发明详述
对胸腺依赖(TD)抗原的体液免疫的发生不仅需要B淋巴细胞，
它能产生针对抗原的特异性抗体；而且有赖于Th细胞，它对于B淋
巴细胞的激活是必要的。虽然T辅助细胞功能确实包括产生为B淋巴
细胞所用的细胞因子，但是Th细胞对B淋巴细胞激活的需要并不能
通过给B细胞提供外源性细胞因子而消除。而且，接触依赖的，细胞
膜介导的B细胞与T细胞间的相互作用，是诱导体液免疫的整体的组
成部分。这种相互作用中的一个受体配基对CD40和gp39已被确定。
CD40在B细胞上，并有与gp39结合的能力，而gp39在Th细胞表面
被介导，导致刺激B淋巴细胞并大量产生特异性抗体。阻断CD40和
gp39的相互作用，提供了阻碍特异性体液免疫应答发生的一种方法。
因而，本发明是关于在体内抑制TD抗原的体液免疫应答的方法。
通过阻碍介导接触依赖辅助作用因子功能的Th细胞上的分子与其在
B淋巴细胞表面的配基之间的相互作用，抑制体液免疫应答。优选的
实施方案是，通过阻碍T细胞上的gp39与体内给药gp39拮抗剂使之
暴露于TD抗原的B细胞上的CD40之间的相互作用，从而抑制体液免
疫应答。一个实施方案是通过体内同时给予gp39拮抗剂和抗原的方
法，使得B细胞暴露于TD抗原。优选地，这种TD抗原是一种治疗剂，
例如一种治疗性抗体或药物，用于病人的治疗，并通过抑制对该抗原
的体液免疫应答来延长其疗效的维持时间。另一实施方案是，这种TD
抗原是一种受试者可在环境中暴露的抗原，例如某种致敏原，对这种
致敏原的体液免疫应答对受试者(或患者)是有害的，例如导致变态
反应，在这种情况下抑制体液免疫应答对于受试者(患者)在治疗上
是有益处的。
I.GP39拮抗剂
根据本发明的方法，给gp39拮抗剂是为了阻碍T细胞上gp39和
B细胞上gp39配基之间的相互作用。gp39拮抗剂被确定是一种阻碍
这种相互作用的分子。gp39拮抗剂可以是直接针对gp39的抗体(例
如，一种抗gp39单克隆抗体)，直接针对gp39的抗体的片段或衍生
物(例如，Fab或F(ab)′2片段，嵌合体抗体或人化的抗体)，gp39
配基的可溶形式(例如，可溶的CD40)，gp39配基的融合蛋白的可
溶形式(例如，可溶的CD40Ig)，或者阻断gp39-CD40相互作用的
药物制剂。
A.抗体
一种哺乳动物(例如，小鼠、仓鼠或兔)可以由其有免疫原性的
gp39蛋白或蛋白质片段(例如肽段)引发抗体反应而获得免疫。在
其表面表达gp39的细胞也可用作免疫原。可供选择的免疫原包括纯
化的gp39蛋白或蛋白片段。可通过标准的纯化技术从gp39表达细胞
得到纯化gp39；gp39 cDNA(Armitage et al.，Nature，357：80-
82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，175：1091-1101
(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，11：4313-4319(1992))
可在宿主细胞中表达，例如细菌或某种哺乳动物细胞系，并将gp39
蛋白纯化。gp39肽可以在gp39氨基酸序列基础上合成(Armitage
et al.，Nature，357：80-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.
Med.，175：1091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，
11：4313-4319(1992))。给予蛋白质致敏性(包括与载体结合)
的技术，以及其它技术对于本领域技术人员都非常熟悉。例如，该蛋
白质可在有佐剂时给药。免疫的过程可通过检测血浆或血清中抗体滴
度来监测。可用免疫原作为抗原，用标准ELISA或其它免疫测定方法
来测定抗体水平。
免疫发生后，可获得抗血清，如果需要，还可从血清中分离到多
克隆抗体。为生产单克隆抗体，可从免疫动物获得产生抗体的细胞
(淋巴细胞)，并通过标准的体细胞融合程序使之与骨髓瘤细胞融合，
使这些细胞永生并产生杂交瘤细胞。这种技术为该领域技术人员所熟
知。例如，最初由Kohler和Milstein发展起来的杂交瘤技术
(Nature(1975)256：495-497)，及其它技术如人B细胞杂交瘤
技术(Kozbar et al.，Immunol.Today(1983)4：72)，EBV杂交
瘤技术，以生产人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal
Antibodies in Cancer Jherapy(1985))(Allen R.Bliss，Inc.，
Pages 77-96)，以及抗体库的筛检(Huse et al.，Science(1989)
246：1275)。可用免疫化学筛选杂交瘤细胞来生产与蛋白质或多肽
特异性反应的抗体并分离单克隆抗体。
本文所指的抗体试图包括与gp39蛋白或其肽或gp39融合蛋白特
异性反应的片段。抗体可用常规技术分解为片段，并且如上所述这些
片段筛选后应用可具有全部抗体的作用。例如F(ab′)2片段可由胃蛋
白酶处理抗体而产生，所产生的F(ab′)2片段可经处理以减少双硫桥
链而产生Fab′片段。本发明的抗体还试图包括含抗gp39部分的双重
特异性和嵌合的分子。
当用不是在人体宿主生产的抗体来治疗人时，可能不同程度地将
这些抗体识别的外来物质，发生免疫反应。减少或消除这一问题的优
于全身免疫抑制的一个途径是，产生嵌合体抗体衍生剂，即将非人的
动物的可变区和人的恒定区结合起来的抗体分子。例如嵌合抗体分子
可包括来源于小鼠、鼠或其它种类动物的抗体的抗原结合区，以及人
的恒定区。多种制作嵌合抗体的方法已描述并可被用于制造含有识别
gp39的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体，例如：Morrison et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851(1985)；Takeda et
al.，Nature 314：452(1985)，Cabilly et al.，U.S.Patent
No.4,816,567；Boss et al.，U.S.Patent No.4,816,397；
Tanaguchi et al.，European Patent Publication EP 171496；
European Patent Publication 0173494，United Kingdom Patent
GB 2177096B。期望这种嵌合抗体比相应的非嵌合抗体在人类受试者
中将产生更小的免疫原性。
为用于人的治疗，与gp39蛋白或肽特异反应的单克隆或嵌合抗
