烟草原生质体的高效分离、转化和再生体系.pdf

1.  一种用于烟草原生质体的高效分离、转化和再生过程中的试剂组合，其特征在于，包括1/2MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基、MS培养基、MS再生培养基、W5洗液、转化液、含有聚乙二醇的溶液、酶解液、W5洗液和C:B培养基；
所述1/2MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基、MS培养基和MS再生培养基的物质组成包括如下试剂：

其中所述MS微量100×的物质组成如下：

成份终浓度mg/LCoCl₂·6H₂O2.5KI83MnSO₄·H₂O1690H₃BO₃620CuSO₄·5H₂O2.5
Na₂MoO₄·2H₂O25ZnSO₄·7H₂O860
所述铁盐1000×的物质组成如下：
成份终浓度mg/LFeNaEDTA36700
所述W5洗液的组成包括氯化钠8.9g/L、氯化钙18.4g/L、氯化钾0.37g/L，葡萄糖0.9g/L；
所述转化液的组成包括甘露醇91g/L，氯化镁14.25g/L，乙磺酸1g/L；
所述含有聚乙二醇溶液的组成包括聚乙二醇400g/L，甘露醇72.9g/L，硝酸钙16.4g/L。

2.  根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述酶解液的组成包括在所述C培养基中添加终浓度为120g/L的纤维素酶R10和60g/L的离析酶R10。

3.  根据权利要求1或2所述的试剂组合，其特征在于，所述Evans Blue染液的组成包括在所述W5培养基中添加2.5g/L的Evans Blue粉末。

4.  根据权利要求1或3所述的试剂组合，其特征在于，所述C:B培养基的组成包括在所述C培养基和B培养基按1：1组成的混合液中添加6g/L的海斑琼脂糖的。

5.  根据权利要求1或4所述的试剂组合，其特征在于，所述W5洗液的pH为5.8～6.0；所述转化液的pH为5.6；所述含有聚乙二醇的溶液的pH为8.0，所述酶解液的pH为5.6。

6.  一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂组合对烟草原生质体进行分离、转化和再生的方法。

7.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)无菌苗的培养
将表面消毒后的烟草种子播种于1/2MS培养基中，待苗生长至五叶期时，转移至MS培养基中继续进行培养6周，得长出幼嫩叶片的烟草无菌苗；
2)原生质体的分离和纯化
取所述烟草无菌苗的幼嫩叶片，切成小块浸于所述酶解液中，将酶解体系密封、避光，在24℃～26℃温度下静置9～14h；
对酶解后的混合物过滤，收集滤液，用所述C培养基对滤渣进行再次溶解、过滤，收集滤液，重复此项操作直至不再有原生质体析出，将所得滤液混合，得混合滤液；
在所述混合滤液中加入蔗糖溶液，离心，吸取原生质体层；
在所述原生质体层中加入所述W5洗液，混合均匀后离心，离心后的沉淀物即为原生质体；
3)原生质体的转化
将质粒DNA消毒后溶解于超纯无菌水中，形成质粒DNA体系，将所述原生质体溶解于所述转化液中，形成原生质体悬浮液1，将二者混合，并在混合后的体系中加入所述含有聚乙二醇的溶液，室温下静置10～20min；
在所述混合后的体系中加入所述W5溶液，混匀后离心，沉淀物即为转化后的原生质体；
4)原生质体的培养、转化系的筛选及再生
将所述转化后的原生质体溶于所述C培养基，制成原生质体悬浮液2，与所述C:B培养基混合，然后对原生质体细胞进行培养至出现多次细胞分裂；
将所述细胞分裂后的原生质体转入添加了抗生素的所述A培养基中，出现愈伤组织5～6周后，转移到所述MS再生培养基上，所述愈伤组织生长至8～10mm时，再次将其转移到所述MS再生培养基上，长出丛生芽，至所述丛生芽生长1～2周后，将其切下再 次置于MS再生培养基上，待幼芽长至3～4cm时，其转移到MS培养基上，诱导生根，移栽进行壮苗培养，得到烟草植株。

8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中原生质体细胞在所述C:B培养基中的培养条件为在22～25℃黑暗条件下培养22～26h，再移至暗光下培养5d～7d，优选为24℃黑暗条件下培养24h，再移至暗光下培养6d。

9.  根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述添加了抗生素的A培养基中的培养条件为22～26℃暗光条件下，60～100rpm摇动培养，优选为24℃暗光条件下80rpm摇动培养；
所述愈伤组织或芽在所述MS再生培养基中的培养条件为22～26℃暗光培养，优选为24℃暗光培养；
所述幼芽在所述MS培养基上的培养条件为22～26℃暗光培养，优选为24℃暗光培养。

