聚乙二醇化试剂及由其形成的化合物 【发明领域】
本发明涉及聚乙二醇的活性衍生物和相关的亲水性聚合物，并涉及在修饰表面和分子特性中所使用的合成方法。本发明也涉及与此活性物共价结合的多肽和制备该多肽的方法。
【发明背景】
已研究将聚乙二醇(“PEG”)用于药物中，人造植入物上和其它生物相容性重要的应用中。已提出各种PEG衍生物具有允许PEG与药物和植入物和与分子和表面结合的活性部分。例如，已建议使PEG与表面偶合的PEG衍生物，以控制湿润、静态组合和其它类型的分子与表面的结合，包括蛋白质或蛋白质残基。
也已提出将PEG用于如从细胞块中亲和分离酶类。在亲和性分离中，PEG衍生物包含与酶可逆偶联的官能团，该酶包含在细胞块中。从细胞块中分出PEG和酶的共轭物，如果需要，然后从PEG衍生物上分出酶。
在另外的例子中，需要使PEG衍生物(“聚乙二醇化”)偶联来克服在临床中使用生物活性分子时所遇到的障碍。公开的PCT公开号WO92/16221中描述：例如，已发现许多具有有效治疗作用的蛋白质在血清中的半衰期短。就绝大部分而言，通过肾脏将蛋白质从血液中清除了。系统摄入较多的蛋白质(特别是人系统之外的那些蛋白质)时，会产生免疫反应，这样可导致通过形成免疫复合物而从体内快速排斥该蛋白质。对于其它蛋白质来说，溶解性和凝集问题也妨碍了蛋白质的最佳配制。
聚乙二醇化通过增加分子的表观分子量来减小从血液中地清除速率。对于一定大小的分子来说，蛋白质滤过肾小球的速率与蛋白质大小成反比。所以聚乙二醇化减小清除的能力通常不是吸附在蛋白质上PEG基团多少的函数，但与改变的蛋白质的总分子量有关。清除速率的减小可使功效比非聚乙二醇化的物质有所增加。如参见Conforti等，药物研究通信第19卷，287页(1987)和Katre等，美国国家科学院院刊，第84卷，1487页(1987)。
另外，聚乙二醇可减小蛋白质的凝集作用(Suzuki等，生物化学与生物物理学报第788卷，248页(1984))，改变蛋白质的免疫原性(Abuchowski等生物化学杂志，第252卷，3582页(1977))，并增加蛋白质的溶解性，如在PCT公开号WO 92/16221中所述。
蛋白质的聚乙二醇化说明了在将PEG吸附在表面和分子上时所遇到的一些问题。绝大多数聚乙二醇化试剂与多肽中游离的伯胺基进行反应。大多数这样的游离胺是赖氨酸残基的ε氨基。通常的蛋白质含有大量的赖氨酸。其结果是，随机吸附多个PEG分子而常常使蛋白质失活。
另外，如果打算将聚乙二醇化的蛋白质用于治疗，由非特异的聚乙二醇化所产生的多种物质混合物导致难以制备具有再现性和可定性的产物。这种非特异性的聚乙二醇化使得难以评价其治疗作用，也难以建立其效能和剂量信息。该类蛋白质位点选择性聚乙二醇化可产生再现性修饰的物质，获得所需的PEG化而没有失活。
对再现性地生产连接两个或多个生物活性分子或化合物的复合物的需求也是存在的。在某些情况下，使用含有多于一个的生物活性多肽或药物的多聚体(multimeric)复合物产生协同性的有益作用。例如，与单体(monomeric)多肽相比，含有两个或多个相同结合多肽的复合物与配体或活性部位的亲和性可有很大增加。另外，含有(1)在体内的特定部位起作用的生物活性蛋白质和(2)可将复合物导向特定部位的分子可能是特别有利的。
对水解稳定的激活的聚合物也存在着需要，该聚合物形成水解稳定的键。否则的话，在某些情况下，所需反应进行之前活性基团失活或反应后所形成的共轭物在水性介质(如血液或血浆)中半衰期短。
例如，Zalipsky的美国专利5122614描述用氧羰基-N-二甲酰亚氨(oxycarbonyl-N-dicarboximide)官能团活化的PEG分子可在水性碱性条件下通过尿烷键合被结合到多肽的氨基上。表明活化的PEG-N-琥珀酰亚胺碳酸盐与胺基形成稳定的水解耐受的尿烷键。显示胺基在约8.0到9.5的碱性pH下反应性更强，而在低pH下，反应活性急剧下降。然而在pH8.0到9.5时，未偶联的PEG衍生物的水解也急剧增加。Zalipsky通过使用过量的PEG衍生物与蛋白质结合来避免未偶联PEG衍生物与水反应速率增加的问题。通过使用过量的PEG衍生物，在PEG衍生物水解和不能反应之前，将足量的活性氨基部位结合到PEG上来修饰蛋白质。
Zalipsky的方法足以将蛋白质的赖氨酸部分非特异性地连接到PEG衍生物的PEG上的一个活性部位。然而，如果PEG衍生物的水解速率大时，可产生与PEG分子上的多个反应部位结合的问题，因为简单的过量不减慢水解的速度。
例如，在每个末端具有活性部位的线性PEG在一个末端与蛋白质结合而另一末端的反应部位可与水反应形成较不活泼的羟基部分而未使PEG连接两个蛋白质。如果需要将一个分子通过PEG连结剂偶联到表面上，出现类似的问题，因为PEG首先与表面连结或偶联到分子上，并且PEG衍生物的另一端必须保持活性以便随后进行反应。如果有水解问题，那么另一端通常是失活的。
Zalipsky的美国专利5122614也描述了由先有的专利获得的一些其它PEG衍生物。表明PEG-琥珀酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯形成限制水介质中稳定性的酯键。表明PEG-氰尿酰氯是有毒的并与可导致蛋白质失活的蛋白质上的特定官能基发生非特异性反应。PEG-苯基碳酸酯产生有毒的疏水性苯酚残基，该残基对蛋白质有亲和性。用羰基二咪唑(carbonyldiimidizole)活化的PEG在与蛋白质官能基反应时非常缓慢，需要长的反应时间来获得足够修饰的蛋白质。
已提出其它与非赖氨酸ε氨基官能基连结的PEG衍生物。例如，马来酰亚胺特异于半胱氨酸的巯基但马来酰亚胺官能度易于水解。
因此，需要存在再现性地产生其各部分由非抗原性的高度溶解的生物惰性分子连结的分子的试剂和方法。本发明满足了对此复合物的需求并产生了相关的优点。本发明也满足了对形成水解稳定性共轭物所需的水解稳定性试剂的需求。
发明概述
本发明涉及生物活性的共轭物，它含有具有反应性硫羟部分的生物活性分子和具有与反活应硫羟部分形成键的活性砜部分的非肽聚合物。生物活性分子可以是合成的，天然产生的或修饰天然产物获得的分子。可将拥有所需生物活性的分子修饰为含有反应性硫羟部分的。
特别有用的生物活性分子包括肿瘤坏死因子(“TNF”)抑制剂，白细胞介素-1受体拮抗剂(“IL-lra′s”)，CR1，PDGF的外显子6肽和白细胞介素-2(“IL-2”)抑制剂和受体(“IL-2r”)。
本发明聚合物含有至少一个活性砜部分并具有式P-SO2-C-C*-，其中P为聚合物且C*为与硫羟部分键合的反应性部位。硫羟和活性砜的连结之处为C*，且可用式P-SO2-C-C*S-R来表示，其中R为生物活性分子。有用的活性砜部分包括，如，乙烯砜和氯乙基砜。各种聚合物可被活化用于本发明的所有实施方案中，包括水溶性聚合物如聚乙二醇(“PEG”)和相关的亲水性聚合物。
本发明也提供用砜活化的聚合物来制备上文所述生物活性共轭物的方法。该方法包括下列步骤：
(a)将具有反应性硫羟部分的生物活性分子与具有活性砜部分的非肽聚合物反应而形成共轭物；和
(b)分离该共轭物。
含有该共轭物的药物组合物也在本发明的范围之内。
本发明还涉及用于偶联各种分子、化合物和表面的砜活化的聚合物。该活化的砜部分与上文所述相同。特别有用的活化聚合物包括用砜部分PEG分子的一个部位和用NHS-酯或马来酰亚胺官能度在另一个部位活化的双官能PEG衍生物。
本发明还包括基本纯的具有式R1-X-R2的生物活性化合物，称作“哑铃”)，其中当化合物分离时，至少R1或R2之一为保留其生物活性的生物活性分子。生物活性分子具有反应性硫羟部分，它与非肽聚合物上的迈克尔受体基团形成键。适用于本发明的生物活性分子包括上文所述的那些。有用的迈克尔受体基团包括，如，乙烯砜和马来酰亚胺。可用迈克尔受体功能基活性的聚合物包括上文所述的水溶性聚合物。
R1和R2可为相同或不同的部分。当R基团相同时，该化合物为均匀哑铃(homodumbbell)；当R基团不同时，该化合物为不均匀哑铃(heterodumbell)。特别有用的均匀哑铃如包括PEG连结的TNF抑制剂和PEG连结的IL-lra′s。有用的不均匀哑铃如包括由IL-2r-α和IL-2r-β形成的、抑制补体系统常规通道的不均匀哑铃和由IL-lra和PDGF的外显子6形成的不均匀哑铃。
制备哑铃化合物的方法包括在本发明范围之内。制备哑铃R1-X-R2的方法包括下列步骤：
(a)X与R1和R2反应形成R1-X-R2；和
(b)纯化R1-X-R2。
在上文制备哑铃方法的步骤(a)中可进一步包括下列步骤：
保护X的一个反应性基团以在X上形成保护基；
将具有保护基的X与R1反应形成R1-X；
脱去X上的保护基；和
将R1-X与R2反应形成R1-X-R2。另外，步骤(a)还可包括下列步骤：
过量的X与R1反应形成R1-X；和
R1-X与R2反应形成R1-X-R2。
含有基本上纯的R1-X-R2化合物的药物组合物也包含在本发明的范围之内。发明详细描述
本发明提供生物活性轭合物，它含有(1)具有反应性硫羟部分的生物活性分子，和(2)具有与生物活性分子的硫羟部分形成键的活性砜部分的非肽聚合物。
“轭合物”意指复合物，它由具有活性硫羟部分的生物活性分子与具有活性砜部分的非肽聚合物通过硫羟和砜之间的键结合而成。如上所述，本发明的轭合物为生物活性的。
“生物活性的”意指在体外或体内能够产生生物作用。生物活性分子包括但不局限于能在天然生物分子之间或在生物系统如细胞或生物上诱导生物作用的任何化合物。证明生物活性的方法包括体外生物测定法，许多在本领域中公知的测定方法。例如，可通过测定抑制剂是否与TNF结合或抑制剂是否阻断某些细胞的TNF-介导的溶解来测量肿瘤坏死因子“(TNF”)抑制剂的生物活性。在公开的欧洲专利申请号901136739中描述了后者的生物测定法，该文献引入本文供参考。
生物活性分子包括但不局限于药物、维生素、营养物、核酸、氨基酸、多肽、酶辅助因子、甾类化合物、碳水化合物、器官物质如肝素、含金属的试剂、受体激动剂、受体拮抗剂、结合蛋白质、受体或部分受体，细胞外基质蛋白质、细胞表面分子、抗原、半抗原、靶基团和螯合剂。关于受体包括所有形式的受体，不管其是否是以单一形式存在。
本文中使用的“多肽”和“蛋白质”为同义词，意指基本上为天然蛋白样性质的任何化合物。然而，多肽组可含有某些非肽成分。例如，糖基化的多肽或合成修饰的蛋白质包括在本发明定义的范围之内。“靶基团”可为位于生物系统中的化合物。可通过其对特定配体的亲和性来描述结合蛋白质和受体。
在公开的PCT公开号WO92/16221中描述了许多本发明中有用的多肽，该文献引入本文供参考。这些蛋白质在本领域中是公知的。特别有用的多肽为TNF结合蛋白质，也称作TNF抑制因子。在本文中将“TNF结合蛋白质“定义为结合TNF的蛋白质。
