一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用.pdf

一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用，本发明之枯草芽孢杆菌L-5，Bacillus subtilis L-5，该菌种于2015年 02 月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为 CGMCC No：10505。本发明还包括枯草芽孢杆菌的代谢产物与用于防除水田杂草的应用。本发明使用枯草芽孢杆菌L-5对大豆分离蛋白进行发酵，发酵液对稗草尤其是初萌稗草的生根具有明显抑制活性；发酵液对已成熟的作物根系则没有影响。采用本发明的发酵液除草具有环境友好，不产生杂草抗药性，对作物安全等显著特点，具有良好的应用前景。

1.  一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，是枯草芽孢杆菌L-5，Bacillus subtilis L-5，该菌种于2015年 02 月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为 CGMCC No：10505。

2.  一种制备如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的代谢产物的方法，其特征在于，具体包括以下实施步骤：
(1) 将菌株枯草芽孢杆菌L-5在LB固体培养基上培养12-24小时，接种于100mL/250ml种子培养基中，种子培养基配方为胰蛋白胨8-12克、酵母提取物3-5克、NaCl 8-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6.8-7.2,121℃灭菌20-30分钟，接种后于30℃下培养12-18小时至对数期；
(2) 取对数期菌株种子液接种于发酵培养基中，接种量4wt%，发酵培养基配方为: 大豆分离蛋白粉18-22克、NaCl8-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20-30分钟，冷却后接种，然后在30℃、140-160rpm条件下震荡培养72－120小时,培养完成后用纱布过滤即获得大豆蛋白发酵液。

3.  如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的代谢产物，用于防除水田杂草的应用。

一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用，尤其是涉及一株具有除草活性的枯草芽孢杆菌及其代谢产物大豆蛋白发酵液与应用，属于天然植物材料用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域。
背景技术
目前，种植业中对有害生物的生物防治主要针对植物病害和害虫危害，而对杂草的生物防治方法应用较少。
杂草危害是影响农业生产的主要问题之一，多年来的应对方法以化学防治为主，而随着化学除草剂的长期和过度使用，其带来的环境问题和对农作物品质的影响已经日益受到关注，寻求天然的植物源除草剂是解决这一问题的有效途径。相关研究表明，农田和园林生态系统中存在多种植物间的生化他感作用，某些植物残体的分解产物也能抑制植物种子萌发和生长，利用植物间的生化他感作用控制杂草是当前杂草防治研究的热点。
稗草是一种一年生草本植物，一般长在稻田里、沼泽、沟渠旁、低洼荒地，生长在稻田时，它长在稻子和稻子的间隙里，和稻子一起争养分，争空间，稗子和稻子外形极为相似，难以与稻子区分，因此稗子属于恶性杂草。
20世纪90年代初，美国Christians等发现了玉米蛋白粉对植物种子萌发时生根的抑制作用，并将其作为无公害植物源除草剂应用在草坪和有机农业的杂草防治上；用碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制备的水解多肽比玉米蛋白粉具有更高的生根抑制活性，Liu等从玉米蛋白粉水解物中分离出了高除草活性的多肽。之后更多相关研究表明，包括大豆蛋白在内的多种天然蛋白材料的水解产物同样具有除草活性。目前国内外的相关研究中，虽然使用蛋白酶水解蛋白材料能提高其对杂草的抑制活性，但蛋白酶的酶促水解反应对温度、pH等条件要求相对严格，在不良条件下存在蛋白酶易失活的问题，另外使用蛋白酶还存在成本过高的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用，利用枯草芽孢杆菌对大豆蛋白进行纯菌株发酵，从而提供一种具有除草活性的大豆蛋白发酵液，成本较低。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