10.  权利要求5～9任一项所述的方法在本生烟和栽培烟草中的红花大金元、K326、云87、CB-1原生质体分离、转化和再生方面的应用。

烟草原生质体的高效分离、转化和再生体系
技术领域
本发明涉及转基因工程领域，具体涉及一种烟草原生质体的高效分离、转化和再生体系。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)是我国重要经济作物。2014年烟草行业工商税利达到10517.6亿元，占全部税利的10％以上。近年来大众对烟叶品质及安全性的需求日益提高，因而加快品种选育是满足这一需求的重要途径之一。同时，烟草是植物转基因的优良受体和细胞遗传学的模式植物，常被用来开展外源基因的表达和功能验证。另外，在生物工程领域常被用作植物生物反应器，有效表达一些有实用价值的蛋白。
植物原生质体是指脱去全部细胞壁的，由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。它具有细胞生命特征和全能型，是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源；是细胞融合工作的基础；是细胞功能学研究的重要手段；是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。1971年Nagata和Takebe首次获得了烟草叶肉原生质体离体培养再生植株。随后Firoozabady和我国学者徐杏阳、黄文川也利用栽培烟草的叶肉细胞获得了再生植株。但原生质体分离和转化仍存在步骤繁杂、操作不规范、污染率高、转化效率低且不稳定等需要改进的地方。
发明内容
针对现有技术中烟草的原生质体的分离和转化存在步骤繁杂、操作不规范、污染率高、转化效率低的缺陷，本发明提供一种烟草原生 质体的分离、转化和再生体系。本发明的第一个目的是提供一种烟草原生质体分离、转化和再生过程中所需的试剂组合，包括1/2MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基、MS培养基、MS再生培养基、W5洗液、转化液、含有聚乙二醇的溶液、酶解液、W5洗液和C:B培养基；
所述1/2MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基、MS培养基和MS再生培养基的物质组成包括如下试剂：