TNF结合蛋白质(“TNFbp”)为p55TNF受体或TNF受体I的胞外部分。在体内，脱下的受体的胞外部分在血液中作为与TNF结合的30kDa糖基化蛋白质进行循环。该结合的蛋白质也被作TNFbp-I或30kDaTNFbp。在出版的欧洲专利申请90113673.9中描述了该TNF结合蛋白质的纯化方法和氨基酸及核酸序列，该文献引入本文供参考。
该出版的文献也指导重组生产该TNF抑制剂的糖基化和脱糖基化形式。尽管该抑制剂脱糖基化形式的实际分子量约为18kDa，但术语“30kDa TNF抑制剂”包括糖基化和脱糖基化形式。
本文所使用的“天然产生的”、“天然的”和“野生型”为同义词。
欧洲专利申请90113673.9(本文参考文献)也描述了另一种TNF抑制剂(称作40kDa TNF抑制剂)的纯化和氨基酸及核酸序列。该天然产生形式的抑制剂(也称作TNFbp-II)为p75或p85 TNF受体的糖基化胞外部分。欧洲专利申请号90112673.9也教导了重组生产该“40kDa”抑制剂的糖基化和脱糖基化形式。在该出版的文献中描述了天然40kDaTNF抑制剂的核酸和氨基酸序列。尽管脱糖基化形式的分子量不为40kDa，但将TNFbp的糖基化形式和脱糖基化形式均称作“40kDa TNF抑制剂”。
欧洲专利申请90112673.9(本文参考文献)还教导了重组生产两种TNF抑制剂，它们为全长“40kDa”结合蛋白质的一部分。这两种截短物被称作“Δ51”和“Δ53”TNF抑制剂。在该出版参考文献中描述了Δ51和Δ53抑制剂的氨基酸和核酸序列。
其它特别有用的多肽包括白细胞介素-1受体拮抗剂(“IL-lra′s”)(在美国专利5075222中描述，引入本文供参考)、胰岛素样生长因子结合蛋白质(“IGFbps”)，CTLA4和血小板衍生生长因子(“PDGF”)的外显子6、神经胶质衍生神经营养因子(“GDNF”)。睫状神经营养因子(“CNTF”)、白细胞介素-4-受体(“IL-4r”)和抑制剂、以及白细胞介素-1受体(“IL-2r”)。Hannum等在美国专利5075222中描述了编码天然产生的IL-lra的核酸和在大肠杆菌中表达该蛋白质的方法。
在出版的PCT公开号WO92/16221中讨论了IL-2受体和CR1的特征、编码它们的核酸及其制备方法，该文献引入本文供参考。
本发明轭合物中连结聚合物的生物活性分子在形成键之前具有反应性硫羟部分。“反应性硫羟部分”意指能与本文所述活性聚合物反应的-SH基团。
反应性硫羟基的例子是氨基酸半胱氨酸的-SH。许多蛋白质没有游离的半胱氨酸(不包含在二硫键中的半胱氨酸)或任何其它反应性硫羟基团。另外，半胱氨酸的硫羟基不适于与聚合物键合，因为硫羟基是生物活性所必需的。另外，蛋白质为了活性必须折叠成一定的构型。在活性构型中，半胱氨酸不能与砜反应，因为它被埋藏在蛋白质的内部。而且，甚至易接近的半胱氨酸硫羟基(不是活性所必需的)可能是位于不适于与聚合物形成键的部位。活性的非必需氨基酸被称作“非必需的”。非必需半胱氨酸可能是不适于结合的部位，因为与活性部位有关的半胱氨酸的位置在与聚合物结合后导致多肽失活。象蛋白质一样，许多其它生物活性分子具有不适于与聚合物结合(出于上文所述的类似原因)的反应性硫羟基或不含有反应性硫羟基。
因此，当必需或合乎需要时，本发明期望将反应性硫羟基引入生物活性分子中。也可将硫羟基引入非活性分子来形成生物活性分子只要硫羟-砜键不破坏所需活性。
可通过本领域公知的化学方法来引入反应性硫羟基。可用多肽或非肽分子来进行化学修饰，且包括单独或作为较大基团的部分(如半胱氨酸残基)将硫羟基引入分子中。Jue，R.等在Biochemistry，17，pp，5399-5406(1978)中描述了化学引入硫羟基的例子。也可通过用如DTT化学还原半胱氨酸而在多肽中产生游离的半胱氨酸。
在某一位置被修饰为含氨基酸残基的多肽被称作“突变型蛋白”，该位置在修饰之前的天然蛋白质中是不存在的。为了产生半胱氨酸的突变型蛋白，用可加到多肽上的半胱氨酸或半胱氨酸残基取代非必需氨基酸。引入非天然半胱氨酸的可能部位包括糖基化部位和多肽的N端或C端。赖氨酸突变为半胱氨酸也是合适的，因为在其活性构型的蛋白质的表面上经常发现赖氨酸残基。另外，在选择可能的突变部位中，本领域技术人员可使用任何关于多肽结合或活性部位的已知信息。
本领域技术人员也可使用公知的重组DNA技术来制备半胱氨酸突变型蛋白。通过标准定点突变可改变编码天然多肽的核酸来编码突变型蛋白。Kunkel，T.A.在Proc Nat.Acad.Sci.，第82卷，第488-492(1985)中和Kunkel，T.A.等在Methods Enzymol.，第154卷，第367-382(1987)中描述了标准诱变技术的例子，为两篇均引入本文供参考。另外，可通过本领域公知的技术化学合成编码突变型蛋白的核酸。可使用DNA合成仪并如从Applied Biosystem(Foster City，CA)购得。可在各种表达系统中表达编码所需突变蛋白的核酸，包括动物、昆虫和细菌系统。
当在细菌表达系统中重组生产突变型蛋白时，进行下列步骤：
1)通过定点突变编码天然多肽的核酸来产生编码所需突变型蛋白的核酸；
2)在细菌表达系统中表达编码所需突变型蛋白的核酸；
3)从细菌中分离突变型蛋白并纯化；
4)如果未适当折叠，在半胱氨酸或另一个含硫羟基的化合物存在下将突变型蛋白质重新进行折叠；
5)分离重新折叠的突变型蛋白并纯化；
6)用弱还原剂处理纯化并重新折叠的靶突变型蛋白；
7)在无氧条件下，将反应混合物透析。
如下文所述，在与聚合结合之前，从反应混合物中分出突变型蛋白，但并不总需要这样。在步骤6中特别有用的还原剂是二硫苏糖醇(“DTT”)或三-(羧基乙基磷化氢)(“TCEP”)。TCEP是有用的，因为在用硫羟特异性PEG试剂轭合前不需要被移走。见Burns，J.A.等，J.org.Chem.第56卷，第8期，第2648-2650页(1991)。
制备所需突变蛋白之后，本领域技术人员可对该突变型蛋白进行生物测定，并将该突变型蛋白的活性与天然多肽进行比较。按照下文更充分的讨论，甚至在突变型蛋白的相对活性被降低时，由突变型蛋白形成轭合物可能也是特别有用的。例如，相对于未共轭的分子来说，该轭合物在生物系统中溶解性增加、抗原性或免疫原性减小或清除时间缩短。生物活性分子在药代动力学方面的这种改善可增加该分子在各种治疗应用方面的价值。溶解性的增加也可提高该分子体外诊断应用的价值。
表1列出所生产的IL-lra的突变型蛋白。在出版的PCT专利公开WO 92/16221(本文参考文献)中描述了IL-lra突变型蛋白的制备和纯化。按WO 92/16221所述序列给残基编号，“O”表示加成到N端的氨基酸；“C”指半胱氨酸和“S”指丝氨酸。例如“COS116”意指将半胱氨酸插入N端且丝氨酸插入116位。天然IL-lra在66、69、116和122位上有游离半胱氨酸残基。
表1 IL-lra的突变型蛋白 c0s116 c0 c84s116 c6 c8s116 c8 c9s116 c9 c141s116 c141
表2显示也已被制备的30kDa TNF抑制剂的突变型蛋白质。天然30kDa TNF抑制剂(不象IL-lra)没有任何游离的半胱氨酸残基。这些突变型蛋白按出版的PCT公开号WO 92/16221(本文的参考文献)所述方法来制备，并按该文献所述的氨基酸序列来编号。
表2 30kDa TNF抑制剂的突变型蛋白 c105 30kDa TNF抑制剂 c1 30kDa TNF抑制剂 c14 30kDa TNF抑制剂 c111 30kDa TNF抑制剂 c161 30kDa TNF抑制剂
本发明的突变型蛋白和其它多肽包括蛋白质序列的等位变异和基本上等同的蛋白质。“基本上等同”意指具有极高程度的氨基酸残基同源性(通常见，M.Dayhoff，蛋白质序列和结构图，第5卷，124页，(1972)，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.，引入本文供参考)并具有相似的生物活性。基本上保持天然多肽或突变型蛋白的生物活性的天然多肽或突变型蛋白的截短形式也包括在本发明的范围之内。
本发明的轭合物除含具有反应性硫羟部分的生物活性分子之外，还含有非肽聚合衍生物，它具有活性砜部分。“非肽”意指具有少于50％(重量)的α氨基酸残基。
聚合衍生物的聚合物部分如可为聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇(“PPG”)、聚氧乙烯化的甘油 (“POG”)和其它聚氧乙烯化的多元醇、聚乙烯醇(“PVA”)和其它聚亚烷基氧化物、聚氧乙烯化的山梨糖醇或聚氧乙烯化的葡萄糖。聚合物可为上文所列单体的、直链或分支的、取代或未取代的均聚物、随机或嵌段共聚物，三元共聚物，只要其至少具有一个活性砜部分。聚合部分可为任意长度或任何分子量但这些特征可影响生物特性。对于药用时减小清除速率特别有用的聚合物的平均分子量为2,000到35,000道尔顿。另外，如果将两个基团分别连结在聚合物的两端时，聚合物的长度可影向两基团间的有效距离和其它空间关系。因此，本领域技术人员可改变聚合物的长度来优化或赋予所需的生物活性。如果聚合物为直链PEG，以(Z)n(其中Z为聚合物的聚合单元)来表示，聚合物特别有用的长度包括n具有50-500的范围，在本发明的某些实施例中，n大于6且优选大于10。
将单甲氧基聚乙二醇称作mPEG。术语“PEG”意指任何数次缩合的1，2-亚乙基二醇的聚合物。PEG也被称作聚氧乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙二醇和聚醚乙二醇。可作为乙烯氧化物和许多其它单体的共聚物来制备PEG。许多生物或生物技术的应用中，会使用基本上线型的直链的乙烯基砜活化的PEG，它除乙烯基砜外基本上是未代的。
出于一些原因，PEG在生物应用中是有用的。PEG通常是透明、无色、无气味、溶于水、对热稳定、对许多化学试剂惰性、不水解和无毒性的。聚乙二醇化可通过增加分子的表观分子量来改善分子的药物代谢动力学。增加的表观分子量减小皮下或系统给药后从体内的清除速率。在许多情况下，聚乙二醇化可减小抗原性和免疫原性。另外，聚乙二醇化可增加生物活性分子的溶解性。
本发明的聚合物衍生物具有活性砜部分。“活性砜”意指结合有两个碳基团的砜基，具有在约pH9或低于pH9时可使硫羟基特异地偶联在来自砜基团的第二个碳的反应性部位。活性砜的例子包括但不限于乙烯砜和活化的乙基砜。活性乙基砜的例子为-SO2-CH2-CH2-Z，其中Z为卤素或另一个能通过硫羟取代而形成砜-硫羟键-SO2-CH2-CH2-R的离去基团，其中R表示生物活性分子。砜活性的聚合物可进一步被取代，只要在约pH9或低于此pH时保持第二个碳原子的硫羟特异的反应性。
可以在至少四步中合成本发明的砜活性的聚合物。简而言之，第一步是例如通过活化或取代来增加聚合物一个部位(通常为端基)的反应性。第二步是以一种可转化为具有类似反应特性的乙基砜或乙基砜衍生物的形式将硫直接连接到聚合物的碳原子上。在第三步中，将硫氧化为砜。在第四步中，活化距离砜基团的第二个碳原子。
