变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发酵液在降解黄曲霉毒素B1中的应用.pdf

本发明涉及微生物发酵，特别是指变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发酵液在降解黄曲霉毒素B1中的应用。将变色栓菌PTrametes versicolor CICC 14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液，采用本发明的方法所制备的变色栓菌发酵液可应用于降解黄曲霉毒素B1。本发明解决了现有方法中需要特定条件和材料，劳动强度大，脱毒不完全，对处理材料有较大破坏作用，要求条件剧烈，往往会产生化学残留，造成二次污染等技术问题。具有工艺简便、安全性高，变色栓菌发酵液用于降解黄曲霉毒素B1，降解速度快，降解率高等优点。

1.  变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
甘蔗渣1.9％-2.3％，麸皮0.1％-0.12％，豆饼粉0.1％-0.13％，葡萄糖0.5％-0.7％，果糖0.5％-0.7％，硫酸铵0.08％-0.11％，磷酸二氢钾0.15％-0.2％，硫酸镁0.04％-0.06％，维生素B₁ 0.00001％-0.00003％,愈创木酚0.00013％，微量元素溶液占无菌培养基的体积比为0.07％-0.12％，余量为无菌水，pH＝4.5；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为体积比＝6-8∶100，温度29℃-31℃,通气量1∶0.7-1.2vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于220小时。

2.  根据权利要求1所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的变色栓菌菌种在接入无菌培养基前经过扩大培养。

3.  根据权利要求2所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。

4.  根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种的制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温度为29℃-31℃，培养周期4-5天。

5.  根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在30℃条件下振荡培养不低于90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。

6.  根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝10∶100的比例，将一级种子 接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝60-70:100，在温度为29℃-31℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。

7.  根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
葡萄糖0.9％-1.1％，酵母膏0.1％-0.12％，硫酸铵0.08％-0.11％，磷酸二氢钾0.15％-0.2％，硫酸镁0.04％-0.06％，尿素0.012％-0.015％，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0.07％-0.12％，余量为水，pH＝4.5。

8.  根据权利要求1或7所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的微量元素溶液采用如下方法配制：氯化钙100mg，硫酸亚铁100mg，硫酸锌20mg，硫酸铜25mg，定容至1000ml。