其中所述MS微量100×的物质组成如下：

成份终浓度mg/LCoCl₂·6H₂O2.5KI83MnSO₄·H₂O1690H₃BO₃620CuSO₄·5H₂O2.5
Na₂MoO₄·2H₂O25ZnSO₄·7H₂O860
所述铁盐1000×的物质组成如下：
成份终浓度mg/LFeNaEDTA36700
所述W5洗液的组成包括氯化钠8.9g/L、氯化钙18.4g/L、氯化钾0.37g/L，葡萄糖0.9g/L；
所述转化液的组成包括甘露醇91g/L，氯化镁14.25g/L，乙磺酸1g/L；
所述含有聚乙二醇溶液的组成包括聚乙二醇(PEG)400g/L，甘露醇72.9g/L，硝酸钙16.4g/L。
本发明所述的试剂组合，所述酶解液的组成包括在所述C培养基中添加终浓度为120g/L的纤维素酶R10和60g/L的离析酶R10；
本发明所述的试剂组合，所述Evans Blue染液的组成包括在所述W5培养基中添加2.5g/L的Evans Blue粉末；
本发明所述的试剂组合，所述C:B培养基的组成包括在所述C培养基和B培养基按1：1组成的混合液中添加6g/L的海斑琼脂糖。
本发明中，所述W5洗液的pH为5.8～6.0；所述转化液的pH为5.6；所述PEG溶液的pH为8.0，所述酶解液的pH为5.6。
本发明的另一目的是提供一种利用本发明所述的试剂组合对烟草原生质体进行分离、转化和再生的方法。
运用本发明所述的试剂对烟草原生质体进行分离、转化和再生的方法优选步骤如下：
1)无菌苗的培养
将表面消毒后的烟草种子播种于1/2MS培养基中，待苗生长至五叶期时，转移至MS培养基中继续进行培养6周，得长出幼嫩叶片的烟草无菌苗。
2)原生质体的分离和纯化
取所述烟草无菌苗的幼嫩叶片，切成小块浸于所述酶解液中，将酶解体系密封、避光，在24℃～26℃温度下静置9～14h；
对酶解后的混合物过滤，收集滤液，用所述C培养基对滤渣进行再次溶解、过滤，收集滤液，重复此项操作直至不再有原生质体析出，将所得滤液混合，得混合滤液；
在所述混合滤液中加入蔗糖溶液，离心，吸取原生质体层；
在所述原生质体层中加入所述W5洗液，混合均匀后离心，离心后的沉淀物即为原生质体；
3)原生质体的转化
将质粒DNA消毒后溶解于超纯无菌水中，形成质粒DNA体系，将所述原生质体溶解于所述转化液中，形成原生质体悬浮液1，将二者混合，并在混合后的体系中加入所述含有聚乙二醇的溶液，室温下静置10～20min；
在所述混合后的体系中加入所述W5溶液，混匀后离心，沉淀物即为转化后的原生质体；
4)原生质体的培养、转化系的筛选及再生
将所述转化后的原生质体溶于所述C培养基，制成原生质体悬浮液2，与所述C:B培养基混合，然后对原生质体细胞进行培养至出现多次细胞分裂；
将所述细胞分裂后的原生质体转入添加了抗生素的所述A培养基中，出现愈伤组织5～6周后，转移到所述MS再生培养基上，所述愈伤组织生长至8～10mm时，再次将其转移到所述MS再生培养基上，长出丛生芽，至所述丛生芽生长1～2周后，将其切下再次置于MS再生培养基上，待幼芽长至3～4cm时，其转移到MS培养基上，诱导生根，移栽进行壮苗培养，得到烟草植株。
本发明中，所述步骤2)中过滤操作中使用孔径为100μm的滤膜。
本发明中，所述蔗糖溶液的浓度为22％。
本发明中，所述步骤4)中原生质体细胞在所述C:B培养基中的培养条件为在22～25℃黑暗条件下培养22～26h，再移至暗光下培养5d～7d，优选为24℃黑暗条件下培养24h，再移至暗光下培养6d。
本发明中在所述添加了抗生素的A培养基中的培养条件为22～26℃暗光条件下，60～100rpm摇动培养，优选为24℃暗光条件下80rpm摇动培养。
所述愈伤组织或芽在所述MS再生培养基中的培养条件为22～26℃暗光培养，优选为24℃暗光培养。
所述幼芽在所述MS培养基上的培养条件为22～26℃暗光培养，优选为24℃暗光培养。
本发明中所述各种试剂的用量均根据实际情况的需要而确定。
本发明所述的培养体系适用于烟草所有品种的原生质体的分离、转化和再生，优选为本生烟(Nicotiana Benthamiana)和栽培烟草(Nicotiana tabacum)中的红花大金元、K326、云87、CB-1。
有益效果
本发明公开了一种烟草(Nicotiana tabacum L.)原生质体的分离、转化和再生体系及专用培养基。本发明以42天的烟草无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R-10和离析酶R-10，对烟草叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入烟草原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出了大量烟草转基因植株。
本发明一方面可分离出大量高纯度的原生质体，另一方面能将质粒DNA成功高效地转入原生质体中，同时原生质体可成功被培养成又能获得大量高表达的转基因植株。
本发明可为亚细胞定位、启动子表达等功能基因组学研究以及植物体细胞融合、遗传转化、基因组编辑等品种改良提供了可能。本发 明成功了应用在了中国主栽烟草品种上，为烟草品种的改良和遗传学研究做了初步探索。
附图说明
图1为进行多次细胞分裂后的原生质体
图2为第一次由原生质体形成的愈伤组织
图3为生长为健康植株的烟草植株
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一、制备原生质体分离、转化和再生的母液和培养基
表1 MS微量100×配方
成份终浓度mg/L500mL母液(g)CoCl₂·6H₂O2.50.00125KI830.0415MnSO₄·H₂O16900.845H₃BO₃6200.31CuSO₄·5H₂O2.50.00125Na₂MoO₄·2H₂O250.0125ZnSO₄·7H₂O8600.43
表2 铁盐1000×配方
成份终浓度mg/L500mL母液(g)FeNaEDTA3670018.35
表3 培养基配方