体，可以通过产生人恒定区嵌合体进一步人化，在变异区，尤其是抗
原结合部位的保守框架区，是人原的，只有超变区是非人原的。这种
改变的免疫球蛋白分子可通过大家熟知的某些技术来制造，(例如，
Teng et al.，Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312
(1983)；Kozbor et al.，Immunology Today，4：7279(1983)；
Olsson et al.，Meth.Enzymol.，92：3-16(1982))，并优选
根据PCT Publication WO 92/06193或EP 0239400的方法制造。人
化的抗体可以商业化生产，例如，由Scotgen Limited，2 Holly
Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain。
另一种产生抗gp39蛋白或肽的特异性抗体或抗体片段的方法是，
筛检编码免疫球蛋白基因的与gp39蛋白或肽一起在细菌中表达的表
达库或其中部分。例如完整的Fab片段，VH区和FV区可以用噬菌体
表达文库在细菌表达。示例见Ward et al.，Nature，341：544-546：
(1989)；Huse et al.，Science，246：1275-1281(1989)；以
及McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)。例如，用
gp39肽去筛检这种文库，可以确定与gp39反应的免疫球蛋白片段。
可选择Genpharm建立的SCID-hu小鼠来生产抗体或者其片段。
B.gp39的可溶性配基
其它能够在给药后抑制体液免疫的gp39拮抗剂是gp39配基的可
溶形式。一种单价的gp39可溶性配基能与gp39结合，从而抑制gp39
和B细胞上CD40间的相互作用。这里可溶性指配基并非持续地保持
在细胞膜上。可溶性gp39配基可通过化学合成来制备，或者，优选
通过重组DNA技术制备。一种优选的可溶性gp39配基是可溶性CD40。
除此，可溶性gp39配基还可以是融合蛋白的形式。这种融合蛋白至
少部分由连接着第二个分子的gp39配基组成。例如CD40可以表现为
带有免疫球蛋白(CD40Ig)的融合蛋白。在一个实施方案中，产生的
融合蛋白含有CD40细胞外区部分的氨基酸残基，连接在Cγ1的铰链、
CH2及CH3区域相应的序列的氨基酸残基上，形成CD40Ig融合蛋白
(见例如，Linsley et al.，(1991)J.Exp.Med.1783：721-730；
Capon et al.，(1989)Nature 337，525-531；及Copon U.S.
5,116,964)。该融合蛋白可由化学合成产生，或者优选地通过重组
DNA技术在CD40的cDNA基础上产生(Stamenkovic et al.，EMBO
J.8：1403-1410(1989))。
II.体液免疫被抑制的抗原
本发明针对抑制对抗原的体液免疫，它需要Th细胞释放的接触
依赖性辅助作用。被经典地描述为胸腺依赖性(TD)抗原的抗原，包
含在本发明之中。对来自Th细胞的接触依赖“辅助”的需要是由于
对T细胞上gp39和B细胞上CD40之间相互作用的需要。如本发明所
确定的，术语“TD抗原”是试图包括那些需要在T细胞和B细胞之
间gp39-CD40相互作用来诱导对抗原的体液免疫应答的抗原。通常，
蛋白抗原是TD抗原。本发明所包含的其它形式的TD抗原是一种分子，
称为半抗原，与一种蛋白质连接。这种情况下，蛋白质作为一种载体
引起T细胞辅助，从而诱导对该半抗原的体液免疫应答。
本发明的TD抗原可以溶解形式给受试者给药，例如注射一种可
溶解的蛋白。或者TD抗原可以在某细胞的表面，例如某种细胞表面
蛋白。该TD抗原可以与gp39拮抗剂一起向受试者投药，或者受试者
暴露于某种TD抗原环境，例如变应素。在优选的实施方案中，TD抗
原是作为一种为治疗性目的施用于受试者的药剂。例如，这种药剂
(一种TD抗原)可以是一种治疗性抗体，或治疗药物的其它形式。
例如，抑制对某种治疗性抗体的体液免疫应答，能够通过防止受试者
中该治疗性抗体的清除，来延长其在体内的治疗时间。如果小分子
(作为半抗原)与蛋白质或其它载体结合给药，能诱导T细胞辅助功
能去激活B细胞则作为治疗剂的小分子也可以是使针对其所免疫应答
受抑制的目标抗原；抑制对这些治疗性药剂的体液免疫同样能延长其
疗效。
本发明的方法提供抑制对TD抗原体液免疫应答，而并不影响对
胸腺非依赖性II型(TI-2)抗原的免疫应答。TI-2抗原包括多糖
和脂，它们能以多克隆的方式非特异性激活B细胞。正如本发明所确
定的，术语“TI-2”抗原试图包括所有那些不需要在T细胞和B细
胞之间gp39-CD40相互作用来诱导对抗原的体液免疫应答的抗原。
本发明提供了一种鉴别一种抗原是TD抗原还是TI-2抗原的方法，
正如发明中所确定的，通过对该抗原的体液免疫应答是否被gp39拮
抗剂所抑制来决定。
III.体液免疫的抑制
本发明是关于抑制对TD抗原的体液免疫应答的方法。体液免疫
应答可以是在初次暴露于TD抗原时的初次体液免疫应答，或者是再
次暴露于该抗原的再次体液免疫应答。一种或多种异型抗体的产生可
被抑制。对于初次体液免疫应答，IgM是产生的最主要的抗体，IgM
被抑制最显著。对于再次体液免疫应答，产生一些不同抗体，包括
IgM，IgG以及IgE均可能被抑制。
本发明提供了延长对TD抗原体液免疫抑制的方法。这里所用的
“延长抑制”意思是指在体内施用gp39结束后能维持对TD抗原的抗
体产生的抑制。
IV.gp39拮抗剂的施用
根据这里所描述的方法，对于暴露于TD抗原的受试者，给予
gp39拮抗剂，能够抑制其对TD抗原的体液免疫应答。在一项实施方
案中，gp39拮抗剂与TD抗原联合给药。优选该gp39拮抗剂与TD抗
原同时给药，但可以在TD抗原之前、或TD抗原之后给药，只要在TD
抗原诱导B细胞活化前给gp39拮抗剂就行。在另一项实施方案中，
受试者暴露于抗原环境。这种情况下，应在暴露于抗原后体内给gp39
拮抗剂，尽可能抓紧时间以防B细胞活化。
本发明中拮抗剂以适合体内药物学用药的生物学的适当形式施用，
以抑制体液免疫应答。通过“适合体内药物学用药的生物学适当形式”
意思是指使蛋白质的治疗作用超过了毒性作用的这种拮抗剂的给药形
式。术语受试者试图包括可被诱发免疫反应的活的生物体，例如哺乳
动物。这些受试者包括例如人，狗，描，小鼠，大鼠，以及这些受试
者的转基因种。本文描述的阻碍gp39和CD40相互作用的拮抗剂，其
给药可以是以任何药理学形式和一种药学可接受载体。该发明的治疗
性合成物的治疗作用量的给药定义为有效量，达到期望结果所必须的