以合成砜活化的PEG为例，下文更详细地描述砜活化的聚合物的合成。第一步是PEG中羟基部分的活化。术语“羟基活化”在本文中意指取代以及酯化和采用其它方法对羟基活化。通常在羟基活化中，将酸或酸的衍生物如卤代酸与PEG反应形成反应性酯，其中PEG和酸部分通过酯键来连结。酸部分通常比羟基部分更具反应性。通常酯为磺酸酯、碳酸酯和磷酸酯。
适用于本发明的磺酰卤(Sulfonyl acid halide)如包括甲磺酰氯(也称作mesyl chloride)和对-甲苯磺酰氯(也称作tosyl chloride)。甲磺酸酯有时被称作mesylates。甲苯磺酸酯有时被称作tosylates。
在取代型的羟基活化中，通过更为反应性的部分(通常为卤化物)取代PEG上的整个羟基。例如，亚硫酰氯可与PEG反应形成更为反应性的氯取代的PEG。
因此，当PEG为原料时，第一步的通常反应产物为酯或卤化物取代的PEG。
在第二步中，通过醇来取代酯或卤化物，该醇含有吸附有乙基的反应性硫羟基(硫代乙醇部分)。硫代乙醇(Thioethanol)是合适醇的一个例子。在该步骤中，硫羟基中的硫直接与聚合物中的碳键合。
接着，在第三步中，将硫氧化为砜。有用的氧化剂包括如过氧化氢、过硼酸钠或过氧酸。
在第四步中，将步骤二中使用的醇的羟基部分活化。该步的反应顺序类似于第一步。通常用卤化物取代形成卤代乙基砜或其在砜部分的第二个碳原子上有反应性部位的衍生物。通常，乙基上的第二个碳原子将通过氯化物或溴化物的卤原子来激活。羟基的活化将产生一个类似反应性的部位如磺酸酯。合适的反应物如酸、酰基卤和其它前文在第一步反应中描述的物质。亚硫酰氯对于用氯原子取代羟基来说是特别有用的。
所得聚合物活化的乙基砜是稳定的、可分离的并适于硫羟选择性的偶联反应。PEG氯代乙基砜在pH约为7或更低的水中是稳定的，然而可将其用于在碱性高达至少约pH9的条件下的硫羟选择性的偶合反应中。当pH高于9时，硫羟的选择性被减小且砜部分有时变得更易于与氨基反应。与硫羟基反应形成的键也是水解稳定的。
在可加入合成的第五步中，将活化的乙基砜与碱反应来形成(from)PEG乙烯砜或其用于硫羟选择性偶联的活性衍生物之一。合适的碱包括如氢氧化钠或三乙基胺。类似于活化的乙基砜，乙烯砜是水解稳定的、可分离的、硫羟选择性的并与硫羟反应形成水解稳定的键。
本文所使用的“水解稳定的”意指聚合物和砜部分之间的和轭合后砜-硫羟之间的键在低于约11的pH下至少三天不与水发生反应。水解稳定性是需要的，因为如果水解速率是明显的，那么在聚合物和生物活性分子之间发生反应前，该聚合物可被失活。
如上文所述，例如在各端都有活性部位的线性PEG在一端结合蛋白质，但如果水解速率明显时，另一端会与水反应而变为较不易反应的羟基部分，而非与结合的蛋白质或其它所需基在其两端形成“哑铃”分子结构。当通过PEG连结剂将分子偶合到表面时发生类似问题，因为PEG首先被吸附到表面或与该分子偶合，而PEG衍生物的另一端必须保持其活性以便以后的反应。如果存在水解的问题，那么另一端通常失活。
另外，通过将具有砜部分的连结剂结合到用不同功能基活化的PEG(或其它聚合物)上来制备砜活化的衍生物。例如，在约9或更低的pH合适条件下，将氨基活化的PEG与一个小分子进行反应，该分子在一端具有琥珀酰亚胺基(Succinimidyl)活性酯部分并在其它端具有乙烯砜。氨基活化的PEG与琥珀酰亚胺基酯形成稳定的键。用乙烯砜活化所得PEG的末端并且是水解稳定的：PEG-NH-OC-CH2-CH2-SO2CH＝CH2。
通过胺反应性PEG(如琥珀酰亚胺基活性酯PEG，PEG-CO2-NHS)与在一端具有胺部分且其它端有乙烯部分的小分子反应形成类似的活化的PEG。
按实施例1所述方法制备PEG氯乙基砜和PEG乙烯砜。在实施例2中显示了PEG乙烯砜和氯乙基砜的硫羟选择反应性。实施例3显示了两个化合物的聚合物砜键的水解稳定性。硫羟和砜之间的键的水解稳定性显示在实施例16中。
当聚合物没有羟基部分，首先在进行上文所述步骤前通过本领域公知的化学方法加上羟基。本发明的活化聚合物衍生物可具有一个以上的羟基。该衍生物可为单官能、双官能或多官能的。反应性基团可为相同的(同官能的)或不同的(异官能的)，只要至少有一个活性砜部分。
两个特别有用的同二官能衍生物为PEG-二-氯砜和PEG-二-乙烯砜。本领域技术人员可以以末端具有羟基部分的PEG为原料并按上文所述的常规方法来合成那些分子。
也可合成异二官能衍生物。两个特别有用异二官能衍生物包括如在一端具有乙烯砜或马来酰亚胺而另一端为N-羟基琥珀酰亚胺酯(“NHS-酯”)的线型PEG。NHS-酯为胺特异的。具有一端为NHS-酯且另一端为活化砜部分的PEG可与赖氨酸和半胱氨酸残基结合。剩余的水解稳定的未反应砜随后与硫羟反应形成稳定的胺键。按实施例5和6中所述方法合成了这两种异二官能PEG衍生物。如果为马来酰亚胺NHS-酯，使用直链PEG来制备杂二官能试剂，PEG用(Z)n来表示，其中Z为单体单元，n大于6且优选大于10。
异功能砜活化的PEG的其它活性基团可选自各种各样的化合物。为了生物和生物技术的应用，该取代物通常选自在PEG化学中常用来激活PEG的反应性部分如醛、三氟乙基磺酸酯(有时称作tresylate)、n-羟基琥珀酰亚胺酯、氰尿酰氯、氰尿酰氟、酰基叠氮、琥珀酸、对-二偶氮苯甲基、3-(对-二偶氮苯氧基)-2-羟基丙氧基和其它。
除砜之外的活性部分的例子显示在Davis等美国专利4179337；Lee等美国专利4296097和4430260；Iwasaki等4670417；Katre等美国专利4766106、4917888和4931544；Nadagawa等美国专利4791192；Nitecki等美国专利4902502和5089261；Saifer美国专利5080891；Zalipsky美国专利5122614；Shadle等美国专利5153265；Rhee等美国专利5162430；欧洲专利申请公开号0247860；和PCT国际申请号US86/01252；GB89/01261；GB89/01262；GB89/01263；US90/03252；US90/06843；US9I/06103；US92/00432；和US92/02047，这些文献均引入本文供参考。
三官能衍生物的例子为结合含有三个乙烯砜PEG部分的甘油骨架。该分子式可用下式来表示：该衍生物按实施例12所述的方法来制备。
多官能衍生物的另一个例子为“星状”分子。在Merrill美国专利5171264中全面地描述了星状分子，该文献引入本文供参考。星状分子具有结合有多个PEG链或“臂”的核心结构。可使用砜部分来在从该核心延伸出的PEG末端提供活性的官能基并作为将官能基或其它部分与星状分子的臂结合的连结剂。
用上文所述的活化的聚合物来运载各种各样的取代基和取代基的组合物对专业技术人员来说是显而易见的。
如上文所述，通过含硫羟的生物活性分子与砜活化的聚合物反应形成本发明的轭合物。硫羟反应基和砜活化的聚合物之间的键为共价键。
制备本发明轭合物的总的方法包括下列步骤：
(1)选择所需的生物活性分子并通过本领域公知的方法来确定该分子是否拥有游离硫羟基。如参见，Allen，G.“蛋白质和多肽测序”，第153-54页，生物化学和分子生物学中的实验技术，Work，T.S.，和Burdon，R.H.，编(1972)，引入本文供参考。如果该分子具有游离硫羟基，进行步骤3。如果该分子没有硫羟基，进行步骤2。
(2)如果在该分子中没有存在游离硫羟基，按上文所述方法加上硫羟基。加上硫羟基后，进行生物测定以确定是否保留所需生物活性或部分生物活性。
(3)按上文所述方法合成所需砜活化的聚合物。
(4)将活化的聚合物与具有游离硫羟基的分子进行反应。
(5)使用本领域公知的色谱层析技术分离反应产物。对于蛋白质轭合物来说，可参见Scopes，R.，蛋白纯化，Cantor，C.R.编，Springer-Verlag，New York(1982)。对于非蛋白质分子来说，参见Still，W.C.等J.org.Chem.，43，第2923-2925页(1978)。如果没有轭合物形成，将硫羟基加到生物活性分子的另一个位置上并重复步骤(4)和(5)。
(6)使用相关的生物测定方法，测定所形成的轭合物的生物活性。
本领域技术人员可加或减去某些步骤。例如，本领域技术人员可不测定步骤2中的生物活性或根据前面的实验可在聚乙二醇化之后推测生物活性。技术人员也可增加改变连结剂大小，长度或分子量的步骤来优化或赋予生物活性。
已制备了一些轭合物。按实施例10描述的方法将上文所述30kDaTNFbp c105突变型蛋白与PEG乙烯砜结合。实施例8显示在相似条件下用含有四个游离半胱氨酸的天然IL-lra进行反应。c84IL-lra突变型蛋白质也很好地进行反应。实施例13显示3个30kDa TNF抑制剂突变型蛋白质与3个结合在甘油骨架上的PEG链结合。
本发明的轭合物可用于各种目的，包括但不限于体外诊断测定和制备药物组合物。本发明的许多轭合物与未轭合分子相比较至少具有一个下列特性：
(1)增加在水溶液中的溶解性；
(2)减小抗原性或免疫原性；
(3)由于表观分子量的增加而减小皮下或系统给药后的清除速率。
含有IL-lra的轭合物的药物制剂是特别有用的。单独或与30kDaTNF结合蛋白组合的IL-lra可用于治疗关节炎、炎症性肠疾病、败血病休克、局部缺血损伤、再灌注损伤、骨质疏松、哮喘、胰岛素型糖尿病、髓性和其它的白血病、牛皮癣、成人呼吸窘迫综合症、恶病质/厌食和肺纤维化。
含有TNF结合蛋白(“TNFbps”)的轭合物也是特别有用的。此轭合物可用于治疗TNF-介导的疾病如成人呼吸窘迫症、肺纤维化、关节炎、败血病休克、炎症性肠疾病、多发性硬化、移植排斥和出血损伤。
本发明生物活性轭合物可进一步包括非生物活性部分。
本发明也包括基本上纯的具有式R1-X-R2的化合物，其中R1和R2中至少一个为生物活性分子，该分子具有与X(迈克尔受体活化的聚合物)形成共价键的反应性硫羟部分。在本发明中，R1-X-R2的生物活性保留R1或R2的生物活性。具有式R1-X-R2的分子在本文中称作“哑铃”分子。
如本文所述，本发明的化合物基本上是纯的。本文中的“基本上是纯的”意指：“均匀组合物”。均匀组合物含有分子式R1-X-R2和基本上不含有(1)偏离R1或R2组分的化合物或(2)通过不止一个活化聚合物连结在一起的化合物。均匀组合物可含有长度不同的X的R1-X-R2分子。对于直链聚合物；用(Z)n来表示，其中Z为单体单元，n大于6且优选大于10。为了获得均匀组合物，R1和R2不需与X上的相同部位或R基团的相同部位连接。
X为具有第一个反应性基团和第二个反应性基团的非肽聚合物。“反应性基团”是能与R反应的基团。X上至少一个反应性基团为迈克尔型受体。术语“反应性基团”和“官能基团”在本文为同义词。上文也讨论了适用于本发明的聚合物且如包括PEG、POG和PVA。
