人神经细胞特异表达的质粒型 疱疹病毒载体的构建及用途 本发明涉及一种在人神经细胞中特异表达的质粒型疱疹病毒载体及其用途，特别涉及外源基因表达为单纯疱疹病毒立即早期启动子所控制的，利用单纯疱疹病毒基因组复制元件和包装信号序列所构建的真核表达质粒载体及其用途。
单纯疱疹病毒I型(HSV-1)的突出特征是其嗜神经性，感染神经细胞后可在其中顺行或逆行传播或经突触传播，其基因组在神经细胞中以环状闭合的双链形式存在于细胞核中，不影响神经细胞功能。目前已明确HSV-1基因组中复制和包装成病毒颗粒的编码区段。在大肠杆菌质粒中引入HSV-1基因组的这两段序列元件以及HSV-1立即早期基因IE68的启动子区段(M.J.Murchie，et al.DNA sequence analysis of an immediate-earlygene region of the herpes simplex virus type 1 genome(map coordinates 0.950to 0.978).J.Gen.Virol.(1982)62，1-15)，便可构成一个既能在大肠杆菌中扩增，又能在人细胞中稳定存在的穿梭载体，而且因此载体中含有HSV-1包装信号序列，将其与辅助病毒HSV-1的温度敏感株(tsK)共转染真核细胞后，多拷贝的质粒型载体可经包装信号序列切割、串联在一起，达到HSV-1基因组长度时包装成假病毒颗粒，这种假病毒颗粒具有和完整HSV-1颗粒同样的嗜神经性和感染效率，可以有效得将外源基因导入神经细胞而表达外源基因(Richard R.Spaete，et al.The herpes simplex virusamplicon：a new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector.Cell(1982)30，295-304)。
实现基因治疗的前提条件即是将外源基因有效得导入细胞。过去常用的方法如显微注射、转基因小鼠、DNA转染和反转录病毒载体等均不能将外源基因有效地导入分裂后细胞如神经细胞。而将外源基因导入哺乳动物的神经细胞，如将酪氨酸羟化酶基因导入大鼠巴金森氏症模型的纹状体以改善其症状等(Matthew J.During，et al.Long-term behavioral recovery inParkinsonian rats by an HSV vector expressing tyrosine hydroxylase.Science(1994)266，1399-1403)；可以精确地改变神经细胞的生理和病理状况，将对神经生理学的研究和神经系统的基因治疗等具有重要的意义。
本发明提出的质粒型载体pHSV-apl中除具有HSV-1基因组复制起点和包装信号序列外，还在HSV IE启动子下游引入一段多酶切点序列，可以插入外源基因以应用于神经生理、病理及神经系统疾病基因治疗的研究，使操作更简便，更具实用价值。
本发明地目的是提供一种神经细胞特异表达载体，它可在辅助病毒的辅助下将外源基因有效地导入神经系统，稳定存在并表达外源基因，具有比其他方法高得多的转导效率。它作为一种大肠杆菌、人细胞穿梭质粒可在大肠杆菌中大量扩增，经简单的纯化就可在辅助病毒帮助下包装成病毒颗粒而用于向神经细胞的基因转移。
本发明的神经细胞特异表达的质粒型载体pHSV-apl(见附图)，由下列元件组成：
1 HSV-1 IE68基因的启动子。
2 启动子之后的多酶切点
3 HSV-1基因组复制子(HSV-1 ori)。
4 HSV-1包装信号序列(Packaging site)。
5 大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌复制子(E.coli ori.)和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因(Ampr)。
本发明中用于载体构建的原始质粒有如下几种：
pSV-β-Galactosidase Vector：Promega公司商品质粒#E1081
pT2：(Nigel D.Stow，et al.Characterization of the TRs/IRs Origin of DNAReplication of Herpes Simplex Virus Typel.Virology(1993)130，427-438)
pEcoB：HSV-1病毒Kos株基因组EcoRIB片段克隆于pBR322质粒。
下面是质粒型疱疹病毒载体pHSV-apl的构建过程：
1从HSV-1基因组中分离出含有包装信号序列的基因区段。首先人工合成两个单链寡核苷酸片段，其硷基序列分别与该基因片段的两端互补，再将此两段寡核苷酸链3’末端标记Dig-ddUTP制成探针，分别与HSV-1EcoRIB片段的酶解片段进行Southern印迹杂交，以分离该包装信号序列。
详细如下：先用EcoRI从pEcoB中切出HSV-1 EcoRI B片段，再用BamHI酶解该片段，Southern印迹杂交后得到-6.5Kb大小的阳性片段。将其克隆在pSK的BamHI位点，得到质粒pBam6.5。同上再用BglI，HinfI，Sau3AI，StyI和XbaI分别酶解该6.5Kb片段。杂交后得到一约1.7Kb的HinfI阳性片段，将其两端补平后克隆入pGEM-3zf的SmaI位点，得到pGEM1.7。即此成功分离出含有包装信号序列的基因片段。
