其中氮离子的注入密度分别为1×10¹⁶ 个/ cm², 1×10¹⁸个/ cm² 和1×10²⁰ 个/ cm²；离子能量为5-25 keV；所述材料中N的百分数为4.24%~0.6%。
本发明所述的自组装石墨烯，是将干燥的氧化石墨粉体在室温下与去离子水(浓度为2 mg/mL)混合，随后注入到水热反应釜中，设定工作温度为180℃，反应时间为12 h，送入烘箱内进行自组装反应。将成型的自组装石墨烯柱体切片冷冻干燥后，使用离子注入机对其进行氮离子注入；在此过程中，采用氮气作为离子源，先对氮气进行高温蒸发和加速电子轰击使其离子化，电子束电流密度控制在3 μA/cm²以下；注入过程中腔室的气压为7.510^-3Pa，温度为室温，离子能量为2-25 keV。  
本发明对三维自组装石墨烯和氮离子注入的三维自组装石墨烯样品进行了扫描电镜(SEM)、傅里叶转换红外光谱仪(FT-IR)和X射线衍射(XPS)进行结构分析与比较。采用CAM KSV021733接触角测量仪对表面改性前后的自组装石墨烯进行亲水性进行测量。
图1为自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯的SEM照片，通过此图可以直观的观察到材料的表面形貌，自组装石墨烯的孔径大小范围在3~10 μm，在2 μm量级观察下可以看到明显的石墨烯片状结构，经离子注入后的自组装石墨烯其本身形貌没有产生变化，证明离子注入的方式不会对材料的多孔三维结构产生影响，为其作为生物组织支架提供了可能性。
表1为XPS检验自组装石墨烯和经氮离子注入材料表面的自组装石墨烯C、O、N元素的含量，离子注入浓度为1×10²⁰ 个/cm²的条件下，样品内N含量最高，达到4.24%。
表2自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯表面元素含量(%)
 
图2为自组装石墨烯和注入氮离子的自组装石墨烯的XPS谱线图，由图可知，C和O元素在未经离子注入的自组装石墨烯样品中均被探获，而N元素则不存在。
(1)由C_1S经过离子注入与未经离子注入的自组装石墨烯的谱线比较，自组装石墨烯在286.6 eV有峰值，这一峰值对应C-O键和O-C-O键，而经过氮离子注入的石墨烯峰值在285.5 eV，这一峰值对应的为C-N键，可看出氮离子的存在；
(2)同归哦比较离子注入密度为1×10¹⁶ 个/cm²、1×10¹⁸ 个/cm²和1×10²⁰ 个/cm²的材料谱图可看出：C_1S谱中不同剂量的注入材料中C-N的峰值面积逐渐增大，可以发现随着离子注入密度的增加，材料中的含氮集团增加。N_1S谱中随着但离子注入含量的增加，sp² C-N的峰值面积逐渐减小 sp³ C-N的峰值面积逐渐增大,可以发现但离子注入能逐渐增大。
以上现象表明，随着氮离子注入密度的增加，更多含氮集团存在于自组装石墨烯的表面。
本发明进一步公开了自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯材料在生物材料方面的应用。采用小鼠成纤维细胞系L929检测材料的细胞相容，体外观察在一个生长周期内，自组装石墨烯和氮离子注入的自组装石墨烯材料对细胞粘附和生长的实验。对照组使用的是专门用于细胞培养的24孔板，样品组为自组装石墨烯和三种不同注入浓度的自组装石墨烯材料。
由图4可看出，对照组和样品组在第1到7天之间，粘附于材料表面的小鼠成纤维细胞数目均逐渐增加，在第7天空白组的细胞数目达到最大值开始呈下降趋势，说明成纤维细胞密度达到一定程度后开始进入了衰退期，而实验组材料上的细胞数目仍逐渐增多；到第8天实验组中离子注入浓度为1×10²⁰ 个/cm²的细胞数目超过了对照组的最大峰值，其余三组实验组表面成纤维细胞也是增长趋势且在第8天细胞数目大于空白组。对照组本身特性就非常适于细胞在其上的粘附与生长，因此实验结果证明：三维自组装石墨烯的三维立体结构能够增大细胞生存空间，延长细胞生长时间退后衰退期，而经过氮离子注入后的自组装石墨烯又增加了各种含氮集团，通过生长曲线可看出随着氮注入量的增加，细胞的生长和粘附状况均有所提高，且离子注入浓度在1×10²⁰ 个/cm²的时候，细胞相通性最好。预示着该材料，可作为组织支架的备选材料，在生物材料领域有广泛的研究意义和应用价值。
附图说明
图1：自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯的SEM图：其中(a)为自组装石墨烯；(b) 为离子注入浓度为1×10¹⁶ 个/cm²的自组装石墨烯；(c) 为离子注入浓度为1×10¹⁸ 个/cm²的自组装石墨烯；(d) 为离子注入浓度为1×10²⁰ 个/cm²的自组装石墨烯。
图2：自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯的C_1s 的XPS谱线图：其中(a)为自组装石墨烯；(b) 为离子注入浓度为1×10¹⁶ 个/cm²的自组装石墨烯；(c) 为离子注入浓度为1×10¹⁸ 个/cm²的自组装石墨烯；(d) 为离子注入浓度为1×10²⁰ 个/cm²的自组装石墨烯。
图3：自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯的N_1s 的XPS谱线图：其中(a)为离子注入浓度为1×10¹⁶ 个/cm²的自组装石墨烯；(b) 为离子注入浓度为1×10¹⁸ 个/cm²的自组装石墨烯；(c) 为离子注入浓度为1×10²⁰ 个/cm²的自组装石墨烯。
图4：小鼠成纤维细胞在自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯表面的生长曲线。
图5：氮离子注入自组装石墨烯过程示意图。
图6：自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯的分子结构示意图：(a)为自组装石墨烯；(b) 为离子注入的自组装石墨烯。
图7：自组装石墨烯在经氮离子注入前后结构变化微观示意图。
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，说明如下：
实施例1
三维自组装石墨烯切片的制备：
用Hummers制备氧化石墨，将干燥的粉体与去离子水混合（浓度为2 mg/mL)，经超声分散，放入水热反应釜中180℃条件下自组装12 h，得到自组装三维石墨烯水凝胶。
1)由于自组装石墨烯在湿润状态下抗压能力弱容易变形，为防止破坏其内部三维孔状结构，用药匙取出湿润的柱体后放于滤纸上吸取表面水分。
2)用游标卡尺量取材料得到平均长度为1.7 cm，用薄度为0.1 mm的薄型刀片对材料进行7等分切割，每等份厚度范围在2-3.2 mm间，通过实验验证，超过该范围的切片经冷冻干燥后容易发生较明显的粉化现象。
  3)将切好的片层自组装石墨烯用滤纸吸取表面水分，放于表面皿内，用保鲜膜封存，在0 ℃以下冷冻12 h以上，保证其充分冻结，否则在干燥过程中会发生液体沸腾状况，破坏材料的表面形貌。
  4）将冷冻好的材料放于（型号）的冷冻干燥仪中-40℃ 到-80℃范围内，10 Pa以下的大气压强的条件下，冷冻干燥10-48 h之间生物检测备用，超出该范围的自组装石墨烯材料同样会有较严重的粉化现象。
表3三维自组装石墨烯切片的制备所需仪器

