一种肝素钠及其制备方法 所属技术领域
本发明涉及生物药品技术领域，特别是一种肝素钠生物药品及其它的制备方法。
背景技术
肝素是一种天然抗凝血药物，具有抗凝血和防止血栓形成的作用，对肾病患者的渗血、急性心肌梗塞、输血时预防血液凝固等方面的临床价值极高。近年肝素在治疗脑血管疾病、爆发性流脑败血疹等疾病均有极好的疗效。然而，这种肝素广泛分布于动物器官的组织中，如肠粘膜，十二指肠，肺、肝、胰脏、胎盘和血液中。肝素和大多数粘多糖一样，在体内作为蛋白质结合的复合物存在，这种复合物的抗凝性随着其蛋白活性的去除而增加。显然，肝素制备工艺的水平直接影响肝素产品的质量。目前，传统的肝素钠制备工艺大部分是从牛肺中提取，不仅制备的成本高，而且产率低，肝素质量也不够稳定。即使有的采用在肠粘膜中提取肝素的制备工艺，但工序复杂，也达不到工业化生产的要求。椐统计，提取1公斤肝素钠往往需要2500～3000根猪小肠粘膜，而且在生产过程中产生大量的废水污染环境。
【发明内容】
为了克服目前在制备肝素钠方面存在的不足，本发明提供一种产品质量高、工序简化、有利于提高工业化生产能力、无环境污染的肝素钠及其制备方法。
本发明解决其技术问题是通过以下技术方案来实现的：
(1)按照1∶2～4的重量比向猪小肠粘膜中加入纯水，用30～40％的氢氧化钠调节PH值8.5～10，升温到40～55℃后再按每公斤猪小肠粘膜为1.2克地比例加入2709蛋白酶，保温搅拌1～2小时后，按每公斤猪小肠粘膜加入0.10～0.20千克的粗盐升温到70～90℃，停止搅拌，保温20～30分种，用布袋过滤得滤液；
(2)按每公斤猪小肠粘膜所得到的滤液加0.1～0.15的D254强碱性阴离子交换树脂，搅拌吸附2～3小时，弃除树脂，得到交换后的树脂；
(3)以浸没交换后的树脂为量，用浓度为每升0.03～0.05摩尔的氯化钠溶液和0.3～0.5摩尔的氯化钠溶液分别洗涤搅拌10～15分种，分离母液得到洗涤后的树脂；
(4)先后两次以浸没洗涤后的树脂为量，加入每升2～4摩尔的氯化钠溶液反应30～40分种，分离树脂，收集合并两次反应的洗脱液；
(5)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节PH值至10～12，升温到65～85℃后过滤，滤液在搅拌下加入0.8～0.9倍(体积)量浓度为85～98％的乙醇，在室温下静置2～4小时，分离液体，得到沉淀物；
(6)按重量比1∶2的比例，将沉淀物用浓度为95～98％的乙醇脱水3～4次，在60～85℃真空干燥箱内得到肝素钠粗品；
(7)将粗品溶解于10～15倍(体积)量1％的氯化钠溶液中完全溶解，再加入盐酸调PH值1.0～2.5使其酸化，在5～10℃条件下滤出清液，调PH值9.0～11.0；
(8)保持清液在25℃常温下加入1.5～2.5％的过氧化氢，保温24小时后，过滤并用0.8～0.9倍(体积)量95～99％的乙醇沉淀；
(9)去除上清液，沉淀物用8～10倍量1％的氯化钠溶液充分溶解，冷却到10℃以下，调PH值9.0～11.0，再加入0.5～1.5％H2O2升温到25℃，保温24小时，过滤调PH值4.0～6.0，加0.7倍(体积)量95～99％乙醇静置沉淀；
(10)6～8小时后去除上层酒精清液，沉淀物溶解于粗品重量5～10倍的1％的氯化钠溶液中，溶解后，冷至10℃以下，滤膜过滤后在清液中加入0.5～0.7倍(体积)量95～99％乙醇再次静置沉淀；
(11)去除回收废酒精，沉淀物用95％的乙醇洗涤1～3次后，在60～85℃真空干燥箱内干燥20～30小时，磨碎后得肝素钠精品。
通过上述制备方法获得的肝素钠，其单位效价在140～150iu/nm之间，产品为无菌、无热原产品。
在上述的制备方案中，猪小肠粘膜通过2709蛋白酶酶解后，加入氯化钠并升高温度后使猪小肠粘膜中的动物蛋白凝聚，使生成的肝素钠容易进行离子交换；采用稀氯化钠溶液洗涤后的强碱性离子交换树脂再采用高浓度的氯化钠溶液洗脱，洗脱后的肝素钠在酒精溶液中沉淀、干燥制得肝素钠粗品；然后将肝素钠粗品进行酸化去除酸性杂蛋白，再进行两次氧化。通过这些工序制得的产品，单位效价在每毫克140～150国际单位以上，而且产品为无菌、无热原产品。特别是在制备过程中没有废水污染环境。
【具体实施方式】
实施例1：