9.  根据权利要求1所述的方法制备的变色栓菌发酵液在降解降解黄曲霉毒素B₁中的应用。

变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵，特别是指一种变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Afiatoxin,AFT)是一类毒性极强的微生物代谢物质，对人类及动物危害极大，尤以对人和动物肝脏组织的破坏为主，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素主要产生于黄曲霉菌和寄生曲霉菌，此外一些曲霉、青霉、毛霉、镰孢霉、根霉、链霉菌和放线菌等也能产生该毒素。黄曲霉毒素在自然界中分布很广，以花生、玉米、大豆、谷物粮食及其制品中更为多见。黄曲霉毒素进入机体后，在肝脏中的量较其他组织器官中为高，说明肝脏受黄曲霉毒素危害最大。新的研究表明黄曲霉毒素对人和动物健康危害均与其抑制蛋白质的合成有关。它干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质合成，导致动物全身性损伤。进一步研究表明黄曲霉毒素对人类的危害作用分为直接和间接两种，直接摄入含黄曲霉毒素的粮食类食物对人的毒害为直接作用；黄曲霉毒素也可以食物链的方式转移(肉、奶等)并在人体内积累，造成对身体健康的危害为间接作用。
在若干种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B₁的毒性最强，对人的危害最大。初期的临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、肝区触痛等症状，严重者发生肝炎、水肿、肝硬化、昏迷、以至抽搐死亡。黄曲霉毒素一旦进入人和动物体内，会集聚在各个器官(尤其是肝脏)。它不能被分解，只能靠漫长时间排泄，因此，黄曲霉毒素在体内存留时间长且危害大。其危害已引起了世界范围的重视。
目前对黄曲霉毒素防治措施和解毒方法，主要分为三大类，包括物理、化学和生物脱毒和解毒法。物理法包括吸附、辐射处理、热处理、水洗液相抽提等方法；化学法主要为强碱、强酸和强氧化剂处理；生物法为生物酶制剂降解作用。由于物理方法需要特定条件和材料，劳动强度大，用料多，条 件苛刻，有时对被处理物的营养成分有破坏和损失作用，脱毒不完全，应用受到限制，难以实现大规模生产。化学法所用药品对处理材料有较大破坏作用，要求条件剧烈，往往会产生化学残留，造成二次污染。生物脱毒法是一种高效、无危害的的解毒方法，因其在温和条件下分解毒素且无残留，不破坏营养成分，不产生二次污染等原因，目前受到人们广泛的重视同时也是研究的主要方向。
微生物降解黄曲霉毒素主要采用细菌和真菌，国外大量资料研究显示，真菌多，细菌报道较少。
变色栓菌(俗称云芝菌)是最具药用价值的真菌之一，其发酵液中富含云芝多糖。云芝多糖具有清热、解毒、抗癌和保肝之功效，是良好的肌体免疫调节剂。近年来，云芝多糖已做成多种剂型药物和保健品流通于市场。云芝菌液体深层发酵还可产生多种酶制剂及蛋白质，其中漆酶、蛋白酶、过氧化酶、淀粉酶等是主要酶。目前，漆酶降解黄曲霉毒素B₁研究已有报道，降解率较高，但尚未有产品投放市场。
发明内容
本发明的目的在于提供变色栓菌发酵液(云芝)的制备方法及变色栓菌(云芝)发酵液在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。
本发明的整体技术构思是：
变色栓菌发酵液的制备方法，将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
甘蔗渣1.9％-2.3％，麸皮0.1％-0.12％，豆饼粉0.1％-0.13％，葡萄糖0.5％-0.7％，果糖0.5％-0.7％，硫酸铵0.08％-0.11％，磷酸二氢钾0.15％-0.2％，硫酸镁0.04％-0.06％，维生素B₁0.00001％-0.00003％,愈创木酚0.00013％，微量元素溶液占无菌培养基的体积比为0.07％-0.12％，余量为无菌水，pH＝4.5；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为体积比＝6-8∶100，温度29℃-31℃,通气量1∶0.7-1.2vvm，压 力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养周期为不低于220小时。
发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝法监测发酵液中蛋白质浓度≧2.5mg/ml确定发酵终点。
采用上述方法制备的变色栓菌发酵液在降解降解黄曲霉毒素B₁中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
出于工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的变色栓菌菌种在接入无菌培养基前经过扩大培养。
更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温度为29℃-31℃，培养周期4-5天。
所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在30℃条件下振荡培养不低于90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。
所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝10∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝60-70:100，在温度为29℃-31℃，通气量为1∶0.5-0.7vvm，压力为0.03Mpa-0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
葡萄糖0.9％-1.1％，酵母膏0.1％-0.12％，硫酸铵0.08％-0.11％，磷酸二氢钾0.15％-0.2％，硫酸镁0.04％-0.06％，尿素0.012％-0.015％，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0.07％-0.12％，余量为水，pH＝4.5。
所述的微量元素溶液采用如下方法配制：氯化钙100mg，硫酸亚铁100mg， 硫酸锌20mg，硫酸铜25mg，定容至1000ml。
采用本发明的方法所获得的发酵液采用常规方法进行固液分离后得到的液体即为变色栓菌发酵液制剂，固液分离的方法包括但不局限于采用板框分离、离心机分离等现有技术，均不脱离本发明的技术实质。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明工艺简便、成熟，只需深层发酵设备，固液分离后的液体即可用于解毒，制备过程无三废污染。
2、本发明中所使用的变色栓菌，不在致病菌种范围，安全可靠。
3、本发明中培养基的主要原料为甘蔗渣和豆饼粉，具有安全、无毒、绿色的特点。
4、该变色栓菌发酵液用于降解黄曲霉毒素B₁，降解速度快，降解率高，条件温和，选择性好，性能稳定。用于降解自然条件下污染黄曲霉毒素B₁(含量≤100μg/kg)的饲料，降解率≥77％。
5、采用本发明制备的产品使用简单，不会造成二次危害。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
变色栓菌发酵液的制备方法，将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
甘蔗渣1.9％，麸皮0.12％，豆饼粉0.1％，葡萄糖0.7％，果糖0.5％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.05％，维生素B₁0.00003％,愈创木酚0.00013％，微量元素溶液占无菌培养基的体积比为0.07％，余量为无菌水，pH＝4.5；
通气发酵的工艺条件如下：
接种量为体积比＝8∶100，温度31℃,通气量1∶0.7vvm，压力为0.04Mpa，培养周期为不低于220小时。
发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝法监测发酵液中蛋白质浓度≧2.5mg/ml确定发酵终点。
所述的变色栓菌菌种在接入无菌培养基前经过扩大培养。
所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。
所述的斜面菌种的制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温度为30℃，培养周期4天。
所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：
将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在30℃条件下振荡培养90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml一级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为一级种子培养终点。
所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子与二级种子培养基的体积比＝10∶100的比例，将一级种子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比＝70:100，在温度为29℃，通气量为1∶0.7vvm，压力为0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养终点。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
葡萄糖1％，酵母膏0.1％，硫酸铵0.11％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.06％，尿素0.012％，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0.07％，余量为水，pH＝4.5。
所述的微量元素溶液采用如下方法配制：氯化钙100mg，硫酸亚铁100mg，硫酸锌20mg，硫酸铜25mg，定容至1000ml。
采用本实施例的方法所获得的发酵液采用常规方法进行固液分离，其中 包括但不局限于采用板框分离、离心机分离等。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
甘蔗渣2.1％，麸皮0.11％，豆饼粉0.11％，葡萄糖0.5％，果糖0.7％，硫酸铵0.08％，磷酸二氢钾0.17％，硫酸镁0.04％，维生素B₁0.00002％,愈创木酚0.00013％，微量元素溶液占无菌培养基的体积比为0.09％，余量为无菌水，pH＝4.5；
接种量为体积比＝7∶100，温度29℃,通气量1∶0.9vvm，压力为0.03Mpa，培养周期为不低于220小时。
所述的斜面菌种的制备中培养温度为29℃，培养周期5天。
所述的二级种子的制备中：
装量为体积比＝60:100，在温度为30℃，通气量为1∶0.5vvm，压力为0.03Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
葡萄糖0.9％，酵母膏0.11％，硫酸铵0.09％，磷酸二氢钾0.17％，硫酸镁0.05％，尿素0.013％，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0.08％，余量为水，pH＝4.5。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
甘蔗渣2.3％，麸皮0.10％，豆饼粉0.13％，葡萄糖0.6％，果糖0.6％，硫酸铵0.11％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.06％，维生素B₁0.00001％,愈创木酚0.00013％，微量元素溶液占无菌培养基的体积比为0.12％，余量为无菌水，pH＝4.5；
接种量为体积比＝6∶100，温度30℃,通气量1∶1.2vvm，压力为0.05Mpa，培养周期为不低于220小时。
所述的斜面菌种的制备中培养温度为31℃，培养周期4.5天。
所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
按照一级种子的体积∶二级种子培养基的体积比＝10∶100将一级种子接入灭菌后的二级种子培养基，装量为体积比＝65:100，在温度为28℃，通气量为1∶0.6vvm，压力为0.04Mpa的条件下进行不低于72小时的通气发酵制成二级液体种子。
所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
葡萄糖1.1％，酵母膏0.12％，硫酸铵0.08％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.04％，尿素0.015％，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0.12％，余量为水，pH＝4.5。
申请人就上述实施例制备的变色栓菌发酵液制剂的添加量和降解黄曲霉毒素B₁的能力分别进行毒素水溶液和玉米饲料解毒试验。试验过程及结果如下：
1、试验过程
取玉米饲料10‰(W:W)的变色栓菌发酵液制剂加入一定量水稀释后，再分别与含97.7μg/kg黄曲霉毒素B₁的玉米饲料混匀，以玉米饲料表面湿润为好，密闭在37℃条件下，保温48小时以上，按照GB/17480-2008饲料中黄曲霉毒素B₁的测定方法-酶联免疫吸附法，测定降解后饲料中黄曲霉毒素B₁含量，并计算出降解率。
2、试验结果
解毒试验1
利用实施例1-3的方法获得的变色栓菌发酵液制剂按质量百分比分别为2‰、6‰、10‰比例添加到不同浓度黄曲霉毒素B₁(含量在5-120μg/L)的水溶液中，充分混匀，在37℃条件下保温48小时以上，用于降解黄曲霉毒素B₁毒性。降解毒素试验结果如表1。
表1变色栓菌发酵液制剂降解水溶液中黄曲霉毒素B₁结果

