3，5-二取代的和3，4，5-三取代的2-异噁 唑啉和异噁唑，其制备方法及其作为药物的用途 本发明涉及用于预防和/或治疗炎症，气喘，风湿性疾病和自身免疫疾病的药物。
非留醇类抗炎药物，例如乙酰基水杨酸和吲哚复辛的作用模式是已知的。其基础是抑制环氧化酶、该酶存在于许多细胞内，它产生促进炎症的前列腺素。
还已知此类环氧化酶抑制剂可被用于风湿病治疗(EP245825)。
然而，同时也很清楚，除了其讨厌的作用外，前列腺素也可产生需要的细胞保护性质，例如在血小板中，在胃十二指肠和肾脏中。因为这一原因，所有环氧化酶抑制剂都带来讨厌的副作用，如延长出血时间，产生胃溃疡和抑制肾功能。
鉴于此，可以有利地不抑制前列腺素，而通过封锁其形成来抑制特别有力的炎症介质，白细胞胞三烯和细胞因子，如白细胞介素1α和白细胞介素1β，氧基和蛋白酶的物质类别。
现已发现，式I化合物基本上不抑制环氧化酶，而抑制来自白血细胞的白细胞三烯，细胞因子，氧基和蛋白酶，也证明在试验气喘，自身免疫疾病和风湿性疾病模型中的正效果。
本发明涉及式I化合物和/或式I化合物的药理耐受盐和/或式I化合物的立体异构形式；在此文本中，基团R1或R2中的一个具有式II的意义而基团R1或R2中的另一个具有如下意义：a)吡啶基，b)噻吩基，c)噻唑基，d)式III的基团其中n是数字0，1，2，3，4，5或6，m是数字0，1，2，3或4，z是1)-O-，或 2)-NH-，R5和R6各自独立地为
1)氢原子，
2)(C1-C4)烷基，
3)(C2-C4)烯基，
4)(C2-C4)炔基，
5)苯基，或
6)OH，和R7为1)氢原子，
2)氨基酸残基，
3)三氟甲磺酰基，
4)-O-P(O)(OH)2，
5)用苯基或(C1-C6)烷基一-或二-酯化的-O-P(O)(OH)2，或
6)式IV的基团其中O是数字0或1，且其中R9和R10各自独立地有如下意义：1)氢原子，或2)(C1-C4)烷基，和R11为 1)OH， 2)-O-(C1-C4)烷基， 3)(C1-C20)烷基， 4)(C1-C20)烷基，各自独立地被
4.1-COOH，
4.2-OH，
4.3 O-乙酰基，或
4.4＝O
一次或多次取代， 5)-COOH， 6)-COO-(C1-C4)烷基-， 7)N-甘氨酰基， 8)N-甘氨酰基-(C1-C4)烷基酯， 9)N-(C1-C4)-烷基羟基氨基， 10)N-(1H-四唑-5-基)氨基， 11)5-甲基异噁唑-4-基， 12)1-氰基-2-羟基-1-丙烯基，
13)苯基，
14)苯基，被下式基团一次或多次取代
14.1(C1-C4)烷基-NR12R13其中R12和R13各自独立地具有如下意义：
1)氢原子，
2)(C1-C4)烷基，
3)苯基-(C1-C2)-烷基，
4)R12和R13与连接它们的氮原子一起形成五-至七-员杂环，该杂环是未取代地或被(C1-C4)烷基取代一至三次，该取代基的一个碳原子可被硫，氧或氮原子代替，或
5)氨基酸残基，或
R6和R7互相键连，并一起为1至3个CH2基团，
e)式V的基团
-Q1-CO-R8(V)
其中Q1是
1)-(CH2)m-，其中m是数字0，1，2，3或4，或
2)-CH＝CH-，和
R8是1)氢原子，
2)(C1-C4)烷基，
3)OH，
4)-O-(C1-C4)烷基-
5)NH2，
6)N-(1H-四唑-5-基)氨基，或
7)N-(3，5-二甲基-4-羟基苄基)氨基，或
f)式VI的基团
其中Q2是
1)-(CH2)m-其中m是数字0，1，2，3或4，或
2)-CH＝CH-，和
X和Y各自独立地为
1)(C1-C4)烷基，
2)-O-(C1-C4)烷基，或
3)OH，…A…是存在或不存在的双键，其限制是双键和基团R4不同时存在，R4是1)氢原子，或
2)(C1-C6)-烷基，或R2和R4与连接它们的碳原子一起形成由3，4或5个碳原子组成的脂族环，而R3是1)氢原子
2)羟基-(C1-C4)烷基，或
3)羟基-(C1-C4)烷基。
式I化合物可以光学异构体，非对映异构体或外消旋体，或其混合物存在于药物中。设计的烷基或烷酰基可以直链或支链的形式存在。
对本发明来说，五-至七-原杂环是，例如，吡咯，吡啶，氮杂，噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吡唑、咪唑、噻嗪、1，2-噁嗪，1，3-噁唪，吗啉，哒嗪，嘧啶，吡唪，1，2-硫氮杂，1，3-硫氮杂，1，4-硫氮杂，1，2-氧氮杂，1，3-氧氮杂，1，4-氧氮杂，1，2-二氮杂，1，3-二氮杂，1，4-二氮杂或其部分或完全饱和的变体。特别应提到吡咯烷，哌啶，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪或吡啶。
术语“氨基酸”被理解为立体异构形式，例如如下化合物的D和L形式：
天冬酰胺，颉氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，色氨酸，β丙氨酸，赖氨酸，脯氨酸，甘氨酸，γ-氨基丁酸，Nε-乙酰基赖氨酸，Nδ-鸟氨酸，Nγ-乙酰基二氨基丁酸，Nα-乙酰基二氨基丁酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，丙氨酸和酪氨酸。L-氨基酸是优选的。氨基酸残基从相应的氨基酸衍生。氨基酸的名称以习惯方式缩写。氨基酸残基通过酰胺键连接到-NH-上或通过酯键连接到-O-上。
下列氨基酸残基是优选的：Gly，Ala，Phe，Ser，Thr，Val，β-Ala，γ-氨基丁酸，Asp，Glu，Gln，Nε-乙酰基赖氨酸，Nδ-乙酰基鸟氨酸，Nα-乙酰基二氨基丁酸，Lys或tyr。
优选的式I化合物和/或式I化合物的药理耐受盐和/或式I化合物的立体异构形式，其中R1或R2中的一个具有式II的意义，而R1或R2中的另一个具有如下意义：a)2-吡啶基，b)4-吡啶基，c)噻吩-3-基，d)2-噻唑基，e)式III的基团，
其中n是数字0，1，2，3或4，而m是数字0或1，z是1)-O-，或 2)-N-，或R5和R6各自独立地为
1)氢原子，
2)(C1-C2)烷基，
3)苯基，或
4)OH，或R6和R7互相连接一起形成亚甲基，或R7为1)氢原子，
2)三氟甲磺酰基，
3)氨基酸基Gly，Phe，Ala，Lys，Tyr，或Ser，或
4)式IV的基团
其中O为数字0或1，
R9和R10各自独立地为
1)氢原子，或
2)甲基，
R11是：
1)OH，
2)-O-(C1-C4)-烷基，
3)(C1-C18)烷基，
4)互相独立地被下列基团取代一次或多次，
4.1-COOH，
4.2 OH，或
4.3 O-乙酰基，
5)-COOH，
6)-COO-(C1-C4)-烷基，
7)N-甘氨酰基，
8)N-甘氨酰基-(C1-C4)烷基酯，
9)N-甲基羟基氨基，
10)N-(1H-四唑-5-基)氨基，
11)5-甲基异噁唑-4-基，
12)1-氰基-2-羟基-1-丙烯基，
13)被13.1 4-(4-吗啉代)甲基取代一次的苯基，f)式V的基团，其中Q1是
1)-(CH2)m-，其中m是数字0，1，或2，或
2)-CH＝CH-，而R8是1)氢原子，
2)甲基，
3)OH
4)-O-(C1-C2)-烷基，
5)氨基，
6)N-(1H-四唑-5-基)氨基，或
7)N-3，5-二甲基-4-羟基苄基，或g)式VI的基团，
其中Q2是
1)-(CH2)m-，其中m是数字0，1，或2，或
2)-CH＝CH-，X和Y互相独立地为
1)甲基，
2)-O-(C1-C2)-烷基，或
3)OH，…A…是存在或不存在的双键，其限制是双键和R4基团不能同时存在，R4为
1)氢原子，或
2)(C1-C2)-烷基，或R2和R4与它们所连接的碳原子一起形成具有3，4或5个碳原子的脂环，R3为
1)氢原子，
2)甲基，或
3)羟甲基。
特别优选的是式I化合物和/或式I化合物的生理耐受盐和/或式I化合物的立体异构形式，其中基团R1或R2之一具有式II的意义，而R1或R2中的另一个具有如下意义：a)2-吡啶基，b)4-吡啶基，c)噻吩-3-基，d)2-噻唑基，e)式III的基团，
其中n是数字0，1，2，3或4，而m是数字0或1，
z是1)-O-，或
2)-NH-，或R5和R6各自独立地为
1)氢原子，
2)(C1-C2)烷基，
3)苯基，或R6和R7互相连接一起形成亚甲基，或R7为1)氢原子，
2)三氟甲磺酰基，
3)氨基酸基Gly，Lys，或Phe，或
4)式IV的基团
其中O为数字0或1，
R9和R10各自独立地为
1)氢原子，或
2)甲基，
R11是：
1)OH，
2)-O-甲基或O-乙基，
3)(C1-C18)烷基，
4)互相独立地被下列基团取代一次或多次的
(C1-C6)烷基，
4.1-COOH，
4.2 OH，或
4.3 O-乙酰基，
5)-COOH，
6)-COO-(C1-C2)-烷基，
7)N-甘氨酰基，
8)N-甘氨酰基-(C1-C2)烷基酯，
9)N-甲基羟基氨基，
10)N-(1H-四唑-5-基)氨基，
11)5-甲基异恶唑-4-基，或
12)1-氰基-2-羟基-1-丙烯基，f)式V的基团，
其中Q1是
1)-(CH2)m-，其中m是数字0，1，或2，或
2)-CH＝CH-，而
R8是
1)氢原子，
2)甲基，
3)OH
4)-O-甲基，
5)氨基，
6)N-(1H-四唑-5-基)氨基，或