剂量和时间。例如，阻碍gp39和CD40相互作用的拮抗剂的治疗作用
量可能根据诸如疾病状况，个体的年龄、性别、体重，以及拮抗剂在
个体中诱导所期望的免疫反应的能力因素不同而不同。剂量可调整到
提供最适宜的治疗反应。例如，可以分成每日数次给药，或者根据治
疗情况下病情危重情况适当减少给药。
活性化合物(例如拮抗剂)可以常规方式给药，比如注射(皮下，
静脉内，等)，口服给药，吸入，经皮肤应用，或直肠给药。根据给
药途径不同，活性化合物可包裹某种材料以防该化合物被酶、酸和其
它可能使该化合物灭活的自然条件所作用。
给予阻碍gp39和CD40相互作用的拮抗剂，尤其是胃肠道给药，
可能有必要将拮抗剂包裹或同时给予某种物质以防灭活。例如，可用
适当的载体或稀释剂，联合给予酶抑制剂，或者在适当的载体如脂质体
中，将拮抗剂有效地给药到个体体内。药学可接受的稀释剂包括盐水
和水性缓冲溶液。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂，异丙氟磷和抑肽酶。
脂质体包括水包油包水乳剂以及常规脂质体(Strejan et al.，
(1984)J.Neuroimmunol 7：27)。
该活性化合物还可以胃肠道外给药或腹腔内给药。可用甘油、液
态聚乙二醇，以及其混和物或油作为分散剂。在通常储存和使用条件
下，这些制剂能维持较好的保存，防止微生物生长。
适合可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(可水溶)或分散
剂和无菌粉末，以供临时制备无菌可注射溶液或分散体。但在任何情
况下，都必须无菌，而且注射使用简单并在体内分布广泛。在生产和
储存条件下必须稳定，必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载
体可以是溶剂或分散剂，例如包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油，
聚乙二醇，液态聚乙二醇，和其它类似物)，及其适当的混合物。例
如，通过裹上卵磷脂外壳，通过保持在分散过程中必要的粒子大小，
以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过各种抗细菌
和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚、asorbic acid、
硫柳汞等，可达到防止微生物作用的目的。大多数情况下，优选溶液
组成中还包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。
在溶液中加入延迟吸收剂，如硬脂酸铝和明胶，能够延长对可注射组
分的吸收。
可以通过将需要量的活性化合物(例如干扰gp39和CD40相互作
用的拮抗剂)根据需要与上述的一种或几种组分的组合在适当的溶剂里
混合，制备无菌注射溶液，然后通过过滤灭菌。通常，通过在包含基
础分散剂与所需的如上所述的其它成分的无菌载体内将活性化合物混
入而配制成分散系。当用无菌粉末制备无菌注射溶液时，优选的制备
方法是真空干燥或冻干，产生活性成分再加上从已无菌过滤溶液中选
择的所需要的组分的粉末。
当该活性化合物采用上述方法适当保护后，可以口服给药，例如
用惰性稀释剂或可吸收的可食用的载体。这里所用的“药学可接受载
体”包括任何和所有溶剂、分散剂、包裹物、抗细菌及抗真菌剂、同
型及吸收延迟剂等等。用这些介质或药剂制备药学活性物质已为同行
所共知。除此之外只要任何其它通常的介质或药剂与本活性化合物不
相适合，则在该治疗学组成中应用它们应予斟酌。增加的活性化合物
也可以加入到组合物中。
这一点尤其有利，将胃肠道外组合物形成剂量单位形式，方便给
药和统一剂量形式。本文所用的剂量单位形式指物理分割单位，将其
分割为单元剂量以用于哺乳类动物受试者的注射治疗；联合使用所需
的药物载体，每个单位含有经计算能产生所需要的治疗效果的活性化
合物的预先确定的量。本发明的剂量单位形式的设计规范取决于和直
接依赖于(a)活性化合物的独特特征和所要达到的特定治疗效果，
以及(b)合成用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的技术本身的
内在限制。
V.gp39拮抗剂与其它免疫抑制剂联合给药
已经表明，触发CD28的可溶性CTLA-4，Th细胞上的一种共
同刺激分子的干扰，也抑制TD抗体反应[30]，和阻断异体移植排
异[31]。与抗gp39给药相似，可溶性CTLA-4诱导一种延长免疫抑
制的状态。因为抗gp39和CTLA-4介导的免疫抑制效果是在体液免
疫应答的不同步骤，因此这两种免疫抑制药物联合给药可产生累加的
或协同的免疫抑制效果。
变态反应由IgE抗体介导。IgE反应的产生需要细胞因子IL-4。
联合施用gp39拮抗剂和一种IL-4抑制剂，例如一种抗IL-4抗体，
对于抑制对TD抗原的IgE反应可能更加有效。
下列实施例进一步说明本发明，但不应理解为仅限于此。所包括
的参考文献和整个本申请中所引用的公开的专利申请的内容合并入本
文作为参考。带有名为Randolph J.Noelle et al.以及冠以“导致
抗原特异性T细胞耐受”的与本文同一日期提交的专利申请的内容也
合并入本文作为参考。
下面是实例中所用的方法学。
材料和方法
动物，雌性，6～8周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratories，
Bar Harbor，ME)在本研究中用于体内试验。动物饲养在Dartmouth
Medical School的特殊的无病原动物机构。
辅助T细胞克隆(Th1)，从Worcester的University of Mass.的
Dr.David Parker那里得到D1.6，一种I-Ad限制的兔Ig特异
性Th1克隆[21]。在本报告中，D1.6将被称为Th1。
试剂和抗体，由DEAE HPLC从腹水中纯化的仓鼠抗鼠gp39单克隆抗
体MR1[16]。仓鼠Ig(HIg)，用作对照抗体，从仓鼠血清中采取类
似纯化得到(Accurate Chemical and Scientific Corp.，Westbuty，
NY)。RG7/7.6.HL，一种小鼠抗大鼠κ链抗体(与仓鼠κ链强烈反
应)，(RG7)[22]，与HRPO或FITC结合用作检测MR1和HIg
的第2试剂。亲和纯化的山羊抗小鼠IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b及
IgG3(Southern Biotechnology，Birmingham Al)用作在全部IgM
和IgG1 ELISA以及抗原特异性ELISA时的检测抗体。B1E3(由Dr.