注：表中结果数据单位为μg/l。
由表1中试验结果说明，在黄曲霉毒素B₁含量为11.0μg/l溶液中，添加2‰变色栓菌发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥84.5％；在黄曲霉毒素B₁含量为54.3μg/l溶液中，添加6‰变色栓菌发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥85.1％；在黄曲霉毒素B₁含量为97.7μg/l溶液中，添加10‰变色栓菌发酵液制剂，对黄曲霉毒素B₁降解率≥86.5％。总之，水溶液中黄曲霉毒素B₁含量≤100μg/l时，添加≤10‰变色栓菌发酵液制剂，对毒素降解率可达80％以上。
解毒试验2
同样，分别取玉米饲料的3‰、7‰、10‰比例(W:W)变色栓菌发酵液制剂，加入一定量水稀释后，再分别与含11.0μg/kg、54.3μg/kg、97.7μg/kg黄曲霉毒素B₁的玉米饲料混匀，以玉米饲料表面湿润为好，密闭在37℃条件下，保温48小时以上，测定结果如表2。
表2变色栓菌发酵液制剂降解玉米饲料中黄曲霉毒素B₁测定结果

注：表中结果数据单位为μg/kg。
由表2结果得出：采用变色栓菌发酵液制剂，降解玉米饲料中黄曲霉毒 素B₁含量在11.0μg/kg时，加变色栓菌发酵液制剂量3‰，其解毒率≥80.9％；黄曲霉毒素B₁含量在54.3μg/kg时，加变色栓菌发酵液制剂量7‰，其解毒率≥65.0％；黄曲霉毒素B₁含量在97.7μg/kg时，加变色栓菌发酵液制剂量10‰，其解毒率≥77.0％
采用变色栓菌发酵液制剂，降解黄曲霉毒素B₁毒性，由解毒试验1、2比较得出，在水溶液中解毒效果好于玉米饲料中解毒效果。