7)N-3，5-二甲基-4-羟基苄基，或g)式VI的基团，
其中Q2是
1)-(CH2)m-，其中m是数字0，或2，或
2)-CH＝CH-
X和Y互相独立地为
1)甲基
2)-O-(C1-C2)-烷基，或
3)OH，…A…是存在或不存在的双键，其限制是双键和R4基团不能同时存在，R4为1)氢原子，或
2)甲基，或R2和R4与它们所连接的碳原子一起形成具有3，4，或5个碳原子的脂环，R3是1)氢原子，或
2)羟甲基。
以结构式列于表1的化合物是非常优选的。
本发明也涉及制备式I的2-异噁唑啉或异噁唑和/或式I化合物的立体异构形式和/或式I化合物的生理耐受盐的方法，其中a)用异氰酸酯和催化量的三乙胺将伯硝基化合物转化为对应的腈氧化物，或用有机或无机碱将通过氯化对应的醛肟得到的异羟肟酰氯转化为对应的腈氧化物，作为中间体得到的此腈氧化物不经纯化与适当取代的烯或炔反应，进行1，3-二极环加成，形成式I的2-异恶唑啉或异噁唑，如果需要，产生的产物通过结晶或色谱纯化，或b)根据a)或o)制备的式I的羧酸酯，或通过方法h)或k)额外引入的酯基，被水解为羧酸，或c)根据方法a)或o)制备的式I的羧酸烷基酯用适当取代的伯胺或仲胺转化为对应的酰胺，或d)根据a)或o)制备的式I的次膦酸一烷基酯或膦酸二烷基酯被水解为膦酸半酯，膦酸或次膦酸，或e)根据b)得到的羧酸首先被转化为活化的酸衍生物，此衍生物随后用醇酯化，或用伯胺或仲胺转化为对应的酰胺，或用N-烷基化的羟胺转化为对应的羟基酰胺，或f)在方法a)，b)，h)，e)，o)或g)中中间得到的或携带的N-保护基或O-保护基被消除，或被引入的羧酸，次膦酸，膦酸或膦酸酯被相应水解，得到式I化合物，或g)根据方法f)或o)得到的，并具有游离氨基的化合物通过与异氰酸酯反应转化为相应的脲衍生物，或通过与活化的羧酸衍生物或N-保护的氨基酸反应转化为相应的酰胺，或通过与磺酰氯反应转化为对应的磺酰胺，或h)根据方法a)，o)或f)得到的，具有游离醇基的化合物通过与异氰酸酯反应转化为相应的脲烷，或通过与在羧基上被活化并可进一步带有官能团的羧酸衍生物或相应的N-保护的氨基酸衍生物反应转化为相应的酯，或用二烯酮转化为相应的3-氧代丁酸酯，或通过与卤代化合物如α-卤代羧酸反应转化为相应的醚，或i)根据方法a)，o)或f)得到的，具有伯或仲醇基的化合物被氧化为相应的醛或酮，或k)根据方法i)制备的羰基化合物通过与碱和二烷基膦酰基乙酸酯反应转化为巴豆酸衍生物，或通过与四烷基亚甲基二膦酸酯反应转化为相应的反式-2-(二烷氧基膦酰基)乙烯基衍生物，或1)在环加成期间引入的环氧基被转化为相应的1，2-二醇，或m)根据方法g)制备的，含有3H-异噁唑环的酰胺通过用碱处理进行开环，转化为2-氰基-3-羟基巴豆酰胺，或n)根据方法a)-m)制备的，由于其化学结构而以对映体形式存在的式I化合物通过与对映体纯的酸或碱成盐，在手性固定相上层析，或用手性对映体纯的化合物如氨基酸衍生，分开这样得到的非对映体，消除手性辅助基，被拆分为纯对映体，或o)通过与手性或外消旋烯环加成得到的式I的2-异恶唑啉非对映异构的混合物通过硅胶柱色谱被拆分为纯的非对映异构体，或p)根据方法a)-o)制备的式I化合物可以以游离形式被分离，或如果需要，当有酸或碱基存在时，被转化为生理耐受盐，或q)根据方法h)制备的，带有其它官能团如卤代甲基的化合物被用伯或仲氨基烷基化，或用醇酯化。
从式I化合物，包括其可以形成盐的立体异构形成制备生理耐受盐以本身已知的方式进行。羧酸，膦酸和次膦酸，以及膦酸半酯，与碱性试剂如氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐或醇盐，以及氨或有机，碱例如三甲胺，三乙胺或乙醇胺，以及碱性氨基酸，例如赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸形成稳定的碱金属盐，碱土金属盐或非强制性取代的铵盐。至于在R1或R2基团中有碱性基团的式I化合物，也可用强酸制备稳定的酸加成盐。无论无机酸或有机酸，如盐酸，氢溴酸，硫酸，膦酸，甲磺酸，苯磺酸，对甲基磺酸，4-溴苯磺酸，环己基酰氨基磺酸，三氟甲磺酸，乙酸，草酸，酒石酸或三氟乙酸都适于此目的。
用作1，3-二极环加成原料化合物的腈氧化物的制备和转化描述于最近的专题文章(K.P.G.Torsell：Nitrile Oxides，Nitrones and Nitronates in Organic Synthesis，VCH Vertags-gesellschaft，Weinheim，1988)中。用作前体的异羟肟酰卤可根据文献的已知方法，通过卤化相应的醛肟，或在氯氧亚氨基乙酸酯的情况下，经重氮化反应从甘氨酸烷基酯得到(G.S.Skinner，J.Am.Chem.Soc.64(1924)，731)。如果次氯酸叔丁酯被用于氯化醛肟，不需要分离相应的异羟肟酰氯。也可被使用的硝基化合物在一些情况下是从文献已知的，或由文献已知其原理的方法制备，例如，4-硝基丁酸酯由氧化物催化的或碱催化的硝基甲烷与丙烯酸衍生物的加成得到(D.W.Chasar，Synthesis 1982，841-42；N.Ono，Synthesis 1984，226-227)。
从文献已知的产量可被显著提高，一般表现为难于分开的副产物的双加合物的形成在很大程度上通过用1，8-二氮杂双环〔5.4.0〕十一碳-7-烯(DBU)作为碱以特殊方式进行反应而防止。
作为反应物的非强制性取代的烯或炔衍生物作为母体物质，绝大部分已知并从文献也可购得。适当的指导在实施例中给出。容易低聚的腈氧化物的生产有利地在烯属或炔属反应物存在下不经任何中间体分离，“就地”进行。当它们从硝基化合物根据Mukaiyama的方法生产时，芳族异氰酸酯，例如异氰酸苯酯或二异氰酸根合笨，被优选用于脱水。在此情况下，可以有利地在非质子溶剂或对反应物惰性的分配剂，如乙酸乙酯，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二烷基醚，四氢呋喃，卤代烃，例如二氯甲烷，氯仿或二氯乙烷，烃，如己烷，环己烷，苯，甲苯或其它取代的芳族化合物中进行，上述溶剂的混合物也是合适的。有机或无机，碱如叔胺，碱金属碳酸盐或碱金属氢氧化物被用于从异羟肟酰卤生产腈氧化物。在此情况下，当有机碱被使用时，反应优选地在上述非强制性氯代的脂族或芳族烃或脂族，以及环状醚中进行，而且，当无机碱被使用时，反应也可在两相溶剂混合物，例如乙酸乙酯/水或二氯甲烷/水中进行。腈氧化物的制备和环加成一般在-20℃至+80℃的温度，然而，优选0°至+40℃进行。
夹带在环加成中，或通过进一步反应的方或被随后引入的烷基酯水解越相应羧酸通常用可以等摩尔量或过量使用的碱水溶液，在水溶液中，或者，如果原料化合物难溶于水，在水/有机溶剂混合物中实现，水/醇混合物已被证明具有特殊价值。
在通式I中的取代基R1或R2中带入的胺，醇或羧酸保护基的裂解通常根据在肽化学上已知的方法进行，在优选使用的叔丁氧羰基的情况下，酸性消除，例如用醇溶解的盐酸或三氟乙酸是优选的，而低级烷基酯优选地在碱性条件下裂解。
膦酸酯和次膦酸酯向相应的游离酸的转化在酸性条件下，优选在无水介质中实现，例如在有机酸如乙酸中用氢溴酸，或在非质子溶剂中用三甲基溴代甲硅烷或三甲基碘代甲硅烷实现，卤代烃优选地被应用。在此情况下，0°至50℃被选作反应温度以确除裂解在温和条件下进行。膦酸半酯通常通过将膦酸二酯进行碱性水解而制备。
在R1或R2中具有游离羧酸官能团的式I化合物在羧基适当活化后，可以用本身已知的方法用伯或仲胺，也可用N-烷基化的羟胺或5-氨基四唑转化为相应的酰胺。
在R1或R2中具有游离醇或胺官能团的式I化合物可用活化的羧酸衍生物如酰卤或酸酐转化为相应的酯或酰胺。相应的酯或酰胺也可从N-保护的氨基酸得到。在此情况下，由肽化学已知的方法有利地用于活化氨基酸成分，例如，羟基苯并三唑/二环己基碳二亚胺法(W.Kning，R.Geiger，Chem.Ber，103(1970)，2034-2040)或用丙基膦酸酐(PPA)活化，也可以用氯代烃，如二甲基甲酰胺，作为溶剂(除脂族和环状醚之外)。叔胺，如三乙胺，N-乙基吗啉或吡啶优选作为辅助的碱。反应在-10℃至+50℃，优选在0℃至+20℃的温度范围进行。
至于以被保护的形式存在的酰基衍生物需要为游离的氨基官能团或羧酸官能团形式，相应的保护基可以通过已在上面叙述的方法单个或一起除去。
除此之外，在R1或R2中具有游离醇或胺官能团的式I化合物可通过加入适当取代的异氰酸酯转化为脲烷衍生物或脲衍生物。与异氰酸酯加入有关，或作为附加官能团被引入的酯基可如上所述被转化为相应的羧酸。
具有游离伯或仲醇官能团的化合物可以简单地通过称为“Swern氧化”的方法，用二甲基砜和草酰氯氧化为相应的醛或酮。在此情况下，副反应如苯酚环的氧化或2-异噁唑啉环的氧化降解可通过在低温适当地进行反应而避免。这样得到的羰基化合物可用碱和CH-酸性化合物，如二烷基膦酰基乙酸烷基酯或四烷基亚甲基二膦酸酯，进行缩合而转化为相应取代的反应烯烃。