本发明之枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌L-5（Bacillus subtilis L-5），该菌种于2015年 02 月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）保藏，菌种保藏号为 CGMCC No：10505。
本发明中所述枯草芽孢杆菌L-5是通过以下方法分离得到的：
(1) 分离纯化：称取5.0g酱油渣（酱油渣采集自湖南长沙本地酱油厂），加入100毫升无菌生理盐水中，震荡2小时后再用生理盐水梯度稀释；取稀释倍数10⁵～10⁸的菌液各100微升，将其分别均匀涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养24小时，每个稀释度各两个重复；挑取不同菌落形态的菌株进行反复划线纯化，直至菌落形态一致和显微镜镜检特征相同；
(2）菌株的筛选：挑取已纯化的菌株置于脱脂奶粉琼脂培养基37℃培养，挑取有明显水解圈的菌落进行单独培养，并观测其在脱脂奶粉琼脂培养基上培养3天的降解透明圈大小，选取一株获得最大降解透明圈(透明圈直径达12毫米)的菌株，命名为L-5；
(3） 菌株的鉴定：对菌株L-5进行形态、生理、生化特征的测定，并进行16SrDNA测序分析；16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），达到100%,结合菌株L-5形态学特征与生理生化实验结果，将菌株L-5鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），即为枯草芽孢杆菌L-5。
所述菌株L-5的特征：菌株L-5在LB固体培养基上形成的菌落表面粗糙，多褶皱，不易挑起；呈不透明乳白色；菌体杆状，革兰氏染色为阳性；无荚膜、周生鞭毛。菌株L-5明胶液化、淀粉水解、M.R、V.P、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原实验均表现为阳性，吲哚、硫化氢、厌氧生长实验均表现为阴性。16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），达到100%，结合菌株L-5形态学特征与生理生化实验结果，将菌株L-5鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
本发明之枯草芽孢杆菌的代谢产物，即利用枯草芽孢杆菌作为发酵剂，其制备方法，具体包括以下实施步骤：
(1) 将菌株枯草芽孢杆菌L-5在LB固体培养基上培养12-24小时，接种于100mL/250ml种子培养基中，种子培养基配方为胰蛋白胨8-12克、酵母提取物3-5克、NaCl 8-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6.8-7.2,121℃灭菌20-30分钟，接种后于30℃下培养12-18小时至对数期；
(2) 取对数期菌株种子液接种于发酵培养基中，接种量4wt%，发酵培养基配方为: 大豆分离蛋白粉18-22克、NaCl8-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20-30分钟，冷却后接种，然后在30℃、140-160rpm条件下震荡培养72－120小时, 培养完成后用纱布过滤即获得大豆蛋白发酵液。
本发明之枯草芽孢杆菌代谢产物的应用，即枯草芽孢杆菌L-5的大豆蛋白发酵液，用于防除水田杂草。其大豆分离蛋白粉的发酵液对初萌稗草具有明显生根抑制作用。发酵72小时的大豆蛋白发酵液，在每升溶液含2.0克大豆蛋白发酵液的浓度下，对初萌稗草抑制率达到94.8%，田间每亩施用质量浓度2.0克每升的溶液1.5-3升，对稗草的防治效果达89.6%以上。
本发明的有益效果是：
    本发明利用纯菌株发酵方法，制备具有除草活性的大豆蛋白发酵液，能提供一种制备天然生物除草剂的方法，制备出的发酵液安全，环保，不产生毒副作用，具有重要生态意义。