“迈克尔受体”是易于进行迈克尔加成的官能基。“迈克尔加成”包括在毗邻Pi系统(具有负电的原子)的亲电中心上进行亲核攻击。具有负电原子的π系统的实例包括亚砜基、磺酰基、羰基和杂环芳香物。亲核物加到亲电中心。
迈克尔受体可用下式来表示：其中E为电负性原子。在4位上发生加成反应形成下式结构：其中Nu表示现于4位原子结合的亲核物。迈克尔受体功能基包括但不是限于马来酰亚胺和乙烯砜。形成哑铃的活化的聚合物可以但不是必须含有迈克尔受体的乙烯砜种类。
本发明的活化聚合物包括具有两个或多个迈克尔受体基团的PEG，如包括PEG-二-乙烯砜和PEG-二-马来酰亚胺。按实施例7所述方法来制备PEG-二-乙烯砜。可按PCT公开WO 92/16221所述方法制备PEG-二-马来酰亚胺(该文献为本文的参考文献)。
与X或X-R偶联前，R1和R2至少之一是生物活性的。“生物活性的”定义同上。如上文所述，生物活性分子包括但不局限于结合蛋白和靶基团。R1和R2均可以是生物活性的但不是必须的。在某些情况下，如果R1和R2对相同配体具有亲和性哑铃分子比单独的R1或R2对配体具有更强的亲和性。出版的PCT公开号WO 92/16221显示通过PEG聚合物连结的含有两个30kDa TNFbp分子的哑铃分子在体外测定中比单独的30kDa分子在抑制TNFs细胞毒性方面更好。在某些情况下，R1可为引导R1-X-R2化合物到达生物系统中特定部位的分子而R2对那个部位的配体具有亲和性。另外，在R1-X-R2化合物中R1和R2仅有一个为生物活性的。非生物活性基团可为表面或任何其它生物惰性分子或化合物。
在本发明中，生物活性R基团具有反应性硫羟部分。生物活性R基团可为合成的分子。本文所使用的“合成分子”意指加上反应性硫羟部分的分子。合成分子如包括含非天然半胱氨酸的突变型蛋白。硫羟部分与聚合物的迈克尔型受体反应而形成共价键。
形成共价键之后，生物活性分子保持其生物活性。本发明中R基团“保留其生物活性”是指在与活化的聚合物反应后，至少具有与聚合物反应前十分之一的生物活性，优选至少40％，更优选至少60％。
制备哑铃分子一般方法为：
(1)选择具有所需生物活性的R基团，例如，蛋白质如肿瘤坏死因子结合蛋白质(TNFbp)。
(2)使用相关的生物测定法测量其活性。
(3)采用本领域已知的方法，测定游离硫羟基的数目，如未包含在二硫键中的半胱氨酸残基。在A11en，G.，“蛋白质和多肽测序，”第153-54页，生物化学和分子生物学实验技术，work，T.S.，和Burdon，R，H.编(1972)中描述了这样的方法。如果没有游离的半胱氨酸，进行4(a)步。如果有一个游离的半胱氨酸，或仅有一个易于接触聚乙二醇化试剂，进行4(c)反应步骤。如果蛋白质具有多于一个的游离半胱氨酸，进行第5步。
(4)当R为多肽且没有游离半胱氨酸存在时：
(a)通过插入一个半胱氨酸或用半胱氨酸取代非半胱氨酸残基来产生突变型蛋白。有用的突变型蛋白部位包括蛋白质的N或C末端，糖基化部位或赖氨酸残基。突变型蛋白质如上文所述可通过化学合成或重组技术来常规性地制备。另外，以化学方式加上硫羟部分。
(b)测量活性并将该活性与步骤2中所测的活性进行比较。
(c)如果该突变型蛋白保留了步骤2中所测的活性，将该突变型蛋白与具有单个硫氢基优选的反应性基团的聚合物(如PEG)进行反应。如果该突变型蛋白质与单个反应性PEG结合(变为PEG化的)，测量活性并将该活性与步骤2中所测量的活性进行比较。如果聚乙二醇化的突变型蛋白保留了步骤2中所测定的活性，将未聚乙二醇化的突变型蛋白与具有两个硫羟特异的迈克尔受体(如二-马来酰亚胺)的PEG反应而产生哑铃分子。重复生物测定来确定哑铃分子保留了生物活性。
如果本领域技术人员需要R1和R2不同，可将二-反应性的聚合物基团依次与R1和R2反应。聚合物与R1反应前，将具有两个官能基的聚合物中的一个阻断或通过化学领域的公知方法来保护以在X上形成保护基。参见Greene，T.W.等有机合成中的保护基团，John Wiley和Sons，Inc.(1991)，该文献引入本文供参考。在本文中“保护”意指官能基不进行反应。当具有保护基的X与R1反应时，形成R1-X而不是R1-X-R1。形成R1-X之后，与R2反应前除去阻断或保护基。“脱保护”意指去除保护基或使官能基能够进行反应。
另外，可通过R1与过量的双活化的聚合物反应而迫使形成R1-X来形成异形哑铃。反应后，采用本领域公知的色谱层析技术(如包括离子交换色谱层析)来从反应混合物中分离R1-X。然后使R1-X与R2反应而形成R1-X-R2。
(d)如果由4(a)步中产生的突变型蛋白或由步骤4(c)中形成的聚乙二醇化的突变型蛋白基本上不保留生物活性，用天然蛋白质开始，产生不同的突变型蛋白质，并重复步骤4(b)和4(c)。另外，聚合物X的长度或分子量可被改变来优化或赋予生物活性。
(5)对于含有一个以上游离半胱氨酸的蛋白质来说，进行单聚乙二醇化、生物测定并与双官能的聚乙二醇化试剂反应。如果形成高级(high-ordered)结构，即PEG连结了两个以上的蛋白质，通过本领域已知的色谱层析法分离哑铃分子。出于任何原因此分离不合乎需要时，去除或用另外的氨基酸置换游离的半胱氨酸并进行步骤4(b)。
(6)对于非蛋白生物活性R基团来说，利用游离的硫氢基来与聚合物X结合。如果需要，将游离的硫氢基加到分子上。
本领域技术人员可以选择性地改变、增加或减去某些步骤。例如，可以选择使反应性蛋白质与双官能的PEG反应并跳过单聚乙二醇化步骤。
已制备了本发明的某些哑铃分子。公开的PCT申请WO 92/16221(本文参考文献)描述了用二-马来酰亚胺基-PEG来制下列哑铃分子：30kDa TNF抑制剂均匀哑铃，Il-2抑制剂异型哑铃、抑制补体经典途径的异型哑铃和Il-Ira和PDGF异型哑铃。
可制备含有多种本发明轭合物或化合物(总称为“轭合物”)的药物组合物。这些轭合物可被混入药用可接受的载体而形成本发明药物组合物。术语“药用可接受的载体”在本文中意指无毒的对活性组分通常为惰性的赋型剂，它对组分或给予该组合物的病人不产生不利的影响。在经典的药物教课书中可找到合适的赋型剂或载体，如Remington’sPharma ceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)，引入本文供参考。这类载体如包括水溶液如碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、林格(Ringer’s)溶液和生理盐水。另外，该载体可包括其它改善或维持制剂的pH、渗透性、粘滞性、澄明度、颜色、无菌、稳定性、溶出速度或气味的药用可接受的赋型剂。
通过本领域已知的方法可制备本发明的药物组合物，如包括通过简单混合各组分的方法。本领域技术人员会知道如何根据使用目的和给药方式来选择药物载体并制成合适的组合物。
在一个实施方案中，可预料到由载体和轭合物构成生理上相容的缓慢释放的剂型。作为载体的主要溶剂可为本质上为水性的或非水性的。另外，该载体可包含其它改善或维持制剂的pH、渗透性、粘度、澄明度、颜色、无菌性、稳定性、溶出速度或气味的药理可接受的赋型剂。类似地，该载体还可包含其它改善或维持轭合物的稳定性、溶出速度、释放或吸收的药理可接受的赋型剂。这类赋型剂是那些常规和习惯上用于配制以单位剂量或多剂量形式非胃肠道给药剂型的物质。
一旦制成药物组合物，可将其作为溶液、混悬液、凝胶、乳剂、固体或脱水的或冷冻干燥的粉剂贮存在无菌小瓶中。该制剂或者以备用形式贮存或以给药前重新配制形式贮存。该制剂优选在至少低于4℃的温度下贮存，更优选-70℃。含有轭合物的这类制剂也优选在近生理pH下贮存并使用。现相信制剂在高pH(即大于8)或低pH(即低于5)下使用是不合乎要求的。
含轭合物制剂的系统释放给药方式可为皮下、肌内、静脉、口腔、鼻内或阴道或直肠栓塞。含轭合物制剂的局部释放给药的优选方式为关节内、气管内或吹入或吸入呼吸道。另外，通过合适制剂或装置口服给予轭合物来将轭合物给到消化道的特定部位可能是合乎需要的。
在另一个治疗骨质疏松和其它骨损失疾病的合适方式中，如开始静脉给予TNF抑制剂轭合物IL-1抑制剂轭合物的团状注射液，然后继续静脉输注TNF抑制剂轭合物和IL-1抑制剂轭合物。对于口服给药来说，轭合物是被包囊的。可用或不用习惯上用于制备固体剂型的药用可接受的载体来配制包囊的轭合物。优选地，设计为胶囊，以便制剂的活性部分释放到胃肠道的生物利用度最大而系统前降解最小的部位上。其它赋型剂可包括促进轭合物吸收的。稀释剂、香味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、混悬剂、片剂崩解剂和粘合剂也可被使用。
不管给药方式如何，具体剂量按患者的大约体重来计算。决定合适剂量的其它因素可包括被治疗或预防的疾病、给药的途径和患者的年龄、性别和医疗条件。在某些实施方案中，将剂量和使用方法设计为在患者血液中产生预定浓度范围的轭合物。例如，相信维持TNF抑制剂和IL-1抑制剂的循环浓度低于0.01ng/ml血浆可能不是有效的组合物，同时，长期维持高于10μg/ml的循环浓度也可能具有不合乎需要的副作用。本领域普通技术人员常规性地进行对测定治疗的合适剂量(包括各个上文所述的制剂)所必须的进一步的精确计算，而且这种计算属于本领域技术人员的常规工作且不需要进行实验，特别是按照本文所公开的剂量信息和测定方法。通过使用测定使用剂量以及合适的量效数据所建立的测定方法可确定这些剂量。
应当注意到本文所述轭合物制剂可用于兽医学和人类医学且术语“患者”不应以限定方式来解释。在兽医使用时，剂量范围应与上文所述相同。
下列实施例描述本发明但不对本发明构成限制。
实施例1 合成
如下概括性地说明反应步骤：
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
下文详细描述上述反应的各步骤：
反应1：该反应表示制备聚乙二醇的甲磺酸酯，它也可被称作Polyethylene glycol的methanesulfonate或mesylate。可通过相似的方法制备甲苯磺酸酯和卤化物，相信这对技术人员来说是显而易见的。
为了制备甲磺酸酯，通过在150ml甲苯中共沸蒸来干燥25g分子量为3400的PEG。在干燥PEG中大约有一半的甲苯被蒸去。将40ml的二氯甲烷加到甲苯和PEG溶液中，然后在冰浴冷却。在冷却溶液中，加入1.23ml蒸馏的甲磺酰氯(它相对于PEG羟基为1.6当量)并加入2.66ml的无水三乙基胺(它相对于PEF羟基为1.3当量)。“当量”在本文中可被看作是“化合量”并指将与一当量PEG羟基反应的化合物的重量。
允许反应进行过夜，并在此期间温热到室温。用盐酸三乙基胺进行沉淀并过滤除去该沉淀物。然后，通过旋转蒸发将体积减至20ml。加入100ml冷的无水乙醚使甲磺酸酯沉淀。核磁共振(NMR)分析显示羟基100％地转化为甲磺酸基。
反应2：该步骤表示通过甲磺酸酯与巯基乙醇反应形成聚乙二醇巯基乙醇。该反应使得PEG中的甲磺酸基团被置换。巯基乙醇基团中的硫被直接连结到PEG碳-碳骨架上的碳上。