T.Waldschmidt，Univ.of Iowa友好提供)，一种单克隆抗鼠IgE，
用作抗KLH ELISA IgE的检测抗体。嵌合L6(Chi-L6)，一种肿
瘤抗原L6特异性人化IgG1[23]，由Bristol-Myers Squibb
Pharmaceutical Research Institute，Seattle WA友好提供。抗
CD4，GK1.5[24]用HPLC从腹水中纯化制备。绵羊红细胞(SRBC)
从Colorado Serum Co.(Denver，CO)购买。用于抗SRBC空斑测定
的Sea Plaque琼脂从FMC公司获得(Rockland MA)。全部幼兔从
Cedarlane购买(Hornby，Ontario Canada)。KLH钥孔血蓝蛋白
从Calbiochem购买(LaJolla，CA)。用于免疫的完全弗氏佐剂(CFA)
从Sigma Chemical Co得到(St.Louis，MO)。TNP-SRBC，TNP-
KLH及TNP-BSA如前述方式制备[25]。
体内产生初次和再次抗体反应的免疫接种
初次免疫应答，为引起对SRBC或TNP-SRBC的初次抗体反应，给小
鼠静注200μl 1％的SRBC悬液使之产生免疫。在给抗原5天后用一
种改良的Jenne空斑分析方法分析抗SRBC应答的IgM[26]，在6天
后用ELISA检测抗TNP应答的IgM。对异种免疫球蛋白Chi-L6的初
次应答通过给每只小鼠腹腔内注射100μg明矾Chi-L6使之产生免
疫。血清IgM抗Chi-L6抗体反应在7天后检测。对TNP-Ficoll的
初次应答通过腹腔内注射25μg TNP-Ficoll产生免疫。IgM抗TNP
反应在第6天用ELISA检测。
再次免疫应答，为产生对KLH的再次体液应答，给动物腹腔内注射
50μg完全弗氏佐剂中的KLH使之免疫。断而在3个月后再给10μg
可溶性KLH腹腔注射)。在第7天用同型特异性ELISA从免疫鼠血清
中检测抗KLH抗体反应。通过腹腔内注射10μg可溶性Chi-L6引起
的Chi-L6免疫，产生对Chi-L6的再次抗体反应。7天后检测血清
IgG1抗Chi-L6抗体反应。
抗gp39处理，按照每一实验的安排，在第0，2，4天给予已免疫
或免疫性性试验者(腹腔注射)无菌的HPLC纯化抗gp39(MR1)或
HIg(作为一种抗体对照)。
抗原特异性ELISA，抗原特异性IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及
IgE抗体滴度通过同型特异性ELISA来确定。简单地说，抗原(在磷
酸盐缓冲液中1mg/ml的KLH，Chi-L6，TNP16-BSA，或TNP2-
BSA)被吸收到挠性聚乙烯微滴盘中，4℃过夜。盘用PBS-1％ FCS
-钠-迭氮化物冲洗并阻断。稀释的血清样品在37℃孵化2小时。样
本洗脱并用如下碱性磷酸酶连接的检测抗体中的一种来确定抗原特异
性抗体滴度：山羊抗小鼠IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，或IgG3
(Southern Biotechnology，Birmingham，Al)。IgE特异性ELISA
检测用生物素连接的B1E3，继之以碱性磷酸酶抗生物素蛋白(South
San Francisco，CA)。所有ELISA均建立在碱性磷酸酶与磷酸酶基
质反应之上(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。滴盘用
Dynatech MR700 ELISA阅读器在410nm下辨读分析。每个单位代表
标准免疫血清滴定曲线的基础上任意定的值。所有实验组都滴定从1
∶100到1∶100000，并且滴度的确定是在多点分析的基础上。而未
进行免疫刺激的对照组的抗KLH、抗Chi-L6及抗TNP抗体的水平在
可测值以下。
血清抗gp39的检测
抗gp39处理的小鼠血清中完整的抗gp39的定量：从在第0、2、4
天各250μg，共750μg抗gp39处理的鼠，分别在从抗gp39处理开
始的第7、14和21天提取血清。血清在非还原条件下在7.5％
SDS凝胶上电泳，转移到硝化纤维素，并用HRPO连接的RG7染色。
化学荧光检测后，对应于150～165KDa的斑区用Apple Scanner及图
象4.1软件程序扫描计数。
处理组小鼠血清中生物活性抗gp39的测定：表达gp39的抗CD3激活
的Th1，被接收750μg抗gp39(250μg分别在第0、2、4天)处
理的小鼠血清的稀释液的染色，用来确定血清中残留的生物活性gp39
的量。血清中所含抗gp39滴定法是，与活性Th1细胞克隆一起4℃
孵化30分钟，洗脱，再与FITC-RG7一起4℃孵化30分钟，用纯
化的抗gp39产生出MF1与抗gp39浓度之间的标准曲线。在Becton
Dickinson FACScan中进行样本分析，血清中残留的抗gp39的百分
比根据gp39标准曲线推定。血清中第7天的抗gp39水平被定为
100％。
采用的辅助T细胞转导，鼠被用SRBC(200μl 1％ SRBC，静脉注射)
免疫并被施予抗gp39或HIg(250μg分别在第0、2、4天给药)。
第7天从非免疫的或SRBC免疫的鼠移出脾细胞，去除红细胞、洗脱
并移至(经静脉，50×106/鼠)经辐照的受体(600拉德)，同时
可有或无取自TNP-KLH刺激的(TNP-KLH-CFA，50μg，i.p.)鼠
的50×106脾细胞作为免疫B细胞源。转导的同时，用TNP-SRBC
