一种波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物及用途.pdf

本发明提供了一种波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步骤：a、脱脂；b、水浴加热回流提取；c、Sevag法除蛋白；d、沉淀。本发明还提供了提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物及其用途。本发明波棱瓜子多糖提取物遵循中医传统用药习惯，符合临床用药特点，提取方法为水浴加热回流提取，工艺和提取设备简单，成本低廉，且相对安全，适合工业化大生产。

1.  一种波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60-90℃下水浴回流4-6h，离心；
b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，加入蒸馏水，100℃水浴加热回流，冷却，收集提取液，离心，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩；
c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝5:1)，样液比1：4-4：1，剧烈震荡，离心，收集上清液；
d、沉淀：上述上清液中加入无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多糖。

2.  根据权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80℃下水浴回流2h，冷却，离心，重复两次；
b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，100℃水浴加热回流各提取2h、1.5h、1.5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于1g原料药；
c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝5:1)，样液比3：1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清液；
d、沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多糖提取物。

3.  权利要求1或2所述的提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物。

4.  权利要求3所述的波棱瓜子多糖提取物在制备保肝护肝的药物中的用途。

5.  根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗免疫性肝损伤的药物。

6.  根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是保肝降酶的药物。

7.  根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物是具有清除自由基、抗氧化、抗炎、调节免疫的药物。