20g由反应步骤1获得的甲磺酸酯溶于150ml蒸馏水。浸入冰浴中使甲磺酸酯和水的溶液冷却。在冷却溶液中加入2.37ml的巯基乙醇(它相对于PEG羟基来说为3当量)。也加入16.86ml的2N NaOH碱。将反应回流3小时，其意思是由加热反应产生的蒸汽被连续缩合并允许其流回到反应中。
用二氯甲烷提取聚乙二醇巯基乙醇产物三次，每次使用大约25ml的二氯甲烷。收集有机部分并用无水硫酸镁干燥。将体积减至20ml并通过加入150ml冷的无水乙醚而使产物沉淀。
在d6-DMSO(二甲基亚砜)中进行NMR分析获得下列峰：PEG-SCH2CH2OH：2.57ppm，三重，-CH2-S-；2.65ppm，三重，-S-CH2-；3.5ppm，骨架单峰；和4.76ppm，三重，-OH。-S-CH2-峰的积分表明100％取代。
反应3：该步骤表示过氧化物氧化聚乙二醇巯基乙醇产物而使硫(S)转化为砜(SO2)。产生PEG-β-羟基砜。
将20g PEG-SCH2CH2OH溶于30ml的0.123M钨酸溶液并在冰浴中冷却。通过将该酸溶于pH11.5的氢氧化钠溶液，然后用冰醋酸将pH调到5.6来制备钨酸溶液。将20ml的蒸馏水和2.88ml的30％过氧化氢(它相对于羟基来说为2.5当量)加到钨酸和聚乙二醇巯基乙醇溶液中并允许反应温热过夜到室温。
用二氯甲烷提取氧化产物三次，每次使用25ml二氯甲烷。用稀的碳酸氢钠水溶液洗涤收集的有机部分并用无水硫酸镁干燥。将体积减至20ml。加入冷的无水乙醚沉淀PEG-β-羟基砜产物。
在d6-DMSO中的NMR分析获得PEG-SCH2CH2OH的下列峰：3.25ppm，三重，-CH2-SO2-；3.37ppm，三重，-SO2-CH2-；3.50ppm，骨架；3.77ppm，三重，-CH2OH；5.04ppm，三重，-OH。5.04ppm羟基峰表明85％取代。然而，3.37ppm的-SO2-CH2-峰表明100％取代并被认为是非常可靠的。
反应4：该反应表示聚乙二醇氯代乙基砜的合成、分离和表征的最后步骤。
为了合成产物，将20g的PEG-SO2CH2CH2OH(PEG-β-羟基砜)溶于100ml的新鲜蒸馏的亚硫酰氯并将该溶液回流过夜。该亚硫酰氯已被蒸过喹啉。蒸馏除去过量的亚硫酰氯。加入50ml的甲苯和50ml二氯甲烷并经蒸馏除去。
为了分离产物，将PEG氯乙基砜溶于20ml的二氯甲烷中并加入100ml冷的无水乙醚进行沉淀。用50ml乙酸乙酯重结晶沉淀物来分离产物。
使用核磁共振来对产物进行表征。在d6-DMSO中对PEG-SO2CH2CH2Cl进行NMR分析获得下列峰：3.50ppm，骨架；3.64ppm，三重，-CH2SO2-；3.80ppm，三重，-SO2-CH2-。在3.94ppm处显示小量羟基杂质的三重峰。难以计算该谱的取代百分数，因为重要的峰邻近于很大的骨架峰。
反应5：该步骤表示将反应步骤4中获得的聚乙二醇氯代乙基砜转化为聚乙二醇乙烯砜并分离和表征该乙烯砜产物。
通过将固体PEG氯代乙基砜溶于二氯甲烷溶剂中，然后加入2当量的NaOH碱，易于制备PEG乙烯砜。过滤溶液以除去碱并蒸去溶剂以分离最终产物PEG-SO2-CH＝CH2(PEG乙烯砜)。
通过在d6-DMSO(二甲基亚砜)中进行NMR分析来对PEG乙烯砜进行表征。NMR分析显示下列峰：3.50ppm，骨架；3.73ppm，三重，-CH2SO2-；6.21ppm，三重，＝CH2；6.97ppm，双重双重，-SO2-CH-。-SO2-CH-的6.97ppm峰表示84％取代。＝CH26.21ppm的峰表明94％取代。用巯基乙醇和2，2′-二硫代二吡啶研制表明95％取代。
实施例2： 硫羟选择性反应
实施例2显示PEG乙烯砜及其前体PEG氯代乙基砜与硫羟基(-SH)的反应明显比与氨基(-NH2)或亚氨基(-NH-)容易的多。含有硫羟基的化合物是有机化合物，类似于醇(含有羟基-OH)，只是在硫羟基中，羟基的氧原子被硫置换。硫羟有时也被称作硫氢或巯基。PEG乙烯砜含有乙烯砜基团-SO2-CH＝CH2。PEG氯代乙基砜含有氯代乙基砜基团-SO2CH2CH2Cl。
在蛋白质的修饰中，硫羟的选择性是重要的，因为这意味着对半胱氨酸单位(含-SH)的修饰会优先于对赖氨酸单元(含-NH2)和组氨酸单元(含-NH-)的修饰。PEG乙烯砜对硫羟的选择性意味着PEG可选择性地与半胱氨酸单元结合，因此，保护了具体蛋白的蛋白活性并控制蛋白质结合到PEG分子上的数目。
通过测量PEG乙烯砜和N-α-乙酰赖氨酸甲酯以及和巯基乙醇的反应速率来确定PEG乙烯砜与硫羟和氨基的相对反应性。N-α-乙酰赖氨酸甲酯是含有氨基的赖氨酸模式并被缩写为Lys-NH2。巯基乙醇起含有硫羟基的半胱氨酸模式作用并被缩写为Cys-SH。对PEG氯代乙基砜的相对反应性也进行类似的测定。该分子可作为乙烯砜的“保护”形式起作用，因为它在酸中是稳定的但在加碱时转化为PEG乙烯砜。
在pH8.0、pH9.0和pH9.5时研究了PEG乙烯砜和PEG氯乙基砜前体的反应性。控制pH的缓冲液是在pH8.0时为0.1M的磷酸盐而在pH9.0和pH9.5时为0.1M的硼酸盐。为了测量巯基乙醇的反应性，将5mM乙二胺四乙酸(EDTA)加到两种缓冲液中来防止硫羟基转化为二硫化物。
为了使本发明的PEG衍生物与Lys-NH2进行反应，在搅拌下，将3mM PEG衍生物溶液分别加到在合适缓冲液中的0.3mM Lys-NH2溶液中，该缓冲液具有3个碱性pH值。通过将荧光胺(fluorescamine)加到反应溶液中而因与剩余的氨基反应产生荧光衍生物来检测反应。该检测步骤是通过将50μl的反应物加到pH8.0的1.95ml的磷酸盐缓冲液中然后在剧烈搅拌下加入1.0ml的荧光胺来进行的。荧光胺溶液为每毫升丙酮含有0.3mg荧光胺。
混合后10分钟测量荧光。在390nm的波长下进行激发。在475nm下产生光的发射。在24小时中，pH8.0时的PEG乙烯砜或PEG氯代乙基砜未观察到有反应发生。pH9.5时，该反应是缓慢的，但几天后所有的氨基都被反应。
为了使PEG乙烯砜和PEG氯代乙基砜前体与Cys-SH进行反应，将2mM PEG衍生物溶液分别加到在合适缓冲液中的0.2mM的Cys-SH溶液中，该缓冲液具有3个碱性pH值。通过将4-二硫代吡啶加到反应溶液中来检测反应。4-二硫代吡啶化合物与Cys-SH反应产生4-硫代吡啶酮而吸收紫外光。
该检测步骤是通过将50μl反应混和物加到pH8.0并含有5mMEDTA的0.95ml 0.1M磷酸盐缓冲液中然后在相当缓冲液中加入1ml2mM的4-二硫代吡啶来进行的。
测量324nm处的4-硫代吡啶酮的吸光度。PEG乙烯砜和PEG氯乙基砜均显示对Cys-SH的反应性而PEG乙烯砜的反应性更强。在pH9.0时，使用乙烯砜，反应在两分钟内结束而使用氯代乙基砜，反应在15分钟内结束。然而，对于测定准确的速度常数来说，这些反应太快。pH8.0时，该反应是较慢的，乙烯砜在1小时中完成，氯代乙基砜在3小时内完成。氯代乙基砜转化为乙烯砜明显比乙烯砜与Cys-SH的反应要慢。因此显示氯代乙基砜与Cys-SH的反应速度取决于氯代乙基砜转化为乙烯砜的速度。然而，这些反应速度仍比Lys-NH2的反应快的多。
上述动力学的研究表明下列观点：PEG乙烯砜与硫羟基的反应比与氨基的反应容易的多，表明PEG乙烯砜与含有半胱氨酸和赖氨酸的蛋白质的结合主要通过与半胱氨酸反应来进行。因为与氨基的反应性类似于与亚氨基的反应性，那么与组氨酸亚单位的反应性也会比与半胱氨酸亚单位的反应性低得多。而且，在较低的pH值下，PEG氯代乙基砜和PEG乙烯砜对硫羟基的选择性是重要的，尽管PEG氯代乙基砜的反应慢点。
许多PEG衍生物的利用受到了限制，因为他们与水快速进行反应，试图通过在水性条件下将该衍生物与分子和表面结合来进行干扰。以下实施例3显示PEG乙烯砜和PEG氯化乙基砜在水中的稳定性。
实施例3：水解稳定性
将PEG乙烯砜溶于重水中(D2O，氧化氘)，并用NMR检测。未发生反应。PEG氯代乙基砜的溶液在用硼酸缓冲到pH9.0的重水中产生PEG乙烯砜。用NMR检测显示一旦产生PEG乙烯砜在重水中稳定三天。
PEG氯代乙基砜在水中是稳定的直到溶液变为碱性，此时，它被转化为乙烯砜。通过将PEG氯代乙基砜溶于pH7的水和溶于pH9的硼酸缓冲液中来证明转化为乙烯砜。将PEG衍生物提取到二氯甲烷中，除去二氯甲烷再用NMR分析显示PEG氯代乙基砜在中性pH7.0下是稳定的而与碱反应产生PEG乙烯砜。
乙烯砜在水中稳定几天，甚至在碱性pH下也是如此。PEG乙烯砜的广泛的水解稳定性和硫羟特异的反应性意味着PEG乙烯砜及其前体物对于在水性条件下修饰分子和表面是有用的，如下述实施例4所示。
实施例4：与BSA的轭合
以两种不同方法将PEG衍生物与牛血清白蛋白(BSA)结合来说明蛋白质的修饰作用。BSA为一种蛋白质。天然未修饰的BSA含有没有硫羟基的半胱氨酸。半胱氨酸单元被束缚成二硫化物键(S-S)。
在第一种方法中，室温下在pH9.5的0.1M硼酸缓冲液中，将m-PEG(单甲氧基-PEG)乙烯砜(分子量为5,000)与未修饰的BSA反应24小时。每毫升该溶液含有1mg的BSA和1mg分子量为5000的m-PEG乙烯砜。由实施例2的模式化合物所得结果已表明在该较碱性的条件下并且不存在能反应的游离硫羟时赖氨酸亚单位(和可能的组氨酸亚单位)会被修饰。
以两种方法表明与赖氨酸亚单位的结合。首先，大小排阻色谱层析法显示蛋白质的分子量大约增加50％，因此表明10个PEG与该蛋白质结合。第二，荧光胺分析显示BSA分子中赖氨酸基团的数目大约减小10个。
在第二种方法中，用三丁基膦处理BSA以将二硫化物S-S键还原为硫羟基(SH)，该基团可进行反应。然后室温下在pH8.0的0.1M磷酸缓冲液中用PEG氯代乙基砜处理修饰的BSA1小时。每毫升该溶液含有1mg修饰的BSA和1mg分子量为5000的m-PEG氯代乙基砜。该结果显示在该条件下赖氨酸基团未进行反应。然而，硫羟基进行了反应。
通过大小排阻色谱层析法表明PEG与蛋白质结合，显示蛋白质的分子量增加大约25％。荧光胺分析表明蛋白质中赖氨酸的数目没有变化，因此证明PEG未与赖氨酸亚单位结合。由此证明取代发生在硫羟基团上。
实施例5：乙烯砜NHS-酯异双官能
PEG(3400)试剂的合成
简要地来说，在几步中合成PEG(3400)-ω-乙烯砜-α-丙酸琥珀酰亚胺基酯。首先，PEG(3400)-ω-羟基-α-丙酸的乙基酯被合成。第二，将乙基酯转化为ω-甲磺酸酯。第三，用甲磺酸酯制备ω-乙硫醇衍生物。第四将乙硫醇衍生物转化为ω-羟基砜。第五，将羟基砜转化为ω-乙烯砜。在第六步中将后面的α-乙基酯转化为α-丙酸。最后，将丙酸基团转化为琥珀酰亚胺基酯。详细合成过程描述如下：