(200μl，1％ TNP-SRBC，i.v.)免疫小鼠。转导后第7天可确定
血清IgG1抗TNP滴度。
实施例1：抗gp39抑制对红细胞抗原的初次抗体应答的发生
在HIM病人观察到TD免疫力缺陷，以及抗gp39和CD40Ig在体
内对Th依赖性B细胞活性的有效抑制效果，为抗gp39在体内对体液
介导免疫的潜在免疫抑制作用研究提供了基础。为研究在体内初次TD
体液免疫应答时gp39-CD40相互作用的意义，确定了在体内施用抗
gp39对针对绵羊红细胞(SRBC)的初次抗体反应的影响。动物被
SRBC免疫，并在4天内施用抗gp39mAb(或对照HIg)。第5天，抗
gp39处理、HIg处理及对照小鼠的初次抗SRBC抗体应答被确定。与
对照或HIg处理的小鼠的抗SRBC PFC应答相比，接受总量1.5mg抗
gp39(500μg/鼠，在第0、2、4天分别给药)的小鼠的IgM抗
SRBC斑形成细胞(PFC)应答降低99％(图1A)。此外，抗gp39
接受量小至300μg/鼠(100μg/鼠，在0、2、4天给药)，其抗
SRBC初次免疫应答降低66％。这些实验的结果表明抗gp39治疗削弱
了体内的初次抗体应答。
继而研究了抗gp39对SRBC的初次体液免疫应答的免疫抑制作用
的持续时间。用抗gp39处理SRBC免疫的鼠4天，并分析在此后不同
的时间点其提高初次抗SRBC应答的能力。在该试验中，所有动物均
在第0天用SRBC免疫，并在第0、2、4天施用抗gp39或HIg。一
个小组在第5天测定IgM抗SRBC PFC应答。其它SRBC免疫组在第7
或14天被用SRBC刺激。在每个抗原刺激后5天(分别为第12和
19天)，测定IgM抗SRBC PFC应答。这种试验其中之一的结果见
图1B所描述。正如在图1A中，在抗gp39给药开始后5天，初次
抗SRBC应答被抑制80～90％。另外，在抗gp39处理后12和19天，
初次抗SRBC应答也被抑制90％以上。这些结果说明短暂的抗gp39处
理导致延长抑制初次抗体应答。
实施例2：抗gp39抑制再次抗KLH抗体应答的发生
检验初次抗体应答的实验提示，gp39-CD40的相互作用在引起
初次体液免疫中起了非常重要的作用。然而这些实验没有论及gp39
依赖的CD40的信号对于再次抗体应答的产生是否需要。因此，抗
gp39的施用对于KLH的可溶性刺激的再次免疫应答的作用，通过
KLH免疫的小鼠来确定。
用降低初次抗SRBC PFC应答的抗gp39给药时间表，设计了实验
来评价抗gp39处理对再次性抗体应答的作用。在这些实验中，KLH
免疫小鼠(3个月前用CFA和KLH免疫)被用可溶性KLH刺激(10μg
/鼠/i.v.)。在抗原刺激之日(第0天)，同时给予小鼠250μg
抗gp39或HIg，继而在第2、4天给予抗gp39或HIg。在KLH刺激后的第7天
(图2照片A)及第14天(图2照片B)，给鼠取血测定IgM，
IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及IgE抗KLH抗体的滴度。结果说明了
几点：1)可溶性KLH刺激引起持续再次免疫应答，持续14天以上；
2)施用抗gp39与施用同量的HIg相比，明显降低同型再次抗KLH
应答；及3)抗gp39的免疫抑制作用似乎可维持在初次给抗gp39处
理后至少14天。总之，这些实验的结果表明，与初次体液免疫应答
相似，再次体液免疫应答的发生也可以被抗gp39抑制。
实施例3：抗gp39抑制对异种Ig的抗体应答的发生
图1描述的实验表明抗gp39在对强免疫原性颗粒抗原(SRBC)
的初次应答中的免疫抑制能力。红细胞的细胞属性使得其在引发强免
疫应答的能力方面是独特的。异种Ig分子也具有这种高度的免疫原
性特征，因而提供了一种额外的模型抗原系统，用来检查抗gp39处
理对于初次和再次抗体反应发生的作用。动物用异种Ig分子，Chi-
L6，一种人化的小鼠抗肿瘤细胞mAb来免疫，并用抗gp39或对照
HIg处理。7天后，收集血清并分析IgM抗Chi-L6抗体的产生。此
外，在鼠初次免疫并用gp39处理后14天用Chi-L6刺激，第21
天测定IgG1抗Chi-L6抗体产生。图3描述该实验之一的结果。用
抗gp39处理的小鼠与用HIg处理的小鼠相比，其对Chi-L6的初次
抗体应答被抑制90％以上。而且对Chi-L6的再次IgG1应答也类似
地被抑制。这些结果表明，抗gp39处理抑制了对第二型TD抗原、异
体IgG的初次和再次抗体应答，就象其有效地抑制对红细胞和可溶性
蛋白抗原的应答一样。
实施例4：抗gp39不抑制对T非依赖性II型抗原，TNP-Ficoll的
初次抗体应答的发生
虽然前面的实验表明抗gp39有效地抑制了在体内对TD抗原的初
次和再次抗体应答的发生，但gp39-CD40相互作用在对TI抗原体液
免疫的发生方面是否起作用还不清楚。有关报告提供的数据表明，对
TI II型抗原、TNP-Ficoll的免疫，导致体内Th细胞的gp39表达。
为了弄清gp39-CD40相互作用对于TI抗原的抗体应答的发生是否必
要，分析了抗gp39处理对TNP-Ficoll免疫鼠的作用。用抗gp39或
HIg处理用TNP-Ficoll或TNP-SRBC免疫的小鼠，6天后测定IgM
抗TNP抗体反应。图4A表明，用TD抗原TNP-SRBC免疫的动物诱
发了显著的抗TNP血清抗体反应。正如根据前述实验所预测的，抗
gp39处理强烈抑制了这些鼠的初次抗TNP应答的发生。相反，TNP-
Ficoll免疫的小鼠具有较高的抗TNP抗体反应滴度(图4B)；然