一种波棱瓜子多糖提取方法,该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物及用途
技术领域
本发明涉及波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物，属于药物领域。
发明内容
免疫性肝损伤通常由生物性和化学性刺激引起肝内细胞的激活，它是通过一系列信号级联反应分泌大量炎症免疫相关细胞因子，经过各种不同细胞与细胞因子相互之间的复杂作用，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤。免疫性肝损伤决定了疾病的转归或发生发展。长期迁延不愈会导致肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变。免疫性肝损伤常见的原因为病毒感染，其模型动物的肝损伤病理病程类似于病毒性肝炎病理病程。
目前，病毒性肝炎仍然是世界范围内主要的公共卫生问题和最常见的肝病病因。我国亦是病毒性肝炎的高发区，尤以乙型肝炎病毒(HBV)感染最为常见，严重威胁着人们的健康。目前，尚无治疗乙型肝炎的特效药物和方法，治疗乙型肝炎的药物主要为西医常用的干扰素、胸腺素、核苷类、疫苗等以及中医常用的黄芪粗制剂和以黄芪为主的复方、肝康冲剂及苦参等药物，但疗效欠佳。因此，开发能有效治疗乙型病毒性肝炎的新药在临床上变得尤为迫切。
据报道，藏医药在防治病毒性肝炎的过程中取得了良好的成果，其对肝病的治疗得到了国内外学者的广泛关注。
波棱瓜子是藏药中治疗肝病的首选药物之一，在治疗肝病的过程中得到了广泛的应用。现代药理研究亦表明波棱瓜子总木脂素及脂肪油具有抗肝炎、抗乙肝病毒、抗肝损伤、调节免疫等作用。据报道，植物多糖亦具有抗病毒、调节免疫、抗氧化等多种生理功能，但目前尚未见波棱瓜子多糖护肝作用的研究报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的用途。
本发明一种波棱瓜子多糖提取方法，它包括如下步骤：
a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入石油醚，在60－90℃下水浴回流4－6h，冷却，离心；
b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，加入蒸馏水，100℃水浴加热 回流，冷却，收集提取液，离心，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩；
c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝5:1)，样液比1:4－4：1，剧烈震荡，离心，收集上清液；
d、沉淀：上述上清液中加入无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多糖。
进一步优选地，它包括如下步骤：
a、脱脂：取波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80℃下水浴回流2h，冷却，离心，重复两次；
b、水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，100℃水浴加热回流各提取2h、1.5h、1.5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于1g原料药；
c、Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝5:1)，样液比3：1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清液；
d、沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多糖提取物。
本发明还提供了所述的提取方法制备得到的波棱瓜子多糖提取物。
本发明还提供了所述的波棱瓜子多糖提取物在制备保肝护肝的药物中的用途。
其中，所述的药物是治疗免疫性肝损伤的药物。
其中，所述的药物是保肝降酶的药物。
其中，所述的药物是具有清除自由基、抗氧化、抗炎、调节免疫的药物。
文献报道，波棱瓜子中具有保肝作用的大类成分为木脂素以及脂肪油，脂肪油在提取的第一步(石油醚脱脂)中已几乎除尽，且脂肪油不溶于水；木脂素在植物中多以游离状态存在，为脂溶性物质，难溶于水，且制备的最后一步即多糖沉淀乙醇体积分数已达80％以上，进一步使残余的木脂素溶于上层清液乙醇中。因此，本发明波棱瓜子多糖提取物中不含有木脂素类成分。
本发明波棱瓜子多糖提取物遵循中医传统用药习惯，符合临床用药特点，提取方法为水浴加热回流提取，工艺和提取设备简单，成本低廉，且相对安全，适合工业化大生产。
附图说明
图1各组小鼠肝组织HE染色病理切片(A：空白组B：模型组C：阳性对照组D：多糖低剂量组E：多糖中剂量组F：多糖高剂量组)
具体实施方式
实施例1本发明波棱瓜子多糖提取物制备方法
1)脱脂：波棱瓜子干燥品粉碎，加入8倍量石油醚，在80℃下水浴回流2h，冷却，离心，重复两次。
2)水浴加热回流提取：上述残渣挥干后，依次加入10、8、6倍量蒸馏水，100℃水浴加热回流各提取2h、1.5h、1.5h，冷却，收集合并3次提取液，4000r/min离心5min，取上层清液，再次抽滤后将滤液减压浓缩至每1ml药液相当于1g原料药。
3)Sevag法除蛋白：上述浓缩液中加入Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝5:1)，样液比3：1，剧烈震荡25min，4000r/min离心5min，收集上清液，重复操作6次，最后所得上清液。
4)沉淀：上述液体中加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀真空干燥得到波棱瓜子多糖。计算得提取率为3.54％。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明波棱瓜子多糖对ConA致免疫性肝损伤小鼠肝脏的保护作用的药效学实验
1.实验药品及试剂
波棱瓜子多糖:由实施例1制备，多糖给药组剂量(按小鼠体重给药)分别为0.71g/kg、0.99g/kg、1.44g/kg，相当于生药量的20g/kg、28g/kg、40.8g/kg；
上述剂量多糖用蒸馏水溶解配制备用；
联苯双酯滴丸，由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供；
刀豆球蛋白A(ConA)，购自美国Sigma公司；
丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH，批号)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、总蛋白(TP)、一氧化氮(NO)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所提供；
白细胞介素6(IL-6)ELASA试剂盒，由苏州卡尔文生物科技有限公司提供；
无菌磷酸缓冲液(PBS)，由Bioroc公司提供。
2.实验方法
60只健康雄性昆明种小鼠，18-22g,随机分为空白组、模型组、联苯双酯(阳性对照)组及波棱瓜子多糖低、中、高剂量组，每组10只。
波棱瓜子多糖低、中、高剂量给药组小鼠每天分别按体重ig0.71、0.99、1.44g/kg多糖；
阳性对照组小鼠ig0.2g/kg联苯双酯；
联苯双酯及多糖均用蒸馏水混悬和溶解；
正常组与模型组小鼠ig20mL/kg的蒸馏水；
连续ig8d；
采用一次性尾静脉注射ConA建立免疫性肝损伤小鼠模型：末次给药(已禁食9h)1h后，除正常组外，其余小鼠尾静脉注射30mg/kg ConA。
8h后，称量小鼠体重，摘眼球取血，分离血清，检测ALT、AST、NO、LDH、IL-6各项指标；
眼球取血后立即处死小鼠并剖取肝脏、脾脏，滤纸擦试，称重，计算肝脏、脾脏脏器指数(脏器重量/体重×100％)；
剪取部分肝脏组织，冰浴中用冷生理盐水制成10％的肝匀浆，离心，取上清液，检测TP、SOD、MDA各项指标；
剪取各组小鼠的肝脏相同部位肝组织(肝左叶)，10％甲醛(PBS配制)固定，HE染色，光镜下观察肝组织损伤程度。
统计学处理：所得数据均采用表示，用SPSS17.0软件进行方差分析及独立样本T检验，肝脏组织的炎性坏死程度根据等级分组评分后，采用Riditu检验进行统计学处理。P＜0.05或P<0.01认为有显著性差异。
3.实验结果
1)波棱瓜子多糖对脏器指数的影响，实验结果见表1。
表1波棱瓜子多糖对免疫性肝损伤小鼠脏器指数的影响(n＝10)