步骤1.将15.0克的PEG(3400)-ω-羟基-α-丙酸，75ml无水乙醇和3ml硫酸加热回流1小时。冷却到室温后，将50ml水加到反应混合物中并用碳酸氢钠将pH调至7。使用旋转蒸发仪，在55℃下减压蒸发1.5小时来蒸去乙醇。用60、50和40ml二氯甲烷提取反应产物。用无水硫酸镁干燥提取物、浓缩至50ml并加到400ml的冷的二乙基醚中。滤出沉淀物并减压干燥。产生13.1克乙基酯。NMR分析显示49％丙酸乙基酯基团和51％PEG-OH基团。
步骤2.将13.0g(0.0038mol)的步骤1中形成的乙基酯衍生物、100ml甲苯和2.0gBHT的混合物加热回流共沸干燥。其次，在5℃温度下，加入15ml无水二氯甲烷、0.60ml(0.0043mol，1.15倍过量)三乙基胺和0.31ml(0.0040mol，1.07倍过量)甲磺酰氯并在室温和氮气环境下将混合物搅拌过夜。加入2ml无水乙醇并将混合物搅拌15分钟。然后过滤该混合物并减压蒸出大约70ml的溶剂而产生PEG-ω-甲磺酸酯-α-丙酸乙基酯。
步骤3.将下列物质加到大约40ml(0.00375mol)的步骤2中获得的PEG-ω-甲磺酸酯-α-丙酸乙基酯溶液中：150ml无水乙醇，1.79ml(0.0139 mol，3.69倍过量)巯基乙醇和0.45g(0.0011mol，3.0倍过量)溶于20ml无水乙醇的氢氧化钠，在58-62℃氮气环境中将混合物加热3小时。冷却到室温后，用乙酸将pH调到大约6.5并使用旋转蒸发仪在55℃下减压蒸馏40分钟而蒸去140ml乙醇。蒸馏后，将50ml二氯甲烷加到残渣中。用蒸馏水洗涤所得溶液并用无水硫酸镁干燥，将该溶液浓缩至30ml并加到350ml冷的二乙基醚中，滤出沉淀产物并减压干燥。产生11.5乙硫醇衍生物。NMR分析显示52％巯基乙醇基、35％丙酸乙基酯基团和13％PEG-OH部分。
步骤4.接着，制备11.5g PEG-ω-乙硫醇-α-丙酸乙基酯在12ml蒸馏水中的溶液，如下也制备钨酸溶液：0.14g钨酸、12.0ml蒸馏水和溶于6.0ml水中的0.05g氢氧化钠被混合形成pH11.5的溶液。在钨酸溶液中加入10％的NaH2PO4溶液使pH调到6.6。然后将12ml的乙基酯溶液加到pH6.6钨酸溶液中并用0.1M NaOH再将pH调到6.6。加入1.1ml30％过氧化氢并将反应混合物搅拌19小时。反应后pH为6.7。加入1M NaOH将pH调至7.2并将反应混合物搅拌1小时。将5g溶于45ml蒸馏水的氯化钠加到反应混合物中。用50ml二氯甲烷提取反应产物3次。如下用硫酸镁干燥提取物；10g粉状硫酸镁被加到提取物中并在两小时后滤去硫酸镁。将硫酸镁干燥的提取物浓缩至40ml并加到350ml冷乙醚中。滤出沉淀的产物并减压干燥。产量为9.7g且含有50％的羟基砜基团，39％丙酸乙基酯基团和11％PEG-OH基团，是通过NMR来决定。
步骤5.室温搅拌下在氮气环境中，将3.00ml(0.0215mol，3.97倍过量)三乙基胺和0.80ml(0.010mol，3.81倍过量)甲磺酰氯加到以下混合物中：9.6g(0.00271mol)的PEG-ω-羟基砜-α-丙酸，乙基酯(在步骤4中合成的)、50ml二氯甲烷和0.01g(0.1wt％/PEG)BHT。搅拌反应混合物15分钟、过滤并用150ml二氯甲烷稀释。然后用25ml1MHCl、25ml 10％NaCl和25ml水洗涤所得混合物。加入小量Na2HPO4来将水层pH调至7。然后用硫酸镁干燥反应混合物并浓缩至40ml。将所得溶液加到400ml冷的乙醚中。滤出沉淀产物并减压干燥而获得9.1g。NMR分析显示下列官能度：43％乙烯砜，16％甲磺酸酯和35％丙酸乙基酯。
步骤6.将1.0M NaOH加到9.0g PEG-ω-乙烯砜-α-丙酸，乙基酯衍生物的50ml蒸馏水溶液中来将pH调到12.0。并在保持pH在11.9到12.1(周期性地加入1.0M NaOH)的同时将溶液搅拌1.5小时。接着用草酸将pH调至3.0，在溶液中加入5g NaCl，并用50ml二氯甲烷提取反应产物3次。用无水硫酸镁干燥提取物、浓缩至30ml并加到350ml冷乙醚中。滤出沉淀物并减压干燥。产量为6.8g。通过NMR分析鉴定官能基为：乙烯砜40％，丙酸29％，丙酸乙基酯4％和17％甲磺酸酯。通过在DEAE Sepharose FF柱上进行离子交换色谱层析来纯化沉淀物。纯化后的产量为3.2g且NMR分析显示50％丙酸基团，38％乙烯砜基团和8％甲磺酸酯基团。
步骤7，室温下在氮气环境中，将3.0g PEG-ω-乙烯砜-α-丙酸，0.12gN-羟基琥珀酰亚胺、0.21g DCC(N，N′-二环己基碳化二亚胺)在20ml二氯甲烷中的混合物搅拌过夜。然后过滤反应混合物并加到250ml冷乙醚中。滤出沉淀 产物并减压干燥得到2.90g。NMR显示下列基团：琥珀酰亚胺50％，38％乙烯砜，10％甲磺酸酯和2％羟基砜。
实施例6：合成马来酰亚胺，NHS-酯
异双官能PEG(3400)试剂
在两步中合成马来酰亚胺，NHS-酯PEG试剂。在第一步中，合成马来酰亚胺基-PEG-OH。具体地来说，将0.130g马来酰亚胺基琥珀酰亚胺基丙酸盐溶于5ml无水二氯甲烷中并冷却到0℃。接着，加入按下文所述方法制备的0.5gPEG-单胺，然后加两滴三乙基胺。室温下两小时后，TLC表明反应完全。使用4∶1∶1的正-BUOH-ACOH-H2O进行TLC。蒸发反应混合物至干并将残渣溶于15ml蒸馏水中。使用15ml0.5MHCl将溶液pH调至3并用10mlCH2Cl2提取。用硫酸镁干燥有机层、过滤、浓缩至15ml并倾入75ml冷乙醚中。过滤沉淀物并真空干燥。产量为0.300g。NMR分析显示77％马来酰亚胺基团和100％PGE-OH。
在第二步中，将马来酰亚胺基-PEG-OH转化为马来酰亚胺-PEG-NHS-酯。在室温下氮气环境中，搅拌2ml CH2Cl2、0.05ml吡啶(1当量)、1ml乙腈和0.266g马来酰亚胺基-PEG-OH。将0.070g(2.5当量)N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加到混合物中并将反应物放置过夜。然后将反应混合物倾入大约50ml冷乙醚中。过滤并真空干燥。NMR显示有杂质并将产物进行第二次沉淀，最终产量为0.230g。
在下列三步中制备上文第一步中使用的PEG-单胺。第一步，制备PEG-甲磺酸酯衍生物。由甲磺酸酯制备胺。最后，从未衍生的PEG和二胺中分离单胺。
步骤1，将PEG-3400(120g，0.07164当量的OH)溶于580ml甲苯，共沸干燥，然后加入90ml二氯甲烷、1.80ml三乙基胺(0.01291mol)和0.83ml甲磺酰氯(0.01072mol)。室温下反应过夜后，减压从反应混和物中蒸去90ml溶剂，过滤混合物，然后减压蒸去500ml甲苯。将残余物加到800ml冷乙醚中。滤出沉淀产物并减压干燥。产量为118g且取代物为15％。
步骤2，将118g步骤1中形成的甲磺酸酯和80g氯化铵溶于1600ml浓氨水中并在室温下搅拌44小时。用600，400和200ml二氯甲烷提取反应产物。用170ml2％KOH和170ml水洗涤提取物、用硫酸镁干燥、浓缩至200ml并加到800ml冷乙醚中。滤出沉淀产物并减压干燥。产量为106g且取代物为15.6％。
步骤3，将45g步骤2中形成的胺溶于9L水并装在SP-SepharoseFF(300ml用1000ml柠檬酸-柠檬酸锂缓冲液(0.4％，pH3.0)平衡的凝胶，然后用水洗脱)上。从Pharmacia，Uppsala，Sweden处购得SP-Sepharose FF。用水将未衍生的PEG从柱中洗出。接着，用800ml 20mMNaCl洗脱PEG单胺。用1M NaOH将洗脱液的pH调到11并用二氯甲烷提取PEG单胺、用硫酸镁干燥，并蒸去溶剂。产量为9克。
实施例7：PEG-α、ω-二乙烯砜的合成
使用PEG二醇和上文所述的总的方法来合成3400和20000kDaPEG二-乙烯砜。PEG二醇购自Fluka Chemical Corporation(Ronkonkoma，New Youk)或Nippon Oil和Fat(Tokyo，Japan)。
实施例8：使用PEG-20,000-α，
ω-二乙烯砜来聚乙二醇化IL-lra
按出版的PCT申请WO 92/16221(本文参考文献)所述方法制备IL-lra c84突变型蛋白。在25℃温度下pH6.75-7.5的柠檬酸缓冲液中，于1ml管中用PEG-α，ω-二乙烯砜(3400或20,000kDa)轭合c84突变型蛋白或天然(野生型)IL-lra，同时改变PEG和蛋白质浓度。在30mg/ml的蛋白质浓度时，18小时内获得好的转化为哑铃分子的结果。0.94mg/ml蛋白质浓度时，获得大多数单个加成结果。100mg/ml蛋白与0.03当量的PEG时优先形成哑铃物质。用PCT公开WO 92/16221(本文参考文献)所述的色谱层析技术可纯化哑铃。
在其它实验中，用0.53摩尔当量的20kDa PEG-二乙烯砜在25℃温度下处理含有30mg/ml野生型IL-lra的pH8.5，0.1 M Tris-HCl缓冲液18小时。SDS PAGE分析显示转化为哑铃和单加成物。在3.1mg/ml蛋白质浓度和1摩尔当量PEG试剂时，仅观察到有单加成物。
总之，c84突变型蛋白与PEG试剂的反应比野生型分子与PEG的反应容易。
实施例9： IL-lra哑铃的生物活性
使用PCT申请公开WO 92/16221(本文参考文献)所述测定法分析比较上述产生的c84哑铃分子和未聚乙二醇化的重组IL-lra对小鼠EL-4细胞的受体结合亲合力。结果显示两种分子具有类似的结合亲合力。
实施例10：用PEG-20,000-α，ω-二乙烯砜使
TNFbp c105突变型蛋白聚乙二醇化
按出版的PCT公开WO 92/16221(本文参考文献)所述方法制备TNFbp的c105突变型蛋白。另外，如下制备c105突变型蛋白。
通过离心收集表达c105突变型蛋白质的大肠杆菌细胞。通过加入纯水将细胞沉积物调节到40％的湿重固体。然后再用等体积的破裂缓冲液(50mM氨基丁三醇、4mM EDTA，pH7.2)稀释混合物而获得大约20％湿重固体的混悬液。将细胞沉积物五次通过以大约8000psi运转的高压匀浆机来产生细胞匀浆。每一次通过匀浆机之前，都将匀浆冷却到低于或等于10℃。将匀浆离心并保留含c105的固体部分。将固体稀释并再一次离心而获得浸润(washed)包涵体。
加入8M脲和150mM半胱氨酸(在50mM TRIS，pH9.5)使浸润包涵体溶解。重新折叠之前在室温下搅拌该混合物2小时。在这种条件下，c105突变型蛋白被变性和还原。
通过用1.1M脲、50mM Tris稀释来重新折叠还原变性的c105突变型蛋白质而获得含有200μg/ml c105突变型蛋白质、1.5M脲、7.5mM半胱氨酸、50mM Tris(pH9.7)的最终重新折叠的溶液。该重新折叠的混合物在被6-10℃下放置两天。通过反相HPLC和阳离子交换HPLC来检测重新折叠的效率。