至于以非对映异构或对映异构形式存在的式I化合物，和它们在选择合成中的混合物，它们拆分为纯立体异构体既可通过在手性或非手性载体上层析的手段，对于式I的外消旋化合物也可以通过将光学活性的碱或酸作为辅助物质形成的非对映异构盐分级结晶实现。通过薄层色谱或柱色谱拆分一般以外消旋形式存在的，在5-位具有不对称(原子的)-异噁唑啉的对映异构体的合适手性固定相的例子有修饰的硅胶载体(所谓Piclkle相)以及高分子碳水化物，例如三乙酰基纤维素。适当衍生后，如本专业技术人员已知的，在手性固定相上的气相色谱法也可用于分析的目的。为了拆分外消旋羧酸，膦酸和次膦酸的对映异构体，不同溶解性的非对映异构体盐用一般可购得的光学活性的碱，例如，(-)-烟碱，(+)-和(-)-苯基乙胺，奎林碱，L-赖氨酸或L-和D-精氨酸形成，较难的成分作为固体被分离，较易溶的非对映异构体被从母液分出，纯的对映异构体被从以这种方式得到的非对映异构体盐中分离。
含有碱基如氨基的式I的外消旋化合物可以用原理相同的方式，用光学活性的酸如(+)-樟脑-10-磺酸，D-和L-酒石酸，D-和L-乳酸或(+)和(-)扁桃酸转化为纯对映异构体。含有醇或胺官能团的手性化合物也可用适当活化或非强制性N-保护的对映异构纯的氨基酸转化为相应的酯或酰胺，或相反地，手性羧酸可用羧基保护的对映异构纯的氨基酸转化为酰胺，或用对映异构纯的羟基羧酸如乳酸转化为相应的手性酯。引入对映异构纯形式中的氨基酸残基或醇基然后可用于析分异构体，通过结晶或在合适固定相上层析拆分现在为非对映异构体的异构体，然后用合适的方法再次消除带有的手性分子部分。
本发明也涉及药物，其特征在于至少一种式I化合物和/或式I化合物的立体异构形式和/或式I化合物的生理耐受盐的有效成份，加上药用和生理耐受的赋形剂，佐剂和/或活性化合物和辅助物质。根据本发明的药物可静脉内，肠胃外，局部，直肠或口服给药。
根据本发明的药物优选地适于预防和/或治疗气喘病，炎症和自身免疫疾病。
这些包括，例如，肌肉，关节或胃肠道的急性和慢性炎症，变应性呼吸道疾病，牛皮癣或自身免疫病，例如周身红斑狼疮(SLE)，II型糖尿病，重症肌无力，Sjgren’s综合症、皮肤肌炎，硬皮病或多发性硬化(MS)。
本发明也涉及制备本发明药物的方法，其中至少一种式I化合物与药用和生理耐受的赋形剂，和如果合适，进一步有合适的活性化合物，佐剂或辅助物质一起被制成给药的合适形式。
制剂合适的固体或液体药物形式的例子有粒剂，粉剂，包衣片剂，片剂，(微)胶囊，栓剂，糖浆，液汁，悬浮液，乳剂，滴剂或注射液以及缓释活性化合物的制剂，在形成的制剂中，常用佐剂，如载体物质，崩解剂，粘接剂，包衣剂，膨胀剂，滑动剂，润滑剂，调味剂，甜味剂和增溶剂被使用。可被提到的常用辅助物质的例子有碳酸镁，二氧化钛，乳糖，甘露糖醇和其它糖，滑石，牛奶蛋白，明胶，淀粉，纤维素及其衍生物，动物和植物油，如鳕鱼肝油，葵花籽油，花生油或芝麻油，聚乙二醇和溶剂，例如，灭菌水和一元或多元醇，例如甘油。
药物制剂被优选地以剂量单位制备并给药，每单位含有规定剂量的本发明式I化合物作为活性成份。在固体剂量单位的情况中，如片剂，胶囊剂，包衣片剂或栓剂，该剂量可高达约1000mg，然而优选地，约50至300mg，而在以安瓿形式的溶液的情况中，高达约300mg，然而，优选地约10至100mg。
依据式I化合物在人和动物中的活性，约50至3000mg活性化合物，在口服给药的情况下，日剂量优选地约150至1000mg，在静脉内给药的情况下，约50至1000mg，优选约100至300mg，日剂量被定为治疗体重约70kg的成年害者。然而，有时也适于更高或更低日剂量给药。日剂量既可以单剂量单位形式也可以几个较小剂量单位，或在固定的间隔给予再分的剂量。最后，式I化合物和/或(如果合适)其生理耐受盐也可被配制，当制备上述药物给药形式时，与其它合适活性化合物，例如血流促进物质，血小板凝聚抑制剂，血小板聚集抑制剂，钙拮抗剂，抗血小板剂，抗高血脂剂，神经保护剂，止痛剂，镇静剂，抗抑郁剂，抗炎剂，抗咽痛剂，强心剂，抗心律失常剂，利尿剂，抗高血压剂，包括β-受体阻断剂和钙阻断剂，血浆膨胀剂和其它血管治疗剂一起配制。
下述制备实施例的结构式，与熔点和1H-NMR数据一起列于表1中。如果立体异构形式存在，相对构型以结构式给出。下列NMR谱的δ值以ppm给出。
实施例13-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-5-羟甲基-2-异噁唑啉a)3-(4-羟基-3，5-二叔丁基)苯甲醛肟
该肟用文献(Houben-Weyl：Meth.d.Org.Chem.(Methods ofOrganic Chemistry)，Vel.X/4，pp.55ff)，已知的方法，从3-(4羟基-3，5-二叔丁基)苯甲醛制备。b)与腈氧化物的1，3-二极性环加成
将24.9g(0.1mol)在a)中制备的醛肟溶于250ml二氨甲烷中，在冷却下滴加12.0g(0.11mol)次氨酸叔丁酯，一旦滴加完成，混合物在室温下搅拌45分钟。加入11.6g(0.2mol)烯丙醇之后，慢慢滴加(6小时内)溶于150ml二氯甲烷中的16.7ml(0.12mol)三乙胺。将混合物搅拌过夜，用水，稀柠檬酸，和NaCl溶液洗涤，硫酸钠干燥并减压浓缩。通过从甲基叔丁基醚/石油醚结晶以晶体形式得到产物。产量：13.1g
在后面表1中所述的实施例：2，5，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，35，44，48，66，67，68，69，78，79和80类似于实施例1通过就地制备的腈氧化物与相应的烯或炔环加成制备。
在粗产物的情况下，它最初表现为油状物，硅胶层析，用甲基叔丁基醚/石油醚或乙酸乙酯/石油醚混合物洗脱，并随后结晶，也已被证明有价值。
关于列于表1中实施例合成的特色：
关于实施例2)：
烯结构成份的合成在EP0220573中叙述。
关于实施例8)：
3-乙烯基噻吩：CAS No.13679-64-6
关于实施例11)：
对丙烯酸甲酯环加成。用过量的饱和氨甲醇溶液在室温下转化为酰胺。
关于实施例14)：
对N-(3，5-二甲基-4-羟基苄基)异丁烯酰胺(合成描述于DE3820699中)。
关于实施例15)：
属于非立体选择性环加成，产物表现为非对映异构体混合物。
关于实施例16和17)：
与对丁二烯-氧化物环加成关联的外消旋赤或/苏式非对映体混合物通过硅胶色谱的手段拆分为非对映异构体，用石油醚/乙酸乙酯9∶1洗脱，并随后结晶(实施例16：外消旋赤式异构体，实施例17：外消旋苏式异构体)。
关于实施例18-20)：
通过对1-丁烯-3-醇环加成的外消旋赤式/苏式非对映异构混合物(实施例18)通过硅胶色谱拆分为非对映异构体，用石油醚/甲基叔丁基醚5∶1洗脱(实施例19：外消旋赤式异构体，实施例20：外消旋苏式异构体)。
关于实施例21-22)：
通过对1-丁烯-3-醇乙酸酯环加成的外消旋赤式/苏式非对映异构体混合物通过硅胶色谱拆分为非对映异构体，用石油醚/乙酸乙酯19∶1洗脱(实施例21：外消旋赤式异构体，实施例22：外消旋苏式异构体)。
关于实施例23)：
用丙烯酸叔丁酯进行环加成。叔丁基酯基用三氟乙酸在二氯甲烷中室温下消去。浓缩后，可以从甲基叔丁基醚/石油醚中结晶产物。
关于实施例35)：
烯结构成份的合成描述于EP0220573中。
关于实施例48)：
用N-叔丁氧羰基炔丙基胺进行环加成。N-保护基团随后用三氟乙酸消除。可以三氟乙酸盐的晶体形式从甲醇/甲基叔丁基醚得到产物。游离的碱通过用二氯甲烷从稀NaOH水溶液中萃取，并干燥和浓缩有机层得到。
关于实施例78)：
用6-庚烯-2，4-二醇进行环加成。由NMR谱确定为异构纯的产物通过用甲基叔丁基醚/石油醚硅胶层析，随后从上述溶剂重复结晶得到。
关于实施例79和80)：
类似于实施例1)用过量1，6-庚二烯-4-醇进行环加成。通过用石油醚/乙酸乙酯混合物(梯度6∶1-2∶1)硅胶层析的手段拆分为非对映异构体。用NMR谱不可解分辨苏式/赤式异构体。
实施例32-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉-5-基甲氧基)甲基丙酸
将4.0g(0.095mol)实施例2的产物溶于80ml甲醇中，加入25ml1N NaOH水溶液；-旦水解完成(用TLC监测)，混合物用25ml 1N Hcl酸化。沉淀的产物被过滤，水洗并干燥。产量：3.0g
实施例4N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑-5-基甲氧基羰基)甘氨酸a)与异氰酸酯反应
将5.5g(0.018mol)实施例1的产物溶于5ml二氨甲烷中，加入3.2g(0.025mol)异氰酸根合乙酸乙酯和约4滴三乙胺，混合物在搅拌下于50-60℃加热。-旦反应完成(用TLC监测)，混合物被浓缩并用甲基叔丁基醚/石油醚硅胶层析。产量：7.2g油状产物b)乙基脂的水解
7.2ga)的产物，如实施例3)中所述，用过量的1N NaOH水解，酸化后，以晶体形式分离。产量4.56g
实施例63-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑淋-5-基膦酸
5.0g(0.013mol)实施例5的产物在室温用约100ml HBr在冰乙酸中的33％溶液处理，直到反应完全(用TLC监测)。浓缩后残留物与甲基叔丁基醚充分搅拌。产量：3.15g。
实施例73-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉-5-基膦酸甲基酯