2用HindIII、BamHI双酶切pSV-β-Galactosidase Vector，得到含有lacZ基因的3.7Kb片段；同时用EcoRI、BamHI双酶切pSV-β-GalactosidaseVector，得到含有Ampr和E.coli ori的2.7Kb片段；用EcoRI、HindIII双酶切pT2，得到含有HSV-1 IE68基因启动子和HSV-1基因组复制起点的1.0Kb片段。三片段连接，得到质粒pHSV-β-gal。
3用HindIII、EcoRI双切pGEM1.7，得到两端为HindIII、EcoRI位点的1.7kb片段；同时用HindIII、BamHI切pHSV-β-gal，以去除lacZ基因片段；再将1.7kb片段与之连接，先使两个片段的HindIII粘端相接，再补平EcoRI、BamHI两个游离的不匹配末端，再平端自连。至此将包装信号序列插入pHSV-β-gal，取代其中的lacZ基因，并在HSV-1 IE68基因启动子下游带入一多酶切点，获得既含有HSV-1IE启动子，又含有其复制起点及包装信号序列的穿梭载体pHSV-apl(见附图)。
本发明提出的质粒型疱疹病毒载体pHSV-apl中的HSV-1 IE68基因启动子下游的多酶切点处可插入其它外源基因，当转染细胞后可在辅助病毒的协助下被包装成复制缺陷型的单纯疱疹病毒毒粒，可直接接种体外培养的神经细胞以在其中表达外源基因，也可以直接注射的方式注入神经系统或接种外周神经系统后，病毒通过在神经细胞内的逆向运动进入中枢神经系统，并表达外源基因。故pHSV-apl可用于神经生理、病理及神经系统疾病基因治疗的实验研究。
本发明提出的质粒型疱疹病毒载体pHSV-apl，可保存在大肠杆菌TG1株，含pHSV-apl质粒的菌株命名为pHSV-apl/TG1。在含50-100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中(1％tryptone，0.5％yeast extract，1％NaCl)传代培养(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：0263菌种名称：大肠杆菌pHSV-apl/TG1 Escherichia coli。
以下实施例对本发明的质粒型疱疹病毒载体pHSV-apl及以此为基础制备的表达外源基因的复制缺陷型单纯疱疹病毒毒粒的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。
实施例1：表达外源基因的pHSV-lac的构建。
先用HindIII、BamHI双酶切pSV-β-Galactosidase Vector中的3.7kblacZ基因片段；同时用HindIII、BamHI双酶切pHSV-apl，因为pHSV-apl多酶切点中恰好有此两位点，故可将3.7kb lacZ基因片段直接连接入pHSV-apl，得到pHSV-lac。该质粒以脂质体瞬时转染体外培养的神经元后3-5天，用组织化学方法可检测到受染细胞中LacZ基因的表达。
实施例2：质粒的制备。
将pHSV-lac/TG1接种于300ml LB培养液，37℃培养24小时，离心收菌体，加10ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重悬菌体，冰浴下加20ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)5分钟后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)混匀，15000rpm离心15分钟，上清加0.6倍体积异丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶解，等体积酚-氯仿-异戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提去除蛋白质，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝胶过滤，收集流出的质粒峰。
实施例3：复制缺陷型HSV-lac Stock，即含有复制缺陷的病毒颗粒和HSV-1 tsK的混合毒株的制备。
HSV-1 tsK病毒悬液以0.1M.O.I接种60-80％成片的Vero细胞，31℃吸附1.5小时。取5ug pHSV-lac与30ul脂质体转染试剂Lipofectine混合，加无菌去离子水到100ul，室温放置15分钟，补无血清培养基至2ml，加入到上述HSV-1 tsK感染的细胞单层上，置31℃10小时，加入含10％小牛血清的Eagle’s培养液，细胞病变超过80％后收毒，即为复制缺陷型HSV-lac stock。
实施例4：复制缺陷型HSV-lac stock在体外培养的SD大鼠胚胎脊髓运动神经元中表达lacZ基因：
取HSV-lac Stock 20ul接种到培养约10万的SD大鼠胚胎脊髓运动神经元中，置37℃培养72小时后原位检测β-半乳糖苷酶活性，结果见有近10％的细胞变兰。
实施例5：复制缺陷型HSV-lac stock在成年Wistar大鼠脑内表达LacZ基因。
取1ul复制缺陷型HSV-lac stock(1×105pfu)注射到体重250g左右成年Wistar大鼠的纹状体(bregma+0.5，lateral 2.5，and ventral 5.0)。5天后，手术取出大脑，冰冻切片，用组织化学方法检测β-半乳糖苷酶基因表达情况，可见在注射部位周围有多量神经细胞变蓝。