新型甙类抗血栓药物 本发明涉及大蒜皂甙、大花红景天黄酮甙、土贝母皂甙及其衍生物对于防治血栓病的新用途和以其为主要成分制成的一类新型抗血栓药物。
大蒜是百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的鳞茎。大量现代药理和临床研究发现，大蒜具有较强的抑制血小板聚集作用，对抗血脂升高及提高纤溶活性，从而具有抗血栓、抗动脉粥样硬化的作用(陈静波等，中国药理学通报，1991，7(2)：88；韩金祥等，国外医学中医中药分册，1990，12(1)：1)。关于大蒜水溶性成分的化学研究，日本学者Matsuura报告得自大蒜的呋甾皂甙proto-eruboside-B，sativoside-B1，和两个甾体皂甙sativoside-R1，sativoside-R2的结构(Matsuura H，et al.，Chem Pharm Bull，1988，36：3659；Chem Pharm Bull，1989，37(10)：2741)。至于其药理作用，尚未见文献报道。
大花红景天Rhodiola crenulata SH.Fu为红景天的一种，前人曾报道其化学成分有红景天甙，酪醇，rhodionin，和rhodiosin(王曙等，药学学报，1992，27(2)：117；彭江南等，中草药，1995，26(4)：177)等，其中后两者为红景天中草质素类黄酮化合物，更具特征性。其药理作用尚未有人研究。
土贝母为葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet的干燥块茎。具有散结、消肿、解毒之功能，用于治疗乳痈瘰疬、乳腺炎、颈淋巴结核、慢性淋巴结炎、肥厚性鼻炎(《中华人民共和国药典》90版第11页)。大环三萜皂甙为土贝母中含量较大的成分，此类成分结构复杂独特，现已鉴定的有土贝甙甲，乙和丙〔孔凡华等，化学学报1988，46，772-778；1988，46，409-411〕等(结构见表3)。于立坚等人发现土贝甙甲有很强的抗癌活性及对癌促过程强的抑制作用〔Planta Medica1994，60，204-208；科学通报1991，(18)：1421-1424〕，但是迄今为止关于土贝母皂甙对心血管系统的作用尚未见报道。
本发明的目的是研究上述甙类化合物对心血管系统的作用，寻找防治血栓病的有效药物。
本发明首次发现大蒜皂甙proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)、大花红景天黄酮甙rhodionin(III)和rhodiosin(IV)以及从土贝母总甙中分得土贝母甙甲(V)，乙(VI)和丙(VII)及其经纤维素酶酶解得衍生物1(VIII)，2(IX)和3(X)(结构见表1，2和3)均具有很强的抑制血小板聚集作用和提高纤维蛋白溶解活性，并可明显延长血液凝固时间(结果见表4)。提示，此类化合物可用作血栓病(如脑血栓、心肌梗塞、动脉粥样硬化等)的防治。
以上述任一有效单体或由其组成的混合物为原料，所作成的药物可以是各种剂型，包括口服和注射两种途径。剂量范围可以是3-200mg/千克体重/日，较好的用量为3-50mg/千克体重/日，优选用量为5-25mg/千克体重/日。
实施例：
1.各种甙类化合物的制备工艺
大蒜新鲜鳞茎、大花红景天块茎和土贝母块茎，各2公斤，分别粉碎，含水醇(可以是含水甲醇、乙醇)浸提4次(4000ml×4)，每次24小时，合并浓缩液，减压蒸除其中醇类至2500ml。所得提取液氯仿萃取三次(1000ml，500ml，500ml)。
水层再与正丁醇分配三次(1300ml，1200ml，500ml)。合并正丁醇层减压浓缩得正丁醇萃取部位，溶于水中，冻干，分别得大蒜总皂甙(TSG，收率0.58％)，大花红景天总甙(TSR，收率4.34％)和土贝母总皂甙(TSB，收率2.75％)。性质：均可溶于水、甲醇。
各总甙样品经Prep.HPLC分离制备单体。条件如下：ODS柱(7.8mm×250mm)；流动相：MeOH-H2O(70∶30→55∶45)；检测：RI(衰减1024)或UV；流速：1.0ml/min；进样量：0.7ml/次；分析时间：35-45min/针；纸速：0.25cm/min。分别从大蒜总甙中分得proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)(见表1)；从大花红景天总甙中分得两个黄酮甙rhodionin(III)和rhodiosin(IV)(见表2)；从土贝母总甙中分得土贝母甙甲(V)，乙(VI)和丙(VII)；土贝母甙甲，乙和丙分别经纤维素酶酶解得衍生物1(VIII)，2(IX)和3(X)(见表3)。
2.结构鉴定
主要利用光谱，包括红外、紫外、核磁共振谱(1H-NMR，13C-NMR，DEPT，1H-1H，1H-13C COSY和HMBC)和FAB-MS分析，鉴定其结构。运用酶解、酸水解、碱水释及糖醇醋酸酯GC-MS分析技术解决了含糖较多的皂甙中糖的连接顺序和连接位置。
3.生物活性测定
(1)抗血小板聚集实验