5.0g(0.013mol)实施例5的产物在室温下被溶于100ml甲醇中。加入30ml 1N NaOH，混合物被搅拌15小时(用TLC监测)。酸化(1NHCl)后，用二氯甲烷萃取，接着用水和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥并浓缩。残余物从甲基叔丁基醚/石油醚中结晶。产量：3.4g。
实施例21和22(另一合成)1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉-5-基)乙基乙酸酯(分别为赤式或苏式异构物)
将2.5g(0.008mol)实施例19或20的产物溶于100ml二氯甲烷和6ml吡啶中。加入125mg 4-二甲基氨基吡啶后，在冰冷却下滴加溶于10ml二氯甲烷中的1.35ml(0.024mol)乙酰氯；一旦反应完成(用TLC监测)，将混合物用水，硫酸氢钾水溶液和水洗涤，干燥并浓缩。残留的油状物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。
实施例33(1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)-1-甲基乙氧基)乙酸乙酯
在保护性气体中，冰冷却下，溶于40ml无水二甲基甲酰胺中的10.0g(0.03mol)实施例29的产物被滴加到1.06g(0.044mol)氢化钠在30ml无水二甲基甲酰胺中的悬浮液中。在没有冷却下经另30分钟后，溶于30ml无水二甲基甲酰胺中的10.8g(0.044mol)溴代乙酸乙酯被滴加到混合物中，混合物然后被再搅拌4小时。反应混合物然后被倒入冰中，用乙酸乙酯萃取。水洗，干燥并浓缩。油状残余物从石油醚结晶。产率：6.8g。
实施例34(1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)1-甲基乙氧基)乙酸
3.7g(0.009mol)实施例33的产物类似实施例3水解。产量：2.9g。
实施例362-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲氧基)2-甲基丙酸
9.5g(0.023mol)实施例35的产物类似于实施例3水解。产量：6.6g。
实施例37N-甲基异羟肟酰基-2-((3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲氧基)2-甲基丙酸酯
4.0g(0.01mol)实施例36的产物类似于文献(EP0199151)的方法，用草酰氯和N-甲基羟胺衍生。产物从甲基叔丁基醚结晶。产量：2.7g。
实施例382-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲氧基)N-(1H-四唑-5-基)异丁酰胺
6.0g(0.015mol)实施例36的产物类似于文献(J.Org.Chem.，34(1969)、2766-2767)的方法用1.7ml(0.015mol)四氯化硅和无水吡啶中的1.25g(0.015mol)5-氨基四唑衍生。产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：3.9g。
实施例39N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲氧碳基)甘氨酸乙酯
14.0g(0.046mol)实施例24的产物类似于实施例4a)反应。残留的油状物用甲基叔丁基醚/石油醚1∶4硅胶层析纯化。产量：16.4g。
实施例40N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲氧羰基)甘氨酸
7.1g(0.06mol)实施例39的产物类似于实施例3水解。产率：4.1g。
实施例41N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基丙氧羰基)甘氨酸乙酯
8.0g(0.024mol)实施例26的产物类似于实施例4a)反应。残留油状物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶纯化。产量：6.1g。
实施例42N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基丙氧羰基)甘氨酸
4.0g(0.0089mol)实施例41的产物类似实施例3水解。产量：2.8g。
实施例43N-(2-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基乙氧羰基)甘氨酸
6.25g实施例25的产物类似于实施例4a)反应。残留的产物类似于实施例3水解，并用甲基叔丁基醚硅胶层析，并最终从甲基叔丁基醚/石油醚结晶纯化。产量：3.8g。
实施例453-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基丙酸
4.3g(0.011mol)实施例44的产物被类似于实施例3水解。产重：3.0g。
实施例463-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)N-(1H-四唑-5-基)丙酰胺
7.0g(0.02mol)实施例45的产物用四氯化硅和无水吡啶中的5-氨基四唑类似于实施例38衍生。产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产率：6.5g。
实施例473-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基丙烯酸a)Swern氧化形成醛
在-60℃和保护性气体中，将25.4g(0.2mol)草酰氯首先引入250ml无水二氯甲烷中，然后滴加溶于20ml无水二氯甲烷中的31.2ml(0.044mol)二甲亚砜。30分钟后，在-50℃和45分钟内，滴加溶于200ml无水二氯甲烷/20ml二甲基甲酰胺中的30.3g(0.1mol)实施例2 4的产物，混合物随后搅拌20分钟。加入5 5.6ml(0.4mol)三乙胺之后，移走冷浴，混合物随后在室温搅拌1小时，用水，稀柠檬酸水溶液和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩。残留的油状物用甲基叔丁基醚/石油醚1∶9硅胶层析，并从石油醚结晶。产量：16.4g。b)烯化
在0℃和保护性气体下，将0.77g(0.032mol)氢化钠首先引入40ml无水四氢呋喃中，然后8滴加溶于50ml无水四氢呋喃中的5.05g(0.024mol)二乙基膦基乙酸甲酯，产生的悬浮液随后在0℃搅拌1小时；然后滴加溶于50ml无水四氢呋喃中的4.8g(0.016mol)实施例47a)的产物，混合物随后再搅拌2小时，倒入冰水中，用二氯甲烷萃取几次，水洗，干燥并浓缩。产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：4.2g。c)水解
3.7g(0.01mol)实施例47b)的产物类似于实施例3水解。产量：3.3g。
实施例49N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异恶唑-5-基甲基)三氟甲磺酰胺
在冰冷却下，溶于50ml无水二氯甲烷中的3.6g(0.012mol)实施例48产物的碱形式被首先引入，随后加入3.95g(0.014mol)三氟甲磺酸酐，和2.2ml(0.017mol)N-乙基吗啉；混合物随后搅拌过夜，用水，稀柠檬酸水溶液和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩。残留的油状物用甲基叔丁基醚/石油醚3∶1硅胶层析，并从甲基叔丁基醚/石油醚结晶纯化。产量：2.1g。
实施例50N-(3-(4-羟基-3，5二叔丁基苯基)异恶唑-5-基甲基)氨基草酸乙酯
在冰冷却下，9.1g(0.03mol)实施例48的产物的碱形式，在无水四氢呋喃中，与3.9ml(0.035mol)(氯代甲酰基)甲酸乙酯和9.7ml(0.07mol)三乙胺以类似于文献(J.Med.Chem.，34(1991)，600)的方法酰化。加入冰水后，用乙酸乙酯萃取，用水，稀柠檬酸水溶液和NaCl溶液洗涤，接着干燥并浓缩。残留的油状物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：9.1g。
实施例51N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异恶唑-5-基甲基)氨基草酸
5.0g(0.012mol)实施例50的产物类似于实施例4b)水解。表现为油状物的产物通过用二氯甲烷萃取，用水和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩分离。残留的非晶状产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：3.4g。
实施例525-甲基异恶唑-4-甲酸(3-4-羟基-3，4-二叔丁基苯基)异恶唑-5-基甲基)酰胺