本发明使用枯草芽孢杆菌L-5对大豆分离蛋白进行发酵，发酵液对稗草尤其是初萌稗草的生根具有明显抑制活性；发酵液对已成熟的作物根系则没有影响，而且，使用降解菌对大豆分离蛋白的发酵条件相对简单，常温条件下即可进行。另外，相对于蛋白酶，使用菌株发酵，成本较为低廉。因此，本发明利用枯草芽孢杆菌L-5发酵大豆分离蛋白来除草，相对于使用蛋白酶进行水解，工艺更为简单，成本更为低廉，更适宜大规模实际应用。
大豆蛋白是一种天然植物材料，几乎不产生任何环境污染，来源丰富且含氮量高，是农作物有机肥来源之一，因此，利用本发明，可以将其作为天然的植物源除草剂且可以和有机肥结合，应用于农业杂草防治。
因此，利用大豆蛋白发酵液作为天然除草剂应用于杂草防治，特别适用于水稻田中稗草的防治，可以减少化学除草剂的环境污染，改善有机种植产业，具有良好的经济，生态和社会效益，前景广阔。
附图说明
图1为0.5mg/mL浓度下不同发酵时间所得大豆蛋白发酵液对稗草的根抑制活性影响图。
微生物保藏情况说明
枯草芽孢杆菌L-5（Bacillus subtilis L-5），该菌种于2015年 02 月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所）保藏，菌种保藏号为 CGMCC No：10505。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例之枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌L-5（Bacillus subtilis L-5），该菌种于2015年 02 月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）保藏，菌种保藏号为 CGMCC No：10505。
本实施例中所述枯草芽孢杆菌L-5是通过以下方法分离、筛选、鉴定得到的：
（1）菌株的分离筛选：称取5.0g酱油渣（酱油渣采集自湖南长沙本地酱油厂），加入100ml无菌生理盐水中，震荡2h后再其用生理盐水梯度稀释；取稀释倍数10⁵～10⁸的菌液各100微升，分别均匀涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养24小时，每个稀释度各两个重复；挑取不同菌落形态的菌株进行反复划线纯化，直至菌落形态一致和显微镜镜检特征相同；
（2）菌株的筛选：挑取已纯化的菌株置于脱脂奶粉琼脂培养基37℃培养，挑取有明显水解圈的菌落进行单独培养，并观测其在脱脂奶粉琼脂培养基上培养3天的降解透明圈大小，选取一株获得最大降解透明圈(透明圈直径达12毫米)的菌株，命名为L-5。
（3）菌株的鉴定：对菌株L-5进行形态、生理、生化特征的测定，并进行16SrDNA测序分析；菌株16SrDNA基因扩增、序列测定与系统发育分析按常规方法进行，用细菌通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）扩增16S rDNA。PCR反应体系（50μL）为：10×PCR buffer 5μL,dNTP（2.5mmol/L）2.5μL，上、下游引物各1μL（20μmol/L），Taq酶（2.5U/μL）1微升，菌体模板1微升，加入ddH₂O至50微升。PCR反应条件为：95℃ 10分钟，94℃ 1分钟、55℃ 40秒、72℃1分钟、30个循环，72℃ 5分钟，PCR产物经过1%凝胶电泳检测合格后，送上海铂尚生物技术有限公司进行双向测序，将测序结果导入GenBank数据库中，通过BLAST进行同源性比较。将序列与GenBank数据库中一些相近的相关菌株的16SrDNA序列编辑后导入到MEGA（5.0）软件，进行系统发育树构建。
将16SrDNA的分子生物学鉴定结果结合对菌株L-5作出的形态特征与生理生化实验结果，将菌株L-5鉴定为枯草芽孢杆菌L-5（Bacillus subtilis L-5）。
所述菌株L-5的特征：菌株L-5在LB固体培养基上形成的菌落表面粗糙，多褶皱，不易挑起；呈不透明乳白色；菌体杆状，革兰氏染色为阳性；无荚膜、周生鞭毛。菌株L-5明胶液化、淀粉水解、M.R、V.P、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原实验均表现为阳性，吲哚、硫化氢、厌氧生长实验均表现为阴性。16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），达到100%，结合菌株L-5形态学特征与生理生化实验结果，将菌株L-5鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