而，用抗gp39处理并不抑制对TNP-Ficoll的抗体反应。这些实验
的结果说明，与对TD抗原的反应不同，抗gp39不抑制对TNP-Ficoll
的体液免疫应答的发生，提示对TI抗原的应答可能是gp39非依赖性。
实施例5：施用gp39不能有效地消除SRBC特异性Th
从以上实验知道，抗gp39阻碍TD体液免疫的建立；然而，抗
gp39处理抑制体液应答的机理并不清楚。抗gp39引起的免疫抑制可
以被如下介导：1)gp39耐受T细胞的负信号引起Th细胞无免疫性；
2)抗gp39耐受CD4+T细胞的单克隆抗体介导细胞毒性的消除；
以及/或者3)阻断gp39与CD40结合。进行了一系列实验，通过抗
gp39处理的观察，以期探明延长免疫抑制中的这些可能的作用机理。
为探明抗原特异性Th被抗gp39处理消除或丧失免疫性的可能性，通
过适当的转导对gp39处理的小鼠的抗原特异性Th功能进行了检测。
简单地说，将鼠用SRBC免疫(以产生原发性SRBC特异性Th)，并施
用抗gp39或HIg(250μg/鼠，第0、2、4天给药)，7天后，将
非免疫鼠的脾细胞或者HIg处理或抗gp39处理的小鼠的SRBC免疫脾
细胞，适当地转导至带有TNP免疫脾细胞作为TNP原发的B细胞源的
受体鼠。将鼠用TNP-SRBC进行类似的刺激，第5天测定IgG1抗TNP
滴度。正如接受非免疫供体脾细胞的小鼠与接受SRBC引发免疫的动
物脾细胞的小鼠相比，所产生的IgG1抗TNP明显低下这一事实所表
明的，在受体鼠，SRBC引发的T辅助细胞对于诱发再次抗TNP反应
是需要的(图5)。更重要的是，这些实验的结果揭示了，来自HIg
处理的和抗gp39处理的小鼠的SRBC辅助功能是相似的，表明抗gp39
处理并不改变Th功能或阻断Th的引发。而且作为抗gp39处理的结
果，并没消除抗原反应性Th或使之失去免疫性，因为Th细胞在转导
中提供了辅助作用。
实施例6：仓鼠抗gp39的体内清除
前面的研究已经确立了抗gp39(MR1)阻断了gp39与CD40结
合[15]，这就支持这样的假设：抗gp39的体内免疫抑制作用是由于
阻断了gp39-CD40相互作用。假定这一假设正确，观察抗gp39给药
的长时间免疫抑制需要宿主中抗gp39的维持。为确定在免疫抑制得
到证实的时间范围内抗gp39是否能被检测，从血清中检测抗gp39体
内清除率。小鼠接受4天的抗体给药方案(3×250μg抗gp39)，
在初次抗体给药后第7、14、21天测定血清抗gp39水平。对非
还原MR1(160kd)的Western blot分析表明，未破坏的血清抗gp39
至少在初次抗体处理后21天还能检测到(图6A)。与初次抗体治
疗后7天的血清中抗gp39的水平相比，第21天血清抗gp39浓度接
近5％(基于扫描光密度计)。
虽然已确定血清中有完整的抗gp39，查明抗gp39是具有生物活
性的这一点也同样重要。因此，用在4天中接受3×250μg抗gp39
的鼠血清染色gp39耐受Th(图6B)。将最后一次注射后3天(初
次抗体处理后7天)的血清抗gp39水平作为100％，初次抗体治疗后
14天，检测出血清中生物活性抗gp39单克隆抗体接近10～15％，
初次抗体治疗后21天，血清中仍有抗gp39 2～3％。因此，用
Western blot和生物学活性抗gp39检测未被破坏的gp39的两种方
法都表明，在开始抗gp39治疗后21天仍有近5％的抗gp39。这些
结果表明，抗gp39的半衰期接近12天，并提供了与抗gp39延长抑
制体液免疫应答是由于持续阻断Th功能这一假说一致的证据。
该研究表明，体内施用阻断了体内gp39-CD40相互作用的抗
gp39抗体，引起很深的对TD抗原的初次和再次体液免疫应答抑制，
但对TI II型抗原无此作用。另外，该研究表明，抗gp39处理并不阻
断抗原引发的Th细胞的引发。因此，gp39-CD40配基-受体对可以
用作体液免疫应答治疗控制的目标。
为弄清抗gp39是如何对体液免疫进行免疫抑制作用的，研究了
抗gp39对Th功能的直接作用。数据表明，抗gp39处理的小鼠的
SRBC免疫Th完全能够给适当的转导提供辅助作用，提示抗gp39处
理并不引起在体内Th消除或失去免疫性。这些结果导致这样推测：
抗gp39通过阻断gp39与CD40结合而不是通过使gp39耐受Th失活
来介导其免疫抑制作用的。为支持这一假设，建立了抗gp39阻断
gp39与CD40结合的体外研究[16]。而且，在免疫抑制发生期间可从
血清中检测出生物活性抗gp39。虽然在免疫抑制得到证实时在血清中
出现的抗gp39只有5％，但有可能次级淋巴器官的特殊部位的抗
gp39的局部组织浓度，比血清抗gp39浓度要高，而且清除率要低。
用抗gp39处理小鼠长时间地抑制对SRBC和异体Ig的初次免疫应答
90％以上。假如抗gp39通过阻断gp39功能来介导抑制，这些数据提
示gp39-CD40相互作用在对TD抗原的初次免疫应答的建立方面是重
要的。免疫组织化学分析确定，gp39被作为对TD抗原免疫的结果而
引发，并可能具有重要功能。gp39表达的原位研究表明，在初次体
液免疫应答过程中gp39-CD40相互作用的最初位点是在外周动脉淋
巴鞘(PALS)的外周部分及脾终末动脉周围。正是在这些位置，发现
了相互连接的gp39表达Th和抗原特异性B细胞共同存在，提示PALS
周围是在初次体液免疫应答时T细胞和B细胞相互作用的主要部位。
因而，PALS可能也是抗gp39干扰gp39表达Th细胞，最终抑制T-
B细胞相互作用、继而抑制Ig产生的部位。