在冰冷却下，5.0g(0.0165mol)实施例48产物的碱形式与2.2ml(0.017mol)N-乙基吗啉首先引入80ml无水四氢呋喃中，然后滴加溶于10ml四氢呋喃中的2.5g(0.017mol)5-甲基异噻唑-3-基甲酰氯；混合物在室温搅拌5小时。加入冰水并用二氯甲烷萃取后，用水，稀柠檬酸水溶液和NaCl溶液洗涤，接着干燥并浓缩。得到的油状物用甲基叔丁基醚/石油醚1∶1硅胶层析纯化并从石油醚结晶。产量：4.9g。
实施例532-氰基3-羟基丁-2-烯甲酸(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲基)酰胺
将4.0g(0.01mol)实施例52的产物溶于50ml无水四氢呋喃中，在冰冷却下加入20ml 1N NaOH；一旦反应完成(由TLC监测)，混合物用22ml 1N Hcl酸化，用二氯甲烷萃取；接着洗涤，干燥并浓缩。残留物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：3.3g。
实施例54(3-(3-(4-羟基3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲基)脲基)乙酸乙酯
在50-60℃，搅拌下，14.2g(0.047mol)实施例48产物的碱形式与6.5g(0.05mol)异氰酸根合乙酸乙酯一起加热。一旦反应完成(用TLC监测)，混合物被浓缩，并从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：11.3g。
实施例55L-苯丙氨酰基-N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲基)酰胺盐酸盐a)用N-叔丁氧羰基苯丙氨酸酰化
将5.3g(0.02mol)N-叔丁氧羰基苯丙氨酸溶于100ml无水四氢呋喃中，加入4.5g(0.022mol)二环己基碳二亚胺和3.1g(0.02mol)1-羟基苯并三唑水合物，混合物被搅拌约45分钟。将沉淀出的脲滤出。加入2.3ml(0.018mmol)N-乙基吗啉后，滴加溶于50ml四氢呋喃中的6.25g(0.015mol)实施例48的产物。4小时后，加入乙酸乙酯，用0.1N HCl和饱和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩。粗产物通过硅胶色谱(甲基叔丁基醚)进一步纯化。产量：8.9g N-叔丁氧羰基保护的产物油状物。b)消除保护基
通过用二氯甲烷(150ml)中的三氟乙酸(25ml)处理，浓缩并蒸发几次，加入乙醚中的盐酸后，接着与石油醚充分搅拌，消除保护基，并转化为盐酸盐。产量：6.3g非晶状盐酸盐。
实施例56(3-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基甲基)脲基)乙酸
6.5g(0.015mol)实施例54的产物类似于实施例3水解。产量：5.7g
实施例572-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)乙烯基膦酸二乙酯
反应在无水四氢呋喃中，以文献(J.Med.Chem.，32(1989)，2171)的方法，从6.4g(0.021mol)实施例47a)的产物，6.25ml(0.025mol)四乙基亚甲基二膦酸酯和9.6ml(0.024mol).5M丁基锂溶液进行。反应完成后，反应混合物被倒入冰水中，用二氯甲烷萃取几次；水洗，干燥并浓缩。产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：7.9g。
实施例582-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)乙烯基膦酸
在保护性气体和室温下，将4.0g(0.009mol)实施例57的产物在300ml无水二氯甲烷中与3.9ml(0.03mol)三甲基溴代甲硅烷一起搅拌，直至反应完成(由TLC监测)。加入0.5ml水之后，混合物被浓缩；剩余物在甲醇中处理几次并减压浓缩。油状物与甲基叔丁基醚搅拌直至保留晶状残渣。产量：3.0g。
实施例593-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-5-乙酰基异噁唑
5.0g(0.016mol)实施例28的产物类似于实施例47a)进行Swern氧化。产量：3.88g。
实施例603-(4-吡啶基)-5-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉a)2，6-二叔丁基-4-乙烯基苯酚
烯的合成是已知的：(P.Grosso，O.Vogl：J.Macromol.Sci.Chem.，A23(1986)，1041-1056)。b)作为腈氧化物前体的异羟肟酰氯
4-吡啶基异羟肟酰氯以类似于文献的方法(Bull.Soc.Chim.France(1962)，2215)通过将吡啶-4-甲醛肟氯化制备。c)环加成
11.6g(0.05mol)a)的产物和9.7g(0.05mol)实施例60b)的产物被首先引入500ml二氯甲烷中，然后在6小时内滴加溶于200ml二氯甲烷中的20.9ml(0.15mol)三乙胺。如实施例1处理。产量：13.1g。
实施例613-(2-噻唑基)-5-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)2-异噁唑啉
5g(0.039mol)2-噻唑基甲醛肟(制备：A.Dondoni，Synthesis(1987)，998-1001)如实施例1所述，用次氯酸叔丁酯在二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1∶1)中氯化，然后加入16.3g(0.07mol)实施例60a)的烯，并根据实施例1进行环加成。残留的油用甲基叔丁基醚/石油醚1∶2硅胶层析并从甲醇/少量水结晶纯化。产量：6.4g。
实施例623-羧基-5-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉a)作为腈氧化物前体的异羟肟酰氯
氯氧亚氨基乙酸乙酯通过文献(G.S.Skinner，J.Am.Chem.Soc.，46(1924)，731)的方法从甘氨酸乙酯制备。b)用乙氧羰基腈氧化物环加成
将溶于80ml二氯甲烷中的4.55g(0.03mol)实施例62a)的产物在6小时内滴加到4.65g(0.02mol)实施例60a)的烯和5.6ml(0.04mol)三乙胺在100ml二氯甲烷中的溶液中。根据实施例1处理。产量：4.8g。c)乙酯的水解
类似于实施例3进行水解和处理。从实施例62b)的6.0g(0.017mol)产物得到3.55g晶状羧酸。
对于下面实施例63和65的环加成步骤，硝基丁酸结构成份以Mukaiyama方法的变种(J.Am.Chem.Soc.，82(1960)，5339-5342)用异氰酸酯脱水。从丙烯酸衍生物和硝基甲烷进行的合成途径对不能以商品得到的衍生物和下面硝基丁酸叔丁酯所述的衍生物是代表性的。当相应的取代的乙烯基膦酸酯和乙烯基膦酸被使用时，此方法也可用于4-硝基丙基次膦酸和4-硝基丙基膦酸的衍生物。
实施例635-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉-3-基丙酸a)硝基丁酸叔丁酯
在浴温70℃下，将537ml(3.7mol)丙烯酸叔丁酯被滴加到首先引入的2.0l硝基甲烷和7ml1.8-二氮杂双环〔5.4.0〕十一碳-7-烯(DBU)的溶液中，由于痕量丙烯酸而可能下降的pH通过加入适量DBU保持不变。放热反应被停止后(上升到90℃)，混合物被冷却60分钟，然后用稀盐酸和水洗涤几次，干燥并减压浓缩，残留的660g浅红棕色油状物通过蒸馏(bp5：90℃)进一步纯化。
下列硝基化合物用相同途径制备：3-硝基丙基膦酸的二甲基和二乙基酯(从乙烯基膦酸酯进行)，3-硝基丙基-P-甲基次膦酸乙酯(乙烯基-P-甲基次膦酸乙酯进行)。b)环加成
在50℃下，7.0g(0.03mol)实施例60a)的烯首先引入带有0.5ml三乙胺和6.4g(0.04mol)二异氰酸亚苯基酯的80ml甲笨中。7.6g(0.04mol)在a)中所述的4-硝基丁酸叔丁酯，和0.2ml三乙胺被溶于80ml甲苯中，并在5小时内滴加。混合物在室温搅拌过夜；沉淀出的脲然后抽滤出来，并用二氯甲烷洗涤。浓缩后，保留的油状粗产物通过硅胶色谱(洗脱剂：石油醚/甲基叔丁基醚混合物)纯化。c)消除羧基保护基
5g(0.012mol)b)的产物在室温下在80ml二氯甲烷中用20ml三氟乙酸处理，直至反应完全(约3小时)。浓缩后，剩余物与甲基叔丁基醚充分搅拌，得到3.6g晶状产物。
实施例645-(4-羟基-3，5二叔丁基)苯基-2-异噁唑啉-3-丙酸N-(1H-四唑-5基)酰胺
5.0g(0.15mol)实施例63的产物根据实施例38，用四氯化硅和5-氨基四唑在无水吡啶中衍生。产物从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：3.5g。
实施例65(2-(5-(4羟基3，5-二叔丁基苯基)-2-异噁唑啉-3-基)乙基)甲基次膦酸