酶解液：每100mL C培养基中添加纤维素酶R101.2g，离析酶R100.6g，用1M KOH调pH至5.6，过滤灭菌，分装后保存于-20℃条件下。
W5洗液：取氯化钠8.9g，氯化钙18.4g，氯化钾0.37g，葡萄糖0.9g，加水定容至1L，用1M KOH调pH至5.8-6.0，121℃高压灭菌20min。
Evans Blue染液：将0.25g的Evans Blue粉末溶解于100mL W5洗液中，过滤灭菌。
转化液：取甘露醇9.1g，氯化镁1.425g，乙磺酸0.1g，加水定容至100mL，用1M KOH调pH至5.6，过滤灭菌。
含有聚乙二醇(PEG)的溶液：将40g的PEG溶解到100mL添加了7.29g甘露醇、1.64g硝酸钙的液体中，用1M KOH调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，分装后保存于-20℃条件下。
C:B培养基：将0.6g的海斑琼脂糖加入至100mL C和B按1：1比例的混合溶液中，微波炉高火加热5s，至琼脂糖溶解完全。
二、烟草原生质体的分离、转化和再生
1、无菌苗的培养
先用体积百分比0.05％Tween20和10％过氧化氢的混合溶液对栽培烟草(Nicotiana tabacum)中的红花大金元的种子表面消毒10min，再用无菌水冲洗5次。然后点播于盛有1/2MS培养基的90mm×15mm的培养皿中(每皿30粒)。
待种子发芽后长至5叶期时，选取叶片健壮无污染的幼苗移栽至盛有MS培养基的10cm(上口)×7cm(下口)×10cm的方形培养盒中(每盒两株)，24℃、光周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为150μmol/m2/s条件下培养6周。
2、原生质体的分离和纯化
2.1 6周后，取2-4片幼嫩叶片，浸于酶解液中，去除主叶脉，切成8-12mm²方形，继续添加15mL酶解液，培养皿用封口膜封口并用铝箔包裹，于25℃静置过夜(以12小时为最佳)。
2.2 轻柔晃动培养皿使原生质体充分释放到出来，用100μm的滤膜过滤酶解后的混合物，收集滤液，用巴斯德吸管将滤膜上的残留物小心吸入到培养皿中，添加5mLC培养基，再次晃动培养皿以清洗酶解物，再次通过滤膜过滤直至不再有原生质体析出，并将所得滤液混合。
2.3 将所述混合滤液分装到14mL圆底离心管中并缓缓加入1mL的22％的蔗糖水溶液，于400r/min离心5min，待溶液分层后，用巴斯德吸管将中间绿色的原生质体层吸出并转移至新的14ml离心管中。
2.4 在离心管中加入10mL W5洗液，侧向轻柔来回晃动离心管使原生质体混匀，于400r/min离心5min。
2.5 移除上清液，加入5-10mL W5洗液，相同方式混匀并放置在冰上待用。
2.6 稀释10倍后，取5μL滴加至血细胞计数板上，同时滴加5μL0.25％Evans Blue染液，室温下静置5min后，于显微镜下计数未染 色的活细胞率以及计数总原生质体数以求得的产量。
3、原生质体的转化
3.1 质粒DNA(pVec8-GFP：35S-hpt-Nos+Ubi-gfp-Nos)在无水乙醇中析出并消毒后，用无菌超纯水溶解至终浓度最低为0.7μg/μL。
3.2 原生质体计数完成后，于400r/min离心5min，去除上清液，按比例加入转化液，使重悬原生质体得浓度达到1.5×10⁶个/mL。
3.3 向新的14mL离心管中加入300μL(原生质体数为5×10⁵)原生质体悬浮液，加入30μL质粒DNA，边旋转离心管边缓慢从管壁四周加入300μL含有PEG的溶液，测向轻柔来回晃动离心管使之充分混匀，室温条件下静止15min，每隔3min晃动一次。
3.4 按照1mL、2mL、3mL的次序分别向离心管中W5溶液，每次间隔2min并充分混匀，于400r/min离心5min。
3.5 最后加入6mL W5溶液充分混匀，于400r/min离心5min。
3.6 瞬时表达实验中，移除上清液，加入2.5mL C培养基重悬后，于25℃黑暗条件下培养24h后观察。超过80％的原生质体呈现蓝色。
3.7 在稳定表达实验中，将原生质体重悬于0.5mL C培养基中，具体过程如步骤4。
4、原生质体的培养、转化系的筛选及再生
4.1 向60mm×8mm的培养皿中加入0.5mL原生质体悬浮液(原生质体数为5×10⁵)，再加入4.5mL提前预热、45℃左右的C:B培养基，充分混匀使之恰好平铺于培养皿中。待培养基冷却固化后，将培养皿封口并置于24℃黑暗条件下培养24h，再转移到暗光条件下培养6d。培养过程中可以观察到第一次和随后多次细胞分裂(如图1)。
4.2 将带有分裂原生质体的琼脂块转移到250mL培养皿中，加 入20mL添加了25mg/L潮霉素的A培养基。24℃暗光条件下80rpm摇动培养；
4.3 3-4周后，第一次可见由原生质体诱导形成的愈伤组织(如图2)。再5-6周后，将愈伤组织转移到MS再生培养基上，24℃暗光条件下培养1-2周，在此期间愈伤组织在不断增大。当愈伤组织达到8-10mm时，将其转移到新的MS再生培养基上继续培养，获得抗性愈伤组织。1-2周后，诱导愈伤组织形成丛生的芽。1-2个周后，将生长正常的芽从愈伤组织上切下并置于MS再生培养基上，24℃暗光条件下培养；
4.4 待幼芽生长至3-4cm时，将其转移到MS培养基上，24℃暗光条件下培养。1-3周后，诱导芽生根。待生根的抗性烟草地上部分长至10cm左右且诱导出2条以上强壮根系时，移栽至12×12cm的花盆中，于光照强度500μmol/m2/s、光周期16/8h、苗期昼夜温度为20/15℃、孕穗及灌浆期昼夜温度为30/20℃的生长室中壮苗扩繁，长成健壮植株(如图3)。
实施例2
用本生烟(Nicotiana Benthamiana)和栽培烟草(Nicotiana tabacum)中的红花大金元、K326、云87、CB-1等品种，按实施例1中的方法进行培养，均获得了烟草转基因植株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。