(1)在300公斤猪小肠粘膜中加入700公斤水，用35％的氢氧化钠调节PH值9，升温到50℃后再按每公斤猪小肠粘膜为1.2克的比例加入360公斤2709蛋白酶，保温搅拌1.5小时后，加入45公斤的粗盐，升温到85℃，停止搅拌，保温25分种，用布袋过滤得滤液；
(2)在滤液中加入30公斤的D254强碱性阴离子交换树脂，搅拌吸附2.5小时，分离母液得到交换后的树脂；
(3)以浸没交换后的树脂为量，用浓度为每升0.04摩尔的氯化钠溶液和0.4摩尔的氯化钠溶液分别洗涤搅拌15分种，弃去洗涤液，得到洗涤后的树脂；
(4)先后两次以浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3摩尔的氯化钠溶液反应35分种，分离树脂，收集合并两次反应的洗脱液；
(5)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节PH值至12，升温到70℃后过滤，滤液在搅拌下加入0.8倍(体积)量浓度为95％的乙醇，在室温下静置3小时，分离液体，得到沉淀物；
(6)按重量比1∶2的比例，将沉淀物用浓度为98％的乙醇脱水3次，在80℃真空干燥箱内得到肝素钠粗品；
(7)将粗品溶解于13倍(体积)量1％的氯化钠溶液中完全溶解，再加入盐酸调PH值1.5使其酸化，在8℃条件下滤出清液，调PH值10.0；
(8)保持清液在25℃常温下加入1.5％的过氧化氢，保温24小时后，过滤并用0.8倍量95％的乙醇沉淀；
(9)去除上清液，沉淀物用8倍量1％的氯化钠溶液充分溶解，冷却到10℃以下，用5N氯化钠调PH值10.0，再加入1.0％H2O2升温到25℃，保温24小时，过滤调PH值5.0，加0.7倍(体积)量95％乙醇静置沉淀；
(10)6～8小时后去除上层酒精清液，沉淀物溶解于粗品重量7倍的1％的氯化钠溶液中，溶解后，冷至10℃以下，滤膜过滤后在清液中加入0.65倍(体积)量95％乙醇再次静置沉淀；
(11)去除回收废酒精，沉淀物用95％的乙醇洗涤3次后，在70℃真空干燥箱内干燥25小时，磨碎后得肝素钠精品。
实施例2：
(1)在200公斤猪小肠粘膜中加入600公斤水，用30％的氢氧化钠调节PH值9.5，升温到55℃后再按每公斤猪小肠粘膜为1.2克的比例加入240公斤2709蛋白酶，保温搅拌1.5小时后，加入30公斤的粗盐，升温到80℃，停止搅拌，保温30分种，用布袋过滤得滤液；
(2)在滤液中加入26公斤的D254强碱性阴离子交换树脂，搅拌吸附3小时，分离母液得到交换后的树脂；
(3)以浸没交换后的树脂为量，用浓度为每升0.05摩尔的氯化钠溶液和0.5摩尔的氯化钠溶液分别洗涤搅拌13分种，弃去洗涤液，得到洗涤后的树脂；
(4)先后两次以浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3.5摩尔的氯化钠溶液反应30分种，分离树脂，收集合并两次反应的洗脱液；
(5)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节PH值至11，升温到80℃后过滤，滤液在搅拌下加入0.9倍(体积)量浓度为95％的乙醇，在室温下静置3.5小时，分离液体，得到沉淀物；
(6)按重量比1∶2的比例，将沉淀物用浓度为96％的乙醇脱水2次，在75℃真空干燥箱内得到肝素钠粗品；
(7)将粗品溶解于10倍(体积)量1％的氯化钠溶液中完全溶解，再加入盐酸调PH值1.9使其酸化，在10℃条件下滤出清液，调PH值9.5；
(8)保持清液在25℃常温下加入2.0％的过氧化氢，保温24小时后，过滤并用0.9倍量95％的乙醇沉淀；
(9)去除上清液，沉淀物用9倍量1％的氯化钠溶液充分溶解，冷却到10℃以下，用5N氯化钠调PH值9.0，再加入1.5％H2O2升温到25℃，保温24小时，过滤调PH值5.5，加0.7倍(体积)量97％乙醇静置沉淀；
(10)6～8小时后去除上层酒精清液，沉淀物溶解于粗品重量8倍的1％的氯化钠溶液中，溶解后，冷至10℃以下，滤膜过滤后在清液中加入0.6倍(体积)量95％乙醇再次静置沉淀；
(11)去除回收废酒精，沉淀物用95％的乙醇洗涤3次后，在80℃真空干燥箱内干燥28小时，磨碎后得肝素钠精品。