环化根据实施例63，从3-硝基丙基-P-甲基次膦酸乙酯进行。次膦酸酯基根据实施例7在碱性条件下裂解。
实施例70L-苯丙氨酸-1-(3-(4羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)乙基酯盐酸盐a)用N-叔丁氧羰基苯丙氨酸酰化
将2.65g(0.01mol)N-叔丁氧羰基苯丙氨酸溶于50ml无水四氢呋喃中，然后加入1.53g(0.01mol)1-羟基苯并三唑水合物和2.27g(0.011mol)二环己基碳二亚胺，混合物被搅拌约45分钟。加入0.12g 4-二甲基氨基吡啶之后，溶于25ml四氢呋喃中的3.17g(0.01mol)实施例2g的产物被滴加。再过2小时后，如下处理：加入乙酸乙酯，用0.1N NaOH，0.1N HCl和饱和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩。粗产物通过硅胶色谱(石油醚/甲基叔丁基醚5∶1)进一步纯化。产量：3.15g N-叔丁氧羰基保护的产物。b)消除保护基
通过用三乙酸(10ml)在二氯甲烷(50ml)中消除保护基，并转化为盐酸盐，浓缩，蒸发几次，加入乙醚中的Hcl后，接着与甲基叔丁基醚/石油醚充分搅拌。产量：2.2g。
实施例71和72L-苯丙氨酸-1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异噁唑-5-基)乙基酯盐酸盐a)消除保护基
3.0g实施例70a)的产物用三氟乙酸(类似于实施例70b)处理。产量：2.8g粗产物。b)拆分异构体
粗产物通过在1％三乙胺存在下用二氯甲烷/甲基叔丁基醚1∶10硅胶层析几次拆分为非对映异构体。产量：在各种情况下0.70.8g油状产物，下面指定为异构体A(较高Rf值)和B(较低Rf值)。由HPLC测定的纯度在各种情况下大于95％。两种异构体都如实施例70b)所述转化为盐酸盐。可以从二氯甲烷/甲基叔丁基醚结晶各种异构体。实施例71(异构体A)：〔α〕D20＝+56.1°(C＝1，乙醇溶液)实施例72(异构体B)：〔α〕D20＝-30.8°(C＝1，乙醇溶液)
实施例73L-苯丙氨酸-1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)2-异恶唑啉-5-基)乙基酯盐酸盐a)用N-叔丁氧羰基苯丙氨酸酰化
合成根据实施例70a)从3.2g(0.01mol)实施例19的产物(外消旋赤或异构体)进行。产量：3.5g N-叔丁氧羰基苯丙氨酸保护的产物。b)消除保护基
保护基类似于实施例70b)裂解。产量：2.6g异构体混合物(归结为外消旋异恶唑啉的使用)。
实施例74和75L-苯丙氨酸-1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异恶唑啉-5-基)乙基酯盐酸盐a)拆分异构体
2.5g实施例73a)的产物通过用石油醚/甲基叔丁基醚5∶1重复大干胶层析拆分为非对映异构体。产量：在各种情况下，0.6-0.7g油状产物，下面指定为异构体A(较高Rf值)和B(较低Rf值)。由HPLC测定的纯度在各种情况大于95％。b)消除保护基
两种异构体如实施例70b)所述消除保护基并转化为盐酸盐。实施例74(异构体A)：〔α〕D20＝+31.6°(C＝1，乙醇溶液)实施例75(异构体B)：〔α〕D20＝-59.7°(C＝1，乙醇溶液)
实施例76甘氨酸-1-(3-(4羟基-3，5-二叔丁基苯基)异恶唑-5-基)乙基酯盐酸盐
合成根据实施例70，从2.1g(0.012mol)N-BOC-甘氨酸和3.2g(0.01mol)实施例28的产物进行。消除保护基并转化为盐酸盐之后，从甲基叔丁基醚/石油醚得到无定形固体产物。产量：2.6g
实施例77甘氨酸-1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)乙基酯盐酸盐
合成根据实施例70，从2.1g(0.012mol)N-BOC-甘氨酸和3.2g(0.01mol)实施例19的产物(外消旋赤或异构体)进行。消除保护基并转化为盐酸盐后，从甲基叔下基醚/石油醚得到无定形固体产物。产量：2.3g。
实施例811-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)乙基十六烷酸酯(赤或异构体)
将3.2g(0.01mol)实施例19的产物溶于60ml四氢呋喃。加入125mg 4-二甲基氨基吡啶和3.05ml(0.024mol)N-乙基吗啉后，在冰冷却下滴加溶于30ml四氢呋喃中的5.5g(0.02mol)十六烷酰氯；反应完成后(用TLC监测)，将混合物用水，硫酸氢钾水溶液和水洗涤，干燥并浓缩。残留的油状物用石油醚/甲基叔丁基醚硅胶色谱纯化。产量：1.9g
实施例82二-O-乙酰基-L-酒石酸-N-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)异恶唑-5-基)甲基酰胺
4.2g(0.01mol)实施例48的产物与0.12g 4-二甲基氨基吡啶和4.5ml(0.035mol)N-乙基吗啉一起首先引入250ml四氢呋喃中，在室温和搅拌下，0.5小时内滴加溶于60ml四氢呋喃中的3.3g(0.015mol)(+)-二-O-乙酰基-L-酒石酸酐。室温下再过4小时后，加入50ml 1N Hcl，500ml水和500ml乙酸乙酯；相分离后，用水和饱和NaCl溶液洗涤后，接着干燥并浓缩。剩余物用甲基叔丁基醚硅胶层析，随后从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：4.9g：〔α〕D20＝-1.4°(C＝1，乙醇溶液)
实施例83N-〔(3-(4-羟基-3，5二叔丁基苯基)异恶唑-5-基)甲基〕-L酒石酸酰胺
将1.56g(0.03mol)实施例82的产物溶于200ml甲醇中，加入0.84g(0.06mol)磨细的碳酸钾。混合物被搅拌过夜，用柠檬酸水溶液酸化，用乙酸乙酯萃取几次。干燥并蒸发浓缩后保留的油状物被结晶。产量：1.25g：〔α〕D20＝+21.5°(C＝1，乙醇溶液)
实施例841-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)乙基3-氧代丁酸酯
在冰冷却下，1.6g实施例19的产物与约15mg 4-二甲基氨基吡啶一起溶于80ml无水四氢呋喃中，并滴加溶于15ml四氢呋喃中的0.46ml(0.006mol)双烯酮。1小时后，将冰浴拿走，混合物在室温下搅拌过夜。混合物浓缩后，剩余物在水/乙酸乙酯中处理，有机相被干燥并浓缩。之后，从甲基叔丁基醚/石油醚结晶。产量：1.05g浅黄色晶体。
实施例851-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)磷酸二苯基酯
3.2g(0.01mol)实施例19的产物与0.12g 4-二甲基氨基吡啶和1.4ml(11mmol)N-乙基吗啉一起溶于60ml无水四氢呋喃中，在室温滴加溶于10ml四氢呋喃中的2.95g(11mmol)氯化磷酸二苯基酯。4小时后，加入柠檬酸水溶液和乙酸乙酯，有机相被干燥并浓缩，剩余物被结晶。产量：4.7g晶状产物。
实施例86和871-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)乙基4-(4-吗啉代)甲基苯甲酸酯盐酸盐，86：赤式和87：苏式异构体a)4-氯甲基苯甲酰基丁-3-烯-2-基酯
7.2 g(0.1mol)外消旋1-丁烯-3-醇与20.5g(0.108mol)4-氯甲基苯甲酰氯，14g(0.11mol)N-乙基吗啉和1.2g 4-二甲基氨基吡啶一起在200ml无水四氢呋喃中搅拌24小时。加入二氯甲烷和柠檬酸水溶液后，相分离，有机相用水洗，干燥并浓缩。用石油醚浸提，小星沉淀的固体通过过滤除去。浓缩后，产物被分离为油状物。b)反应类似于实施例1)，从7.5g(0.03mol)醛肟和7.6g(0.034mol)实施例86a)的产物进行。开始为油状物的粗产物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯9∶1)进一步纯化。产量：3.7g外消旋赤式/苏式异构体混合物。c)与吗啉反应
将3.6g(7.6mmol)b)的产物溶于丙酮，加入1.3ml(0.015mol)吗啉和0.27g(1.6mmol)碘化钾，混合物在室温搅拌2天。浓缩后，残余物溶于水/乙酸乙酯中，有机相用水洗，干燥并浓缩。4g产物保持为非对映异构体混合物(异构体比约为60∶40)。d)异构体拆分
将c)的粗产物溶于约200ml甲基叔丁基醚中，并加入8ml 5摩尔乙醇性盐酸和约30ml二氯甲烷。沉淀的盐酸盐被分离并从异丙醇结晶，赤式非对映异构体首先结晶出来；此非对映异构体然后通过从异丙醇再结晶富集为非对映异构体比＞95∶5。产量：0.75g。
也可以通过重复结晶从聚集的母液分离为苏式非对映异构体。
实施例88L-酪氨酸基1-(3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-2-异噁唑啉-5-基)乙基酯，外消旋5，5’-赤式异构体混合物a)用N，O-二叔丁氧羰基-L-酪氨酸酰化