取健康兔静脉血，离心(1000rpm)20min，取上清液为PRP(富血小板血浆)，剩余部分经离心(3000rpm)10min，取上清液为PPP(贫血小板血浆)。用取样器取不同体积的待测样品溶液(根据溶解性用生理盐水或甲醇溶解)置入直径为6mm比色杯中，放入自动比色槽中，定量取PRP及PPP，将血小板数调至28-30万/μl，于37℃培养，加入2μM ADP(0.05ml)诱导，比浊法测定血小板聚集性，计算抑制率及IC50。所用仪器为日本产Aggregometer PAM-8T血小板聚集测定仪。
(2)血液凝固时间测定
取健康兔静脉血，0℃离心(3000rpm)10min，取上清液为PPP，用取样器取待测样品溶液(DMSO溶解)30μl，向其中加入150μl PPP，37℃培养50秒，再加入150μl 0.025M CaCl2溶液，旋转搅拌，待旋转停止，即为血液凝固时间，以溶剂为空白对照计算血液凝固的时间延长率，以不同浓度样品溶液测定IC50。所用仪器为日本产血液凝固时间测定仪。
(3)纤溶活性测定
(a)琼脂培养皿地制作：
磷酸缓冲液(pH7.4)400ml加入琼脂4.8g，NaN3200mg直火沸腾，5ml分装在试管中60-80℃水浴保温，以免凝固。用磷酸缓冲液将凝血酶(thrombin)调成100u/ml(1支5ml磷酸缓冲液)勿使起泡，标上标记。右手拿琼脂5ml(50℃)，左手拿纤维蛋白原(fibrinogen)(得自小牛血清，持田制药会社)5ml一起加入培养皿中，迅速用手旋转幌动(7-10圈)混匀，为了不让起泡，可以搀上述凝血酶溶液(5次)。在上述培养皿中用一小管按对角线方向打六个小孔穴，中心打一个小孔穴，将孔中的琼脂去掉。
(b)样品活性测定：
不同样品(2mg)用100μl磷酸缓冲液(不溶时用DMSO)溶解，加尿激酶(Urokinase)(用磷酸盐缓冲液溶解成500IU/ml)15μl。取上述样品溶液10μl加入孔穴中，每个样品两个孔穴，中心孔穴为空白样品，37℃培养18小时。向培养皿中注入5％NaCl水溶液，放置20分钟，反复操作2次，下一步用精制水洗净，同样反复操作2次。洗净后，60℃干燥(约需3小时)。用0.2％Coomassie Brilliant BlueR-250染色液染色，放置20分钟将染色液倒掉，盘中加入洗净液(EtOH∶EtOAc∶H2O＝45∶10∶45)放置20分钟，进行脱色处理，60℃干燥3小时。测量孔穴直径，计算面积，求出与空白对照组的面积比，得出纤溶活性提高率：(样品面积/对照组面积-1)×100％，以不同浓度样品溶液反复测量，算出其IC50。
上述生物活性实验的结果表明，大蒜总甙TSG具有抗血小板聚集和提高纤溶活性；proto-iso-eruboside-B(I)具有显著的提高纤溶活性；iso-eruboside-B(II)具有明显的延长血液凝固时间和提高纤溶活性；大花红景天中的rhodionin(III)具有抗血小板聚集作用，并可延长血液凝固时间，rhodiosin(IV)则有抗血小板聚集活性；而土贝母总甙TSB及土贝母皂甙(V-X)均具有很强的抗血小板聚集活性，明显延长血液凝固时间和提高纤溶活性(见表4)。腺苷作为阳性对照在此实验中则有抗血小板聚集活性和提高纤溶活性。
表1得自大蒜的甙类化合物的结构Proto-iso-eruboside-B(I)Iso-eruboside-B(II)
表2得自大花红景天的甙类化合物的结构Rhodionin(III)Rhodiosin(IV)
表3得自土贝母的甙类化合物的结构土贝母甙甲(V) R1＝-β-D-Xyl R2＝-H R3＝1 Ara 4土贝母甙乙(VI) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Ara 4土贝母甙丙(VII) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Glc 6衍生物1 (VIII) R1＝-H R2＝-H R3＝1 Ara 4衍生物2 (IX) R1＝-H R2＝-OH R3＝1 Ara 4衍生物3 (X) R1＝-H R2＝-OH R3＝1 Glc 6
表4生物活性实验结果
抑制血小板聚集实验 延长血液凝固时间实验 提高纤溶活性实验甙类样品 IC50* IC50* IC50*
mg/ml (mM) mg/ml (mM) mg/ml (mM)腺苷 1.9 (7.1) ------ 25 (93.6)TSG 27.3 ----- 13I ------ ----- 13 (10.5)II ------ 1.5 (1.4) 19 (17.6)III 3.7 (8.2) 6.8 (15.2) ------IV 7.5 (12.3) ------ ------TSB 3.6 1.5 15V 1.8 (1.3) 2.6 (1.9) 14 (10.6)VI 0.3 (0.2) 2.5 (1.8) 14 (10.3)VII 0.5 (0.3) 2.3 (1.6) 13 (9.3)VIII 5.2 (4.3) 5.7 (4.8) 21 (17.7)IX 4.1 (3.3) 4.4 (3.6) 30 (24.3)X 2.7 (2.1) 3.6 (2.8) 28 (22.2)*表中所指相当与给药浓度，并非终浓度；------为活性不强，未测IC50；样本数4-6