加入乙酸和HCl重新折叠的混合物的pH为5.0。将重新折叠混合物装在阳离子交换柱(S-Sepharose大颗粒树脂)上，使用前用25mM乙酸钠、65mM NaCl(pH5)在4℃下进行平衡。装柱后，用同样的平衡缓冲液洗涤柱子。用65到350mM NaCl在25mM乙酸钠(pH5)中的梯度液洗脱柱子。在大约200mM NaCl时洗下c105突变型蛋白质并收集在一起。
用1.5倍体积的5M NaCl稀释含c105突变型蛋白的收集液，用40mM磷酸钠将pH调至6并装在疏水水性相互作用的柱上(Toyo Butyl 650M柱)，使用前以3M NaCl、20mM磷酸钠(pH6)进行平衡。装完后，用平衡缓冲液洗涤柱子。使用在20mM磷酸钠(pH6)中的3到1M NaCl的线性8个柱体积递减盐梯度液来洗脱c105突变型蛋白质。将c105突变型蛋白收集在一个池中。然后将其浓缩到大约3g/L c105突变型蛋白并对20mM磷酸钠(pH6.0)透析滤过直到最终导电率低于4mmho(大约为6倍体积)。
将透析液装在以20mM磷酸钠(pH6.0)平衡的SP-Sepharose高效柱上。装完后，用另外的平衡缓冲液洗涤该柱并用从20mM磷酸钠，50mM NaCl(pH6.0)到20mM磷酸钠、50mM)NaCl(pH6.5)的pH/盐组合梯度液进行洗脱。大约在35mM NaCl的后半梯度中洗出c105突变型蛋白。此时可冷冻贮存该c105突变型蛋白质。
将c105突变型蛋白质以1∶1、2∶1、4∶1、1∶2和0∶1(对照)的PEG试剂与蛋白质的摩尔比来与聚乙二醇化试剂反应。该反应在22℃温度下在pH7.5 20mM的磷酸盐/20mM乙酸盐缓冲液中进行15小时。也在pH7.5或8.5的50mM磷酸盐缓冲液中进行反应。
通过在MA7S柱上的阳离子交换来确定转化为哑铃分子的百分数。转化百分数的范围大约为40-60％。以0.50-0.65PEG试剂与1.0的TNFbp突变型蛋白摩尔比在22℃温度下pH7.5时将大约50mg/ml PEG试剂溶液加到蛋白质中15小时使转化为哑铃分子最优化。当PEG与蛋白质的比例增加时，促进单加成物的生成。5∶1比例的PEG试剂与蛋白质使单加成物的形成最优化。
在S-Sepharose HP柱上进行色谱层析来纯化轭合物。将反应混合物pH调至3.0-4.2并装在预先调到相同pH的柱上。用平衡缓冲液洗涤柱子并使用线性氯化钠梯度液和以1.2-1.5cm/min洗脱哑铃分子。以下列顺序从柱中洗脱下物质：1)单取代物，2)哑铃分子，3)未聚乙二醇化的TNFbp突变型蛋白和4)凝聚的突变型蛋白。
实施例11：TNFbp c105突变型蛋白
哑铃分子的生物活性
通过在WO 92/16221(本文参考文献)所述的L929细胞毒性测定中的比较，显示不管是按PCT申请公开WO 92/16221所述方法或是按本文所述方法由PEG-二马来酰亚胺形成的c105哑铃分子的活性比未聚乙二醇化30kDa TNF抑制剂强50到100倍。
实施例12：制备甘油基-PEG-三乙烯砜
使用上文所述常规方法将甘油基-PEG-α，β，γ-三醇(10,000kDa和20,000kDa)转化为乙烯砜衍生物。从Union Carbide，Terrytown，New York购得甘油基-PEG-α，β，γ-三醇。通过在碱中甘油的环氧乙烷聚合开环可合成甘油基PEG-α，β，γ-三醇。
实施例13：使用甘油基-PEG-三乙烯砜来合成
TNFbp c105三哑铃(trumbbell)
将三个TNFbp c105突变型蛋白轭合到PEG-三乙烯砜上以产生“三哑铃”分子。在大的PEG：蛋白质的范围配比内进行的实验表明转化为三哑铃分子的特别有用的摩尔比为0.25-0.35PEG比1的蛋白质。在典型实验中，25℃温度下使溶于20mM磷酸盐、20mM乙酸盐缓冲液(pH7.5)的c105突变型蛋白质与0.03摩尔当量的甘油基-PEG-10,000-α，β，γ-三醇反应18小时。经阳离子交换HPLC(Bio RadMA7S柱，用氯化钠梯度液洗脱)分析后者的反应混合物表明以49％产率转化为三哑铃分子并以34.9％产率转化为双取代物。
实施例14：用甘油基-PEG-三乙烯砜
合成IL-lra三哑铃分子
以下列PEG/蛋白质摩尔比，将PEG-10,000-α，β，γ-三乙烯砜与20mg/ml野生型IL-lra在0.1M磷酸盐缓冲液中进行反应：0.10∶1；0.25∶1；0.35∶1；0.45∶1；0.55∶1；0.65∶1。将反应在25℃保温72小时。SDSPAGE分析显示转化为单、双和三加成产物。观察到在0.10∶1的PEG/蛋白质配比时最适于转化为三加成物。将反应混合物装在S Sepharose高效柱上并用氯化钠梯度液洗脱。
实施例15：合成c105 TNFbp-PEG-
IL-lra异型哑铃
以下列摩尔比和指定的IL-lra浓度使野生型IL-lra的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5)与8mg/ml PEG-20,000-二乙烯砜-单-c105TNFbp加成物进行反应：55∶1(12.5mg/ml)；85∶1(18.75mg/ml)；100∶1(25.0mg/ml)和150∶1(31.75mg/ml)。72小时后，经SDS PAGE确定形成异型哑铃。观察到在1∶100的单加成物与IL-lra的配比时最适于转化。用S Sepharose高效柱对异型哑铃进行纯化并用氯化钠梯度液洗脱。
实施例16：PEG-乙烯砜多肽加成物的稳定性
研究c105 TNFbp突变型蛋白质和PEG-二乙烯砜之间的键的稳定性。将已知量的c105哑铃分子在PBS(pH7.4)中37℃温度下保温一周，在此期间不时取出等分试样进行SDS PAGE分析。观察到c105哑铃分子基本上没有分解。在pH10、37℃保温1周时，观察到仅有5-10％的轭合物的分解物。
实施例17：TNFbp c105哑铃分子对主动诱导
的实验性变应性脑脊髓炎(“EAE”)的抑制
已研究了用PEG-二乙烯砜制备的c105哑铃分子的体内活性。EAE是一种中枢神经系统的自身免疫炎性脱髓鞘疾病的小鼠模型，经常用作人MS的模型。如下文所述，c105哑铃分子抑制大鼠的EAE。
从Charles River(Raleigh，NC)处购得雌性Lewis大鼠(150-200g)，并在开始实验前至少饲养1周。它们自由进食和进水并在室内温度和光线控制(12小时/天)下饲养。在每个实验中，动物的年龄是一致的。
主动诱导EAE：用2％异氟烷+O2麻醉大鼠(通常每组6只)并在0天于大鼠左后肢的足掌部用0.1ml下列之一剂量的含髓磷脂碱性蛋白(“MBP”)的乳剂来免疫：0，1，3，10或30μg(片断68-84，Bachem.Bioscience，PA)。将MBP溶于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中并用相同体积的含5mg/ml的结核杆菌H37Ra(Difco Lab，MI)的弗氏完全佐剂乳化(CFA)。对照大鼠在左后肢的足掌上，接受0.1ml不含MBP的PBS/CFA乳剂。
EAE的临床评价使用常规的0-5评分系统每天进行临床疾病的评价。简单地来说，等级范围为：0为正常，0.5为部分失去尾部紧张，1为完全失去尾部紧张，2为拖动一条后肢，3为两条后肢都瘫痪，4为病态的和5为死亡。记录各大鼠的每日体重并以相对于开始体重来说体重的减小和恢复来表示。
MBP的免疫作用：开始研究是在大鼠中评价上述乳剂中两种不同剂量MBP(0.1-30μg/0.1ml)的临床严重性。0.1和0.3μg MBP不产生明显的临床作用。与1μg剂量比较，30μg剂量的MBP产生最强的临床作用。该作用具有高的显著性(p＜0.001，Mann-Whitney U-test)。总而言之，MBP剂量(1-30μg)的增加产生较早临床作用，例如，1μg MBP开始的平均值±S.E.M为14.88±0.42(n＝9)而30μg MBP剂量数天时为12.35±0.16(n＝34；p＜0.01)。另外，观察到MBP(1-30μg)剂量依赖的体重损失作用。在开始后的5-7天内，动物从临床症状中自动恢复。单独给予CFA不产生临床作用，然而未治疗的对照组相比，有初始的短暂的体重损失。
在所有这些研究中，观察到在MBP的任何剂时无药组(仅用MBP致免疫)和赋型剂剂量组(MBP致免疫并使用PBS)之间没有显著性差异。因此，赋型剂对疾病的严重程度没有影响(见表3和4)。下文描述无药组和赋型剂剂量组。
EAE的治疗：在各种时间过程中皮下注射各种剂量的TNF抑制剂哑铃分子(0.1-3mg/kg)或赋型剂(PBS)。在用MBP免疫后立即或在9天后开始治疗并继续到免疫后的21天。在各实验中，接受PBS的对照大鼠接受与治疗组相同量的注射以减小因应激而产生的任何继发作用。也观察了EAE诱导后未接受注射(无药对照)的大鼠组。
治疗作用每日给药：评价从免疫之日起每日给予TNF抑制剂哑铃分子共21天对EAE的影响。浓度为0.1、0.3、1或3mg/kg的哑铃分子在1μg和30μg MBP组中对临床症状严重程度的减小没有明显的影响。然而，观察到3μg MBP剂量时所使用的所有哑铃分子剂量都明显改善临床疾病。
每隔一日给药：也试验了从免疫后第9天开始每隔一日给予0.1、0.3、1和3mg/kg剂量时的作用。如表3和4所示，与使用最高剂量MBP(30μg/0.1ml)的赋型剂对照组相比，剂量0.3(p＜0.008)、1.0(p＜0.001)和3.0mg/kg(p＜0.002，Mann Whitney检验，n＝6)时对临床症状产生明显的抑制作用。观察到赋型剂和来治疗对照组之间没有明显差异。最低剂量的TNF抑制剂哑铃分子对临床症状没有明显作用。
1.0(p＜0.1)和3mg/kg(p＜0.05，Mann Whitney检验)的哑铃分子剂量明显减轻由10μg MBP产生的临床症状。尽管0.3和0.1mg/kg哑铃分子减轻临床症状，但这种减轻作用是不明显的。0.1-3mg/kg剂量的哑铃分子不明显抑制由低剂量MBP(1或3μg)诱导的临床症状。
体重的减小是EAE开始的重要标志。用3，10和30μg MBP免疫的大鼠接受c105哑铃分子(1或3mg/kg)治疗，与赋型剂组进行比较其体重减小。
表3.TNF抑制剂哑铃分子对主动诱导的EAE的预防作用
表3A-3F
哑铃分子对每日平均临床得分的影响-30μg MBP
表3A 治疗 无药物 平均 临床 得分 0.25 ± 0.18 1.00 ± 0.50 1.92 ± 0.52 2.67 ± 0.44 1.83 ± 0.53 0.83 ± 0.44 0.166 ± 0.10 天数 11 12 13 14 15 16 17
表3B 治疗 赋型剂 平均 临床 得分 0.17 ± 0.17 0.75 ± 0.31 1.83 ± 0.40 2.50 ± 0.34 2.08 ± 0.45 1.00 ± 0.41 0.25 ± 0.11 天数 11 12 13 14 15 16 17