将7.6g(0.02mol)N，O-二叔丁氧羰基-L-酪氨酸溶于100ml无水四氢呋喃，加入2.7g(0.02mol)1-羟基苯并三唑和4.5g(0.022mol)二环己基碳二亚胺；混合物然后搅拌约45分钟，沉淀的脲过滤除去。加入2.3ml(0.018mol)N-乙基吗啉和0.24g(0.002mol)二甲基氨基吡啶后，滴加溶于80ml四氢呋喃中的4.8g(0.015mol)实施例19的产物。混合物室温搅拌24小时后，通过加入乙酸乙酯处理，用0.1N NaOH和0.1N HCl和饱和NaCl溶液洗涤，干燥并浓缩。粗产物用硅胶色谱(甲基叔丁基醚/石油醚)进一步纯化。产量：10.5N-叔丁氧羰基保护的产物油状物。b)消除保护基
类似于实施例70b)消除保护基。碱被释放后，通过硅胶色谱(甲基叔丁基醚/二氯甲烷/甲醇，10∶9∶1)进一步纯化。产量：1.6g无定形固体。
实施例893-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-5-(1，2-二羟基乙基)-2-并噁唑啉，外消旋赤式异构体
将2.9g实施例16的产物溶于50ml二恶烷和10ml水中，然后加入0.75ml 70％高氯酸水溶液，混合物在室温搅拌18小时。加入20ml 5％碳酸钠水溶液和150ml水后，混合物用乙酸乙酯重复萃取，有机相被洗涤，干燥并浓缩。通过从甲基叔丁基醚/石油醚结晶以纯的形式得到产物。产量：1.3g。
实施例903-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-5-(1，2-二羟基乙基)-2-异噁唑啉，外消旋苏式异构体
类似于实施例89，从2.4g实施例17的产物完成。产量：1.25g晶状产物。
实施例91 1-(3-(4-羟基-3，5-二叔丁基苯基)-2-异恶唑啉-5-基)乙基4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基苯甲酸酯二氢溴酸盐，赤式异构体)
类似于实施例86完成。非对映异构体在步骤b)通过分级结晶富集。在步骤c)，N-甲基哌嗪被用于代替吗啉。氢溴酸盐沉淀后，在步骤d)的异构体富集＞95％。产量：1.9g赤式产物，从4.7g步骤b)产物得到。表1药理试验
为了表征其有价值的抗炎，抗气喘和免疫调节性质，和高耐量程度，式I化合物在下列实验性试验中被检验，这些试验被认为特别适于评估这类具有抗风温活性的化合物作用的质量。
从人的外周血分离多晶核白细胞(PMNL)以进行试验1和2，10ml人血用10ml HBSS(Serva)稀释，并用15mlLymphoprep(Dr，Molter GmbH，Heidelburg)铺垫。样品然后在400×g(每分钟1600转，Minifuge 2，Heraeus，Osterode)离心分离25分钟。这导致了形成三相：最上层由血浆和血小板组成，中间相是Lymphoprep。由单核细胞组成的白色环存在于两相之间。最下层相由红细胞组成，它被一PMNL白色层覆盖。最上层相，以及Lymphoprep和白色环用注射器小心地除去。保留的沉积物被小心地再分散于15ml在PM16(mw：485000，Sigma，Deisenhofen)中的3％葡聚糖中。悬浮液然后在室温放置1小时。在此期间，红细胞沉积下来而PMNL保留在上层清液中。除去上层清液，用约等体积的PM16稀释，在400×g离心分离15分钟。如果PMNL沉积物被细胞严重沾污，则需要进行低渗溶解。为此，沉积物再悬浮于750μl水中。恰好15秒之后，悬浮液用约7ml PM16稀释，在400×g离心分离10分钟。如果需要，这一溶解再重复一次。按另一方法，将PMNL沉积物再悬浮于合适介质中。试验1，释放解蛋白活性
250μl PMNL(5·106个细胞/ml含7.5mM葡萄糖的PBS)在37℃与1μl试验物质培养20分钟。然后加入1μl细胞松驰素B(5μg/ml试验混合物)、混合物在37℃再培养5分钟。加入1μl组织坏死因子α(TNF，30ng/ml试验混合物)之后，继续培养5分钟。释放用1μl fMLP(10nmol/l试验混合物)开始。在37℃60分钟之后，反应通过将样品冷却至低于0℃而终止。然后将样品离心分离，上层清液被除去并冷冻。细胞松弛素B和fMLP被溶于DMSO，而TNF用缓冲液稀释。50μl上层清液与175μl缓冲溶液(100nM HEPES，pH7.5；500mM NaCl)在96-孔微量滴定板中混合。加入25μl底物(甲氧基丁二酰基-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-对硝基苯胺)，在0，5，10，15，30和60分钟后，在405nm测量各孔的消光。试验2，氧基的释放
PMNL被再悬浮(5·106个细胞/ml)于Dulbecco’s PBS中，补充7.5mM葡糖。应小心地确保PMNL不含红细胞。100μlPMNL，700μl PBS＋葡糖和100μl细胞色素C(9.38mg/ml PBS＋葡糖)在半微池中混合。100μl PMNL，500μlPBS＋葡糖，100μl细胞松弛素B(1·106mol)，100μlTNF(0.05ng)和100μl细胞色素C(9.38mg/ml PBS＋葡糖)被混合用于fMLP-诱导的氧释放。在双光束光度计(Perkin-Blmer552S)中在550nm波长测量。测量范围为0-1消光单位。小池被温度平衡至37℃。参考小池还含10μl SOD(6mg SOD/ml PBS＋葡糖)。预培养5分钟后，反应用100μl诱导剂开始。反应用1·10-7molfMLP开始。试验3，由白血细胞形成LTB4
白血细胞的分离：
40ml人血与8ml6％葡聚糖溶液(葡聚糖mw：480000在PM16中)混合。室温下1小时后，由白血细胞组成的上层清液被除去，用等体积PM16稀释，在300×g(1600rpm)离心分离15分钟。沉积物随后再悬浮于约5-6ml PM16中，当细胞数在CoulterCounter中测定后，调节至107个细胞/ml。
试验混合物包含0.24ml细胞悬浮液，0.03ml 20mM CaCl2/5m MgCl2和5μl试验物质。在37℃预培养15分钟后，反应用0.03ml A23187/谷胱甘肽(100μg A23187/ml；15.4μg谷胱甘肽/ml)开始。在37℃下培养5分钟之后立即将样品冷至0℃以下而终止。在Eppendorf Centrifuge(0℃)离心分离2分钟后，上层清液被除去并色谱检验。高压液相色谱(HPLC)：HPLC仪包含Kratos泵(Spectro-flow400)，具有75μl样品环的冷却的自动BT7041样品注射器(Biotronik)，Nucleosil C18柱(100*3mm，5μm Chrompack颗粒)，UV检测器(Kratos)Spectroflow 757(波长：280nm，测量范围：0.1AUFS，时间常数：0.5S)和Spectra Physics积分仪(SP4270)。洗脱剂(725ml甲醇，275ml水和0.1ml乙酸)以0.7ml/分钟的流速应用，压力约100bar。
注：在开始实际测量之前，测量另外的对照样品已被发现是有用的。操作时，已被设定的测量范围可被检查和改变，如果需要的话。在细胞培养之前在特定试验浓度(例如：10-5M)在PM16中测量试验物质是极其重要的，因为试验物质可能隐藏LTB4峰。如果这是事实，必须选择更低的浓度。试验4，刺激细胞因子释放
从人血分离单核细胞
用1ml3.8％柠檬酸钠溶液稳定化的10ml人血用10ml PM16(Seva，Heichelberg)稀释并用15ml Lymphoprep(Dr.MolterGmbH，Heidelberg)铺垫。样品在室温下在400×g(1600rpm，Minifuge 2，Heraeus，Osterode)离心分离40分钟。单核细胞在Lymphoprep/血浆界面可见为白色环状物。此环状物用注射器小心地取出，用等体积的PM16稀释，在400×g离心分离10分钟。沉积物用约10ml RPMI1640(＋300mg/l L-谷酰胺，Gibco，Eggenstein)(Wallis，1986)洗涤。将细胞再悬浮于约1ml RPMI1640(＋300mg/l L-谷酰胺＋25mM HEPES＋100μg/ml链霉素＋100μg/ml青霉素)之后，细胞密度用Coulter Counter JT(Coulter Diagnostics)测定并调至5*106个/ml。典型地，细胞由90％淋巴细胞和10％单核细胞组成。
230μl单核细胞在37℃；5％CO2，用10μl试验物质(10μMDMSO/水，1/10)和10μl脂多糖(LPS；在开始试验之前500μg溶于1ml DMSO中并用水稀释1/10；购自Salmonella abortus equi，Sigma，Deisonhofen)培养20-22小时(在IL-6的情况下5小时)。样品在冰浴中冷至0℃，在Sigma离心机(2分钟；2000rpm)上离心分离。上层清液的等分试样用Elisa(Biermann，Bad Nauheim)测定。缩写IL代表白细胞介素而TNF代表肿瘤坏死因子α。试验5环氧化酶-依赖的血小板聚集