与模型组相比^**P＜0.01；^*P＜0.05
表1结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠的肝脏、脾脏指数显著升高(P＜0.01),提示造模成功；与模型组相比较，阳性药组及多糖中高剂量给药组均能显著降低小鼠肝脾指数。
由以上结果可得：阳性药及中高剂量多糖均能减轻免疫性肝损伤小鼠肝脏水肿程度。
2)波棱瓜子多糖对血清中ALT、AST、LDH含量的影响，结果见表2。
表2波棱瓜子多糖对免疫性肝损伤小鼠血清中酶活性的影响(n＝10)

与模型组相比**P＜0.01；*P＜0.05
表2结果显示，模型组小鼠血清中ALT、AST及LDH含量较正常组明显升高(P＜0.01)，说明造模成功。波棱瓜子多糖中高剂量给药组及阳性对照组小鼠血清中ALT、AST及LDH含量与模型组相比均显著性降低(P＜0.01或P＜0.05)。
由以上结果可得：阳性药及中高剂量多糖均能显著降低免疫性肝损伤小鼠血清中转氨酶及乳酸脱氢酶活性，对小鼠起到了保肝降酶的作用。
3)波棱瓜子多糖对小鼠血清中NO、IL-6含量的影响，结果见表3。
表3波棱瓜子多糖对免疫性肝损伤小鼠血清中NO、IL-6含量的影响(n＝10)

与模型组相比^**P＜0.01；^*P＜0.05
表3结果显示，模型组小鼠血清中NO、IL-6含量较正常组明显升高(P＜0.01)，说明造模成功。波棱瓜子多糖给药组及阳性对照组小鼠血清中NO、IL-6含量与模型组相比均显著性降低(P＜0.01或P＜0.05)。
由以上结果可知：波棱瓜子多糖在肝发生病变时能迅速调节免疫，减少炎症介质等毒害物质的释放，从而减轻肝脏炎性细胞的浸润。
4)波棱瓜子多糖对肝脏匀浆中SOD、MDA含量的影响，结果见表4。
表4波棱瓜子提取物对免疫性肝损伤小鼠肝脏匀浆中SOD、MDA含量的影响(n＝10)

与模型组相比^**P＜0.01；^*P＜0.05
模型组小鼠肝脏匀浆中SOD活性较正常组显著降低(P＜0.01)；MDA含量较正常组显著升高(P＜0.01)，说明造模成功。波棱瓜子多糖中高剂量给药组小鼠肝脏匀浆SOD活性与模型组相比较显著升高(P＜0.01或P＜0.05)；波棱瓜子多糖高剂量组与阳性对照组小鼠肝脏匀浆中MDA含量与模型组相比较显著降低(P＜0.05)，波棱瓜子多糖低、中剂量组无显著性差异，但MDA含量仍有一定下降趋势。
由以上结果可得：波棱瓜子多糖高剂量能显著提高免疫性肝损伤小鼠体内SOD水平，并降低MDA含量，从而达到清除氧自由基、增强机体抗氧化的能力，保护肝细胞生物膜，避免或减少肝细胞核固缩或崩解，以保护肝脏。
5)波棱瓜子多糖对肝脏组织病理学变化的影响
正常组：光镜下小鼠肝小叶结构完整，未见增生及假小叶形成，小叶中央静脉未见淤血，肝细胞未见变性及坏死；也未见肝细胞增生、纤维化，肝细胞内及细小胆管内无胆汁淤积，未见各类细胞浸润，汇管区无明显扩大及纤维结缔组织增生，小叶间胆管无扩张及增生，被膜完整，未见增厚及渗出。
模型组：小鼠肝小叶结构基本清晰，肝窦轻度扩张，迪氏间隙增宽，肝细胞可见不同程度的局灶状水肿，小叶周边可见大片肝细胞固缩，呈弥散状分布。
阳性药组：小鼠肝小叶结构清晰，病变主要以轻度水肿与坏死为主，程度明显较模型组病变减轻。高剂量组：小鼠病变基本同阳性药组，但肝细胞水肿变性较阳性药组重。
中、低剂量组：小鼠肝小叶清晰，病变主要以轻度水肿与坏死为主，程度明显较高级剂量组重。肝脏组织病理切片见附图1。
6组小鼠肝脏组织的炎性坏死程度根据等级分组评分后，采用Riditu检验进行统计学处理，模型组的肝组织炎性坏死程度与空白组、阳性对照组及波棱瓜子多糖中高剂量给药组的比较，均有显著差异。结果见表5。
表5波棱瓜子多糖对免疫性肝损伤小鼠肝组织炎症坏死分级的影响(n＝8)