实施例2
本发明之枯草芽孢杆菌的代谢产物，即菌株枯草芽孢杆菌L-5大豆蛋白发酵液的制备，具体包括以下实施步骤：
（1）将菌株枯草芽孢杆菌L-5在LB固体培养基上培养24小时，接种于100毫升/250毫升种子培养基中，种子培养基配方为胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、NaCl 10克、蒸馏水1000毫升，pH值7.0,121℃灭菌20分钟，接种后于30℃下培养12-18小时至对数期；
（2）取对数期菌株种子液接种于发酵培养基中，接种量4wt%，发酵培养基配方为: 大豆分离蛋白粉20克、NaCl 10克、蒸馏水1000毫升，pH值7.0，121℃灭菌20分钟，冷却后接种，然后在30℃、150转每分钟条件下震荡培养72小时,培养完成后用纱布过滤即获得大豆蛋白发酵液。
实施例3
本实施例中，仅步骤（2）中，取对数期菌株种子液接种于发酵培养基中，在30℃、150转每分钟条件下分别震荡培养0、24、48、96、120小时,其他操作步骤与实施例2相同。不同培养时间所得发酵液用于实施例4中研究其对稗草的生根活性抑制影响。
实施例4
不同发酵时间所得大豆蛋白发酵液生根抑制活性检测
   以稗草种子作生根抑制活性检测材料，在规格为10×150毫米的玻璃试管中,分别加入不同浓度（分别为0.5克/升,1克/升,2克/升,4克/升）的大豆蛋白发酵液，将稗草种子催芽露白后，置于口径为10毫米的网塞中，再将网塞置于装满不同浓度大豆蛋白发酵液的玻璃试管口部，以蒸馏水为对照，各处理和对照选用5粒种子，各处理设置3个重复。于人工气候培养箱中培养（T=28℃,RH=95%,光照L/D= 12小时∶12小时)3天，培养结束后测量各幼苗根的长度作为统计标准。按公式：抑制率（%）=（对照组根长-处理组根长）/对照组根长×100%计算抑制率。结果如表1所示。
 *同列数据后具有不同小写字母者表示在0.05水平差异显著
实施例5
菌株枯草芽孢杆菌L-5大豆蛋白发酵液制剂防除稗草的防效测定。
田间防效测定：试验地设在湖南省长沙县高桥镇百录村。供试田块为常年稗草发生量较大的水稻田，土壤为浅红黄泥，pH6.7，有机质含量2.2％。供试水稻品种为‘Y两优8188’，超级杂交中稻。种植方式为直播，用种量每公顷37.5 公斤。田间管理措施与当地其他农田一致。试验依据农业部农药田间药效试验准则(一)GB／T 17980.40-2000进行。设4次重复，小区面积30平方米，随机区组排列。于6月18日在稗草5-6叶期(2-3个分蘖)采用茎叶喷雾处理，设置蛋白粉发酵液施药量每亩0.5升、1升、2升、3升四个处理，以每亩施用50wt%二氯喹啉酸可湿性粉剂25克作药剂对照，兑水每亩45 升。施药前排干水，药后2天复水。以不喷剂的小区为对照。于药后20天和40天调查稗草防效2次，每小区对角线取样调查4点，每点0.25平方米，记录稗草的株数，药后40天加测鲜重，统计除草效果。防效计算方法如下：
防除效果(％)=[(CK--PT)／CK]×100
式中：PT-处理区残存草数(或鲜重)；
CK-空白对照区活草数(或鲜重)。
试验结果表明，供试的6种稻田除草剂中，菌株L-5发酵液防除直播田稗草的效果在施药后20天, 大豆蛋白发酵液的施药量，在每亩1升、每亩2升、每亩3升的剂量，防治效果分别达到89.6%、91.5%和93.4%，施药后20天后，施药量在每亩1升、每亩2升、每亩3升的剂量，防治效果达到88.4%、92.8%和93.6%，与对照药剂二氯喹啉酸算相比(防效93.8%)，每亩2升、每亩3升的剂量没有显著差异。表明防治水稻田稗草具有良好的应用前景。

于药后3、7、15、20天目测水稻的生长情况，观察是否有药害现象发生。从田间目测结果看，未出现明显药害，也未出现促进水稻生长情况，表明对水稻正常生长是安全的。后期跟踪表明，菌株L-5发酵液对水稻的收成未见明显影响。
目前，用于防除水稻田稗草主要方法是化学防治，除草剂的广泛使用造成对作物药害问题、杂草抗药性问题、农药残留问题，造成除草剂除草但不增产，恶性杂草危害严重，对环境影响大等问题。例如，使用二氯喹啉酸的田里，下一年不能种植甜菜、茄子、烟草、番茄、胡萝卜等，两年后方可种植。一般施用后300天内除水稻、玉米等外，不能种任何作物；12个月内不能种茄子、烟草；2年内不能种胡萝卜、番茄。此外，芹菜、香菜、胡萝卜等伞形花科作物（伞形花科作物对其非常敏感）。而本发明之大豆蛋白发酵液的对环境友好、对作物安全、不产生抗药性等特点十分显著，有比较深远的应用前景。