富血小板血浆(PRP)：为了抑制血凝固，人血用其体积1/10的3.8％柠檬酸钠溶液处理。然后在105×g离心分离20分钟，然后上层清液(PRP)被除去。200μlPRP在37℃，与30μl试验物质在PAP4聚集计(BioData)中预培养10分钟。试验物质溶于有机溶剂并用缓冲溶液(50mM TisHCl，pH8.0；90mM NaCl)稀释。聚集用20μl诱导剂引发。在聚集期间，以800rpm搅拌。二十碳四烯酸(5mg/ml)用作诱导剂。
试验1至3的结果概括在表2中。表中的值显示单位为μm的试验物质浓度，除此之外，残留活性以基于被定为100％的对照为基础的百分数测量。白细胞介素另在试验4中指明。
表2实施例 试验1 试验2 试验3 试验4 试验5 1 10μM 92 10μM 93 3 100μM 98 5 100μM 98 7 100μM 95 8 10μM 15 1μM 93 100μM 91 9 100μM64 10μM 0 1μM 59 IL-1 10μM 73 IL-6 10μM 93 TNFα 10μM 63 100μM 92 10 10μM 20 1μM 89 TNFα 10μM 78 100μM 98 13 100μM20 10μM77 25μM22 10μM65 10μM 98 14 10μM 100 18 IL-1α 100μM 36 10μM 89 19 100μM20 10μM78 10μM94 10μM 100 20 10μM 100 24 IL-1 10μM 86 10μM 94 25 10μM 29 1μM 85 IL-1∝ 10μM 62 ILβ 10μM 93 TNFα 10μM 82 10μM 86 26 TNFα 10μM 88 10μM 94 27 100μM 97 实施例试验1试验2 试验3 试验4 试验5 28 10μM 59 1μM 97 25μM 8 10μM 60 10μM 0 1μM 14 IL-1α 10μM 93 10μM 93 31 100μM 100 32 100μM 34 10μM 72 1μM 84 34 100μM 98 35 IL-1α 10μM 84 100μM 94 36 10μM 93 100μM 87 38 IL-1α 1μM 89 IL-1β 1μM 85 100μM 90 39 100μM 98 41 100μM 78 50μM 36 5μM 75 10μM 13 TNFα 10μM 89 100μM 95 43 10μM 93 100μM 99 44 10μM 99 45 100μM 98 46 IL-1α 1μM 77 IL-1β 1μM 85 TNFα 10μM 79 100μM 90 47 100μM 17 10μM 38 1μM 85 IL-1α 10μM 72 1μM 89 TNFα 10μM 64 49 100μM 19 10μM 23 1μM 88 50μM 12 5μM 80 10μM 0 1μM 90 IL-6 1μM 91 TNFα 10μM 91实施例 试验1 试验2 试验3 试验4 试验5 57 100μM 99 58 100μM 99 59 100μM 35 10μM 61 1μM 91 10μM 48 1μM 135 60 10μM 88 61 100μM 80 10μM 3 IL-1α 1μM 94 TNFα 10μM 68 100μM 94 63 100μM 66 10μM 88 50μM 79 10μM 91 IL-1α 10μM 75 IL-1β 10μM 77 64 100μM 72 10μM 96 IL-1 10μM 68 1μM 85 IL-1 10μM 82 100μM 97 70 10μM 22 71 10μM 42 1μM 79 25μM 97 72 10μM 51 1μM 82 25μM 100 73 10μM 9 1μM 100 25μM 100 74 10μM 64 25μM 95 75 10μM 49 1μM 89 25μM 98 76 100μM 9 10μM 68 25μM 99 77 100μM 30 10μM 74 25μM 100 78 50μM 94 79 100μM 96实施例试验1试验2试验3试验4试验5 80 50μM 97 81 100μM 100 82 100μM 93 85 100μM 94
该表用实施例9)解释：
64％解蛋白活性(试验1)在加入100μl抑制物质实施例9)之后稀释。没有抑制物质时，相应于100％解蛋白活性可被释放。
结果：根据本发明的化合物作为炎症抑制剂是活性的，因为它们在人体白细胞体系中作为解蛋白活性(试验1)和活性氧(试验2)的释放，以及白细胞三烯B4合成(试验3)的抑制剂显示可感受到的生物活性。在人体系中各种细胞因子从单核细胞(试验4)的释放也被抑制。尤其是，化合物对环氧化酶-依赖的人血小板体系(试验5)没有抑制作用。因此，可预计不会产生可归固于环氧化酶抑制的不希望的副作用(延长出血时间，胃肠溃疡和肾毒性)。
试验6：在辅助剂/关节炎模型中的抗关节炎试验
Wistar-Lewis系雄性大鼠(M0llegaard/Denmark)被用作试验动物。体重在160g至200g之间。将0.1ml Freund’s辅助剂(＝每ml重白石腊油Merch，Darmstadt 6mg乳酪分支杆菌悬浮液，Difco Lab./Detroit，Mich.USA)Subplantar注射到尾巴根部，在实验的第10至14天，导致免疫病理过程和慢性炎症，特别是关节炎和关节周炎病症形式，在身体的其它部位(继发性损伤)。动物用购自Altrogge，Lage的标准食物Altromin-R随意喂养，并供给自来水。从实验的第14天至实验结束，动物被每kg给予作为止痛剂的60mg可德因。从辅助剂给药的那天开始，每天(共17天)将试验物质以CMC悬浮液，以注射体积1ml/100g体重口服给药。在实验的第一天和第18天，每只后爪的体积，和体重被测量。与未处理的对照组比较，爪体积增加方面的缩减作为活性标准，两只爪被平均。结果被概括于表3中。
试验8：抑制肿瘤细胞增殖
肿瘤细胞系20-10-5S(杂交瘤细胞系，由ATCC(美国典型培养物保藏)提供，它产生抗鼠T细胞抗体)被用于测定试验物质的抗增生性质。细胞在37℃和5％CO2，在无血清的条件下在GC介质(细胞生长介质＝IScove－ATL(＋清蛋白＋铁传递蛋白＋类脂)；购自Vitromex，Vilshofen)中培养。只有对数生长期的细胞被用于试验混合物。试验物质以各种浓度(从1至50μm)，与4×10320－10－5S细胞一起吸入圆底微滴板(介质总体积200μl)。培养48小时应(37℃和5％CO2)，25μl氚标记的胸苷(＝0.25μCi/试验混合物，比活性，23Ci/mM)被加入板中。在随后的16小时期间，放射活性标记的胸苷被掺入生长细胞的DNA中。样品在玻璃纤维滤膜上吸滤滤出，且掺入的放射活性用β计数器(购自Wallac的Beta Plate System 1205)测量。以掺入的放射活性为基础，IC50值(50％抑制浓度)与正对照(没有试验物质的试验混合物)相比被计算，并被概括于表3中。
表3 实施例 试验6 试验6 试验7 试验8 剂量 (mg/kg) 爪体积 (％ 抑制) ED50 (mg/kg) IC50 (μM) 1 50 70 10-50i.d. 5-10 3 10 4 30 5 ＜10i.d. 6 约50i.d. 7 10-30i.d. 8 50 67 约10i.d. ＜5 9 约50i.d. 11 ＜5 12 50 82 10 13 50 84 约50i.d. 6.10 14 10-50i.d. 15 50 60 8-15 16 30 17 8-15 18 5-10 19 25 85 ＜5 20 25 67 约50i.d. ＜5 22 50 74 24 50 43 ＜5 25 50 44 3-10i.d. ＜5 26 ＜5 27 50 71 ＜5 28 50 74 ＜5 29 ＜5 30 50 63 5-10实施例 试验6 试验6 试验7 试验8 剂量 (mg/kg) 爪体积 (％抑制) KD50 (mg/kg) IC50 (μM) 33 ＜5 37 ＜5 39 30 40 1-3i.d. ＜5 41 ＜5 42 5-10 44 5-10 45 5-10 47 10-50i.d. 5-10 48 50 60 10-50i.d. 5-10 49 约50i.d. 5-10 52 3-10i.d. ＜5 53 25 48 10-50i.d. 8-10 54 1-3i.d. 5-10 55 50 47 ＜5 56 约50i.d. 57 ＜5 59 1-3i.d. 30 66 25 59 ＜5 67 50 53 ＜5 69 50 83 5-10 70 25 59 5 71 25 66 5-10 72 25 60 5-10 73 50 73 74 25 60 5-10 75 25 76 5-10实施例 试验6 试验6 试验7 试验8 剂量 (mg/kg) 爪体积 (％抑制) ED50 (mg/kg) IC50 (μM) 76 50 70 20 77 50 82 20 78 5-10 79 5-10 80 5-10 81 50 67 83 50 39 84 25 49 85 ＜5 86 20 70 ＜5 87 20 50 ＜5 88 10 89 50 36 20 90 50 36 30
＜意指小于