表4三维自组装石墨烯切片的制备所需药品
 
实施例2
氮离子注入的自组装石墨烯的制备：
使用离子注入机对自组装石墨烯进行氮离子注入；在此过程中，采用氮气作为离子源，先对氮气进行高温蒸发和加速电子轰击使其离子化，电子束电流密度控制在3 μA/cm²以下；注入过程中腔室的气压为1 × 10^-3 Pa，温度为室温，离子能量为5-25 keV。
其中氮离子的注入为1×10¹⁶ 个/ cm²；氧原子的百分数为0.6%。
其中氮离子的注入为1×10¹⁸ 个/ cm²；氧原子的百分数为0.73%。
其中氮离子的注入为1×10²⁰ 个/ cm²；氧原子的百分数为4.24%。
离子注入制备参数：
1)  采用氮气作为离子源，将样品放在藏室内，反应温度室温，抽取预真空值控制为1×10^-3 Pa；
2)  继续调节舱室内真空度，调节真空气压至7.5×10^-4 Pa；
3)  电子束电流密度控制在3μA/cm²以下，控制氮离子离子能量为2-25 keV。对氮气进行高温蒸发和加速电子轰击使其离子化；
4)  注入过程保证气压值在7.5×10^-4 Pa，根据注入密度改变注入时间相关参数如表 2所示，注入过程如图4所示。
表5自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯表面元素含量(%)
 
表6 氮离子注入所需仪器和材料

实施例3
小鼠成纤维细胞粘附与增殖行为情况研究：
将氮离子注入含量不同的三种自组装石墨烯材料和未处理的自组装石墨烯材料各32片分别放在24孔板里，分成4组(4次重复实验)。将已培养48 h、生长旺盛的L929细胞制成细胞浓度为1×10⁴个/mL的细胞悬液(细胞存活率96%)，使用移液枪等量(700 μL)滴加在样品表面，另接种8个空白孔作为对照组。在1 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d 时，用MTT法测试材料上的细胞增殖曲线。测试当天每组样品各取1孔，注入170 μL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色液对活细胞进行染色，在37℃的 CO₂培养箱中孵育4 h后，吸出培养液加入二甲基亚砜(DMSO)培养30 min，使用移液枪等量(70 μL)吸出液体转移到96孔板中，使用Biotek ELx808型吸收光酶标仪在吸光度为490 nm处测量出吸光值，绘制增殖曲线。
表7小鼠成纤维细胞粘附与增殖所需仪器和相关耗材
 
表8小鼠成纤维细胞粘附与增殖所需药品
 
实施例4
牛血清白蛋白对自组装石墨烯和注入氮离子的自组装石墨烯的蛋白吸附实验
1)  用牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这溶液的吸光度，到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.1x+0.6, R2=0.841。
2)  用200 μL的PH=6.9的蛋白溶液加入材料，在室温下存放24 h，蛋白质浓度为C₀= 4.0 mg/mL。
3)  加入用移液枪分别移取50 ul配好的一组BSA溶液，加入200 ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10 min后，用分光光度计测得这组BSA的溶液的吸光度。
4)  将数值带入1）所计算出的方程中的到溶液蛋白浓度为C₁。
5)  则蛋白的吸附量为Qa= 40(C₀-C₁)/S。
6)  经测量，自组装石墨烯蛋白吸附量随着N离子浓度增加而呈现为上涨趋势，如表3所示，说明氮粒子的注入能改善改善材料表面的蛋白吸附量,蛋白吸附量越大，血小板吸附作用越低，从而证明材料的抗凝血性能越好，进而达到改善材料生物相容性的目的。
表9自组装石墨烯和经氮离子注入的自组装石墨烯牛血清白蛋白吸附量

表10牛血清白蛋白吸附所需仪器和相关耗材
 
表11牛血清白蛋白吸附所需药品
 
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限。