与初次应答相似，被CFA中的KLH引发的鼠，在给药抗gp39后，
其再次体液免疫应答也表现出抑制。与抗gp39引起抗SRBC PFC降低
相一致，还观察到血清中对抗原刺激的抗体滴度也降低。小鼠血清中
所有抗KLH的Ig同型体的检测均因用抗gp39处理小鼠而降低(IgM，
IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，及IgE)。抗gp39给药的作用至少在用
抗原再次刺激后14天仍有所表现，确定了抗gp39的持续性免疫抑
制。抗gp39介导的对KLH的再次应答的免疫抑制并非KLH所独有的，
因为对异种Ig及异种红细胞的再次免疫应答也被抗gp39处理所抑制。
gp39表达Th的解剖学分布与在初次免疫中观察到的一样，然而，
gp39表达Th在免疫脾的分布频度超过了在初次免疫应答中观察到的
结果。在免疫脾的生发中心或滤泡未发现gp39表达Th。因此，这表
明B细胞是在外周动脉淋巴鞘和脾终末动脉被触发，与激活的Th细
胞反应，继而转移至滤泡和生发中心。
该研究的焦点是弄明抗gp39在对TD体液免疫控制中的潜在作用。
抗gp39的简单治疗方案导致延长抑制，是这种治疗性抗体的一种富
有吸引力的标志。特别感兴趣的可能是抗gp39防止对其它异种、治
疗性抗体，如Chi-L6的初次和再次体液反应的能力。这将使得病人
能够反复暴露于异种治疗性抗体。
实施例7：抗gp39抗体的生产和鉴定
实验1-直接抗人gp39抗体
为在人体诱导抗原特异性T细胞耐受，优选给某种直接抗人gp39
的抗体。下面是用来生产小鼠抗人gp39单克隆抗体的方法学。Balb
/c鼠用完全弗氏佐剂(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白，gp39-CD8
免疫。6周后用非完全弗氏佐剂(IFA)中的可溶性gp39-CD8刺激。
再次免疫后4周，再给可溶形式的可溶性gp39-CD8。2周后，用活
化的人外周血淋巴细胞强化。2周后，最后再用可溶性gp39-CD8强
化。在最后一次免疫后第4天，脾细胞与NS-1融合伴侣融合，作为
标准程序。
产生抗人gp39抗体的克隆是在多步筛选过程的基础上选择出来
的。首先通过利用gp39-CD8进行盘结合分析筛选。然后阳性克隆再
用对照CD8融合蛋白CD72-CD8筛选。那些CD8-CD72盘结合分析
表现出阳性的克隆被剔除。剩余的克隆静置，并与人外周血淋巴细胞
(PBL)作用6小时，用流式细胞计分析筛选。杂交瘤染色激活的，
但不染静置的，PBL被视作阳性。最后，检测剩余克隆的阻断CD40Ig
与盘结合gp39结合的能力。
最初约有300克隆通过gp39-CD8和CD72-CD8盘结合分析的筛
选。在这些克隆中，发现有30个能检测出盘结合gp39，而不能检出
CD8。继而，这些克隆被筛选来检测活性人PBL的gp39。约15个克
隆检测出活性PBL上的分子，但不能检出静息细胞。进一步通过确定
该克隆阻断CD40Ig检测盘结合gp39的能力来证实其特异性。该分析
中，被试验的10个克隆中的3个阻断CD40Ig的结合，这些克隆是
3E4、2H5和2H8。本文所述的方法优选使用这些克隆。那些在激活非
静息PBL试验中呈阳性的克隆，也用激活的大鼠T细胞克隆POMC8再
筛选其活性。克隆2H8表现出与该大鼠T细胞系的交叉反应。
实验2-直接抗人gp39的抗体
用实验1所描述的类似的免疫过程生产另外的直接抗人gp39抗
体。一只Balb/c小鼠用CFA中的可溶性gp39-CD8免疫，继而4周
后用6h活性人外周血淋巴细胞刺激。通过标准程序NS-1融合部分
与脾细胞融合的前4天，用可溶性gp39-CD8强化。杂交瘤克隆的筛
选通过6h活性人PBL染色、流式细胞计分析。将被活性而非静息人
PBL染色的克隆筛选出来。6个克隆被选出作进一步分析：4D9-8，
4D9-9，24-31，24-43，89-76，及89-79。
所筛选出的抗体的特异性通过数项测定来确定。首先，流式细胞
计分析表明，所有6个单克隆抗体染色活性而非静息外周血T细胞
(见图7B和7C，作为代表性例子，描述活性T细胞被4D9-8和
4D9-9分别染色)。被6种抗体中任一种辨识的分子的表达可在活
化4小时内被检测，活化后6～8小时内达高峰，活化后24小时则
不能检出。所有6种单克隆抗体辨识一种在活化CD3+PBL上表达的
分子，这种分子主要是CD4+表现型，但部分CD8+T细胞也表达这种
分子。被6种单克隆抗体辨识的这种分子的表达在培养基中有
Cyclosporin A的存在时被抑制，就象gp39的表达一样(见图8A
和8B，作为代表性例子，描述用Cyclosporin处理过的T细胞分别
被4D9-8和4D9-9染色)。在用人CD40Ig融合蛋白检测时，被这
些单克隆抗体辨识的分子与gp39，其表达的动力学和分布相同。另外，
所有这6种单克隆抗体阻断gp39被CD40Ig染色(见图9A和9B，
作为代表性例子，描述分别在4D9-8和4D9-9存在时，gp39被
CD40Ig染色的抑制)。在ELISA测定中，所有6种单克隆抗体辨识
gp39-CD8，一种gp39分子的可溶性融合形式。而且，所有6种单
克隆抗体免疫沉淀一种来自35S蛋氨酸标记的活性人PBL的约36kd
的分子。该免疫沉淀的分子与由人CD40Ig融合蛋白沉淀的分子相同。
这6种筛选出的单克隆抗体(4D9-8，4D9-9，24-32，24-43，
89-76，和89-79)的功能活性被作如下分析。首先，测定单克隆抗
体对纯化的人B细胞在有IL-4和可溶性gp39条件下培养的增殖的