表3C 治疗 0.1mg/kg哑铃分子 平均 临床 得分 0.08 ± 0.08 0.92 ± 0.35 1.33 ± 0.21 2.67 ± 0.21 2.17 ± 0.30 1.17 ± 0.28 0.25 ± 0.11 天数 11 12 13 14 15 16 17
表3D 治疗 0.3mg/kg哑铃分子 平均 临床 得分 0.25 ± 0.17 0.92 ± 0.27 1.50 ± 0.42 1.17 ± 0.40 0.58 ± 0.15 0.375 ± 0.14 天数 12 13 14 15 16 17
表3E 治疗 1mg/kg哑铃分子 平均 临床 得分 0.17 ± 0.17 0.58 ± 0.20 0.67 ± 0.17 0.42 ± 0.20 0.33 ± 0.17 0.083 ± 0.083 天数 12 13 14 15 16 17
表3F 治疗 3mg/kg哑铃分子 平均 临床 得分 0.25 ± 0.17 0.42 ± 0.20 0.83 ± 0.25 0.42 ± 0.32 0.08 ± 0.08 0.08 ± 0.08 天数 12 13 14 15 16 17
表的说明：每日平均严重程度得分的大鼠是用30μgMBP免疫的并从MBP免疫后第9天开始每隔一日用TNF抑制剂哑铃分子来治疗的。赋型剂组接受PBS而无药组在EAE诱导后不接受注射。
表4用曲线下的面积来表示TNF抑制剂
哑铃分子的抑制作用治疗情况 无药 赋型剂 0.1mg/kg 0.3mg/kg 1mg/kg 3mg/kg临床严重程度(面积) 8.07±1.40 7.83 ±0.88 7.88 ±0.83 4.3 ±1.02 1.63 ±0.60 1.53 ±1.01
表的说明：用曲线下面积(任意单位)来表示c105哑铃分子对临床严重程度的抑制作用。测定各组的平均值±S.E.M(n＝6)并与赋型剂组进行统计比较(Mann-Whitney检验)。观察到赋型剂组与无药对照组之间没有显著性差异。0.3，1.0和3.0mg/kg(接上文给出的)的c105哑铃分子明显地(**P分别小于0.008、0.001和0.002)减轻临床症状。
如表5所示，通过观察临床症状期内数天的测量并计算所给出大鼠组的平均值表明：每隔一日给药也缩短疾病的期限。
表5每隔一日给药时的疾病期限MBPμg 抑制剂哑铃分子 0 0.1 0.3 1 3 30 5.33±0.21 5.50±0.34 4.50±0.92 2.83±0.79* 2.16±0.60** 10 4.33±0.80 3.66±0.80 4.00±0.51 3.33±0.49 1.83±0.70* 3 2.50±1.02 1.83±0.83 2.00±0.81 3.16±0.74 0.83±0.54 1 1.83±0.79 0.66±0.66 1.66±0.61 1.33±0.49 0.66±0.42 *p＜0.05 **p＜0.01
单剂量给药：在免疫后第9天一次给予0.3或3mg/kg剂量的哑铃分子与赋型剂对照相比很少或未减轻MBP(1-30μg)诱导的临床症状。
每三天给予一次TNF抑制剂哑铃分子：在MBP免疫后第9、12、15和18天给予0.1-3mg/kg的哑铃分子或赋型剂。如表6所示，观察到0.3(P＜0.05)、1.0(P＜0.01)和3mg/kg(P＜0.001 Mann-Whitney-检验)剂量的c105哑铃分子明显减轻MBP(30μg)诱导的临床症状。当与赋型剂对照组相比时，0.1mg/kg剂量的c105哑铃分子没有作用。
0.3、1.0和3.0mg/kg剂量的c105哑铃分子减轻MBP(10μg)诱导的临床症状。然而，仅在较高剂量的c105哑铃分子时才观察到明显(分别为P＜0.05和0.03)的作用。尽管c105哑铃分子(0.3-3mg/kg)以大约20-60％减轻由3μgMBP产生的临床症状，但观察到的作用与赋型剂对照组之间没有显著性差异。
c105哑铃分子通常缩短疾病的期限。例如1和3mg/kg剂量的c105哑铃分子分别以37.3％和68.7％明显缩短MBP(30μg)介导的症状的期限(见表10)。使用中间剂量的MBP(10μg)但不是最低剂量的MBP也观察到了类似的趋势(表7)。
在用3mg/kg c105哑铃分子治疗的动物中，10和30μg MBP组的疾病的发作明显(分别为P＜0.047；P＜0.013；Mann Whitney U-检验)延迟。
c105哑铃分子特别是在1和3mg/kg剂量时，部分抑制了与EAE相关的体重减低。体重损失的减小是剂量依赖性的。不管MBP使用什么样的剂量，c105哑铃分子的这种作用都是类似的。
表6每三天给药一次的以面积表示的平均临床严重程度 治疗 赋型剂0.1mg/kg 0.3mg/kg 1.0mg/kg 3.0mg/kg平均临床严重程度(面积) 9.21 ±0.64 8.25 ±0.92 6.23 ±1.37 3.66 ±0.61 0.33 ±0.17
表7每三天给药一次的疾病的持续时间MBPμg 抑制剂哑铃分子 0 0.1 0.3 1 3 30 5.83±0.44 4.83±0.30 4.16±0.70 3.66±0.61* 1.83±0.70** 10 4.66±0.42 5.16±0.40 4.00±0.77 3.00±0.96 2.50±0.67* 3 4.00±0.67 3.50±0.62 3.00±1.35 3.00±1.35 3.33±0.66*p＜0.05 **p＜0.01
实施例18，中枢神经系统(CNS)病理学
测定由PEG-二乙烯砜合成的c105哑铃分子对由MBP(0，10或30μg)免疫诱导的CNS疾病的治疗作用。如上文所述来进行MBP免疫(EAE诱导)。MBP免疫后第9天开始每两天给予一次0.3、3mg/kg的c105哑铃分子或赋型剂。在第9、14或20天(注射MBP后)杀死(通过CO2)动物。从每只大鼠中取出脑和脊髓并放在10％中性缓冲的甲醛中。固定至少72小时后，在视交叉尾部到垂体与脑桥横向纤维连结处制备脑的横切片。经颈、胸和肢横切成4-6断来整理脊髓。纵向包埋与尾神经连结的骶骨部分。将组织包埋在石蜡中并用苏木精和伊红染色。
在不知道治疗组的情况下进行组织学评价。给每个片标上1-4范围内的数值来表示炎症和脱髓鞘的强度。评分标准如下：1＝最少，1-2根管具有炎性细胞的小的血管周套，2＝轻度，3或多根管具有炎性细胞的小的血管周套但很少将炎症延伸到实质中，3＝中度，3或多根管具有炎性细胞的明显的血管周套并且炎症中度地侵入实质周围，和4＝显著，大多数管具有炎性细胞明显的血管周套并在炎症过程中广泛地包含了神经纤维网。
确定每只动物每个CNS区的总炎症分数。计算CNS每一部分的每个时间点的分数值：平均值±SEM(平均值的标准误)并与赋型剂治疗组的动物进行比较。
测定每组动物各个CNS区的平均炎症得分并与赋型剂对照组进行统计比较(Students-t-检验)。表8和9中描述了这些得分。
在MBP注射后第9天杀死的动物中，CNS没有显著的组织学改变。在14天时的损伤由最小到显著的通常血管周炎性细胞浸入的混合形式构成(单核+某些中性粒细胞)。在脑中，炎症趋向于脑膜、脑室周地区和小脑白色束，而脑干和小脑白色束受得影响最为严重。在这些区域，炎症经常从血管周区域延伸到实质周围并表明有脱髓鞘作用。在脊髓中，影响最严重的是腰部和骶骨部位。灰质和白质都受到影响，且主要受损伤的是血管周。炎症持续到20天，然而此时很少能看到中性粒细胞。在各组和几乎所有组的动物中都发生炎性强度的变化。
表8和9表明c105哑铃分子的存在减轻所研究CNS各个区的发炎程度。观察到在脊髓特别是腰部和骶骨部位炎症的减轻最明显。c105哑铃分子对CNS的较高区域大脑和小脑具有较小的作用。
表8 用30μgMBP免疫并用TNF抑制剂
哑铃分子治疗的动物的炎症得分 脑区 3mg/kg 0.3mg/kg 赋型剂 大脑 小脑 颈索 胸索 腰索 骶骨索 1.00±0.378 0.714±0.360 0.714±0.474 2.57±0.429 2.714±0.360 3.280±0.286 1.71±0.360 1.428±0.298* 2.420±0.202 1.71±0.421 1.000±0.218* 2.280±0.421 1.85±0.404 1.42±0.369 2.42±0.298 1.28±0.360 1.42±0.298 2.714±0.522*p＜0.05(students t-检验)组织学(30μgMBP剂量)
表9用10μg MBP免疫并用TNF抑制剂哑铃分子治疗
的动物的炎性得分 脑区 3mg/kg 0.3mg/kg 赋型剂 大脑 小脑 颈索 胸索 腰索 骶骨索 0.28±0.18 0.42±0.20 0.42±0.29 1.42±0.29 2.28±0.42 2.28±0.35 0.85±0.34 1.42±0.42 1.42±0.20 0.85±0.14 1.57±0.36 1.0±0.30 0.71±0.28** 1.57±0.48 2.28±0.28 0.57±0.20** 1.57±0.48 2.28±0.42*p＜0.01 组织学(10μg MBP剂量)
实施例19.c105TNFbp哑铃分子防护内毒素致死
使用PEG-二乙烯砜合成的c105哑铃分子保护Balb/c小鼠对抗致死剂量的内毒素。给小鼠腹膜内注射30mg/kg内毒素，并在给予内毒素的1小时或2小时时，静脉一次给予0.1ml PBS或溶于0.1ml PBS的1mg/kg哑铃分子。注射内毒素1小时后静脉给予1mg/kg哑铃分子时几乎对致死产生完全的防护作用。在两小时时给予哑铃分子对致死内毒素的损伤不产生防护作用。
c105哑铃分子也保护Lewis大鼠对抗致死剂量的内毒素。给大鼠静脉注射12.5mg/kg的内毒素。注射内毒素的同时，给大鼠注射盐水或0.1、0.5、3.0或4.5mg/kg剂量的c105哑铃分子。所有剂量的哑铃分子都产生类似的对致死损伤的防护作用。
在给予10mg/kg剂量的内毒素的同时同时给予1.5mg/kg c105哑铃分子来进行治疗时，保护大鼠对抗肝和代谢紊乱。如表10所示，在给予内毒素后24小时时评价肝和代谢参数。
表10.c105哑铃分子(1.5mg/kg)对由内毒素诱导
的生化参数异常的治疗作用 参数 对照+ 赋型剂 内毒素+ 赋型剂 内毒素+c105哑铃分子葡萄糖(mg/dL) 143±2 52±8 81±5*SGPT1(mu/mL) 47±6 679±118 141±25*血尿氮(mg/dL) 19±1 88±2 39±3*皮质酮(ng/mL) 164±62 750±49 489±43*1血清谷丙转氨酶数值为每组4到8只大鼠的平均值±标准误*与内毒素处理组比较显著性差异p＜0.05(成对比较的t-检验)
可以理解到在本文教导之下，本领域普通技术人员将能够把本发明的技术用于具体的表达系统或聚乙二醇化试剂。因此，对本发明的方法和产品进行各种修饰和改变对本领域普通技术人员来说是显而易见的。本发明应该包含这些修饰和变化。