抑制能力。纯化的人B细胞在有gp39和IL-4存在，或缺乏纯化的
单克隆抗体，或剂量在0～12.5μg/ml的CD40Ig的条件下培养。
培养3天后，用胸腺嘧啶结合测定B细胞增殖。结果(图10示)表
明，所有6种单克隆抗体能够抑制gp39和IL-4诱导的B细胞增殖。
mAbs 89-76和24-31在抑制诱导的B细胞增殖方面最为有效。
其次，检测mAb对抑制B细胞分化的能力，正如检测抗CD3激活
的T细胞及IL-2诱导的Ig产生。通过用FACS阳性选择，制备纯化
的IgD+人B细胞，然后在有或无剂量在0～10μg/ml的纯化的抗
gp39单克隆抗体的条件下，与抗CD3活化的人T细胞(丝裂霉素C
处理)和IL-2一起培养6天。第6天用ELISA测定IgM、IgG和IgA
的产生。结果(见表1)表明，正如IgM、IgG和IgA产生的检测，
所有6种抗体均能抑制T细胞依赖的B细胞的分化。
表1
免疫球蛋白的产生
mAb μg/ml IgM IgG IgA
none - 17,500 6710 4471
4D9-8 0.1 4813 2130 2819
1.0 4394 2558 1519
10.0 1081 389 396
4D9-9 0.1 3594 919 1731
1.0 2659 1233 1606
10.0 374 448 266
24-31 0.1 3863 981 344
1.0 1287 314 165
10.0 1120 596 23
24-43 0.1 6227 4132 432
1.0 3193 2130 192
10.0 7021 1232 1081
89-76 0.1 3783 1069 344
1.0 2180 352 171
10.0 818 551 19
89-79 0.1 9763 1924 3021
1.0 2314 460 156
10.0 183 135 434
为检测抗gp39mAb对T细胞反应的作用，将mAb包含在标准的
混合淋巴细胞应答(MLR)中。在有或无抗gp39mAb(10μg/ml)存
在的条件下，将300,000人外周血淋巴细胞(应答者＝R)与100,000
照射过的同种异体的外周血淋巴细胞(刺激物＝S)一起培养。第4、
5或6天给培养物加入3H胸腺嘧啶并在18小时后取样。经MLR检
测，所有6种抗人gp39mAb都抑制异种特异性反应(见图11，作
为代表性例子，描述当R和S在有24-31或89-76存在条件下培养，
CTLA4免疫球蛋白融合蛋白及抗CD28mAb用作阳性对照时，异种特
异性反应的抑制)。
为确定是否6种mAb识别人gp39分子上的独特的表位，进行了
交叉阻断实验。首先用6种单克隆抗体的每种阻断(25μg/ml非连
接抗体)活化的人PBL。洗脱细胞，然后用10μg/ml生物素连接抗
体染色，再与植物红细胞素连接抗生素蛋白(PE-Av)反应。通过
FACS分析细胞被PE-Av染色情况。结果如表2。
表2
阳断 染色抗体
抗体 4D9-8 4D9-9 24-31 24-43 89-76 89-79
none +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++
4D9-8 ND - ++++ ++++ +++ +++
4D9-9 +++ ND +++ ++++ +++ +++
24-31 + + ND +++ ++ ++
24-43 + + +++ ND ++ +
89-76 + + +++ +++ ND +++
89-79 + ++ +++ +++ +++ ND
染色密度及阳性细胞百分数用+符号代表(++++＝MI＞200；+++＝
MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝背景上没有染色)。ND＝
未测定。
所有抗体阻断CD40Ig与活性人PBL的结合。然而，表2中数据
表示一些抗体并没有阻断其它抗体与活性人PBL的结合，提示它们辨
识人gp39分子上独特的表位。
分别产生89-76及24-31抗体的89-76及24-31杂交瘤根据
Budapest Treaty的规定，于1994年9月2目存放在American Type
Culture Collection，Parklawn Drive，Rockyille，Md.。该89-76
杂交瘤被标为ATCC索取号__，并且该24-31杂交瘤被标为ATCC
索取号__。
实验3-直接抗鼠gp39抗体
在本发明的一项实施方案中，gp39拮抗剂是一种抗小鼠gp39单
克隆抗体，MR1。下述方法被用于生产MR1单克隆抗体，可能用于产
生其它直接针对gp39的抗体。
将仓鼠用5×106活性Th1细胞腹腔内免疫，间隔一周共6周。
当血清抗鼠Th1滴度高至1∶10,000以上时，使用免疫仓鼠的脾细
胞及NS-1用聚乙二醇进行细胞融合。从含有生长的杂交瘤的孔的上
清液中，用流式细胞计筛检静息的和活性的Th1。对一种产生选择性
辨识活性Th的多克隆抗体的特殊杂交瘤进行进一步检验并亚克隆获
得MR1。MR1在腹水中产生，通过离子交换HPLC纯化。一种杂交瘤
MR1已被存放在American Type Culture Collection，并被指定获取
号HB 11048。
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等效方案
本领域的技术人员不超过常规实验便可了解或确定许多与本发明
所描述的特定实施方案等效的方案。这些等效方案也应包含在下述权
利要求书的保护范围中。