能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子及其制备方法 技术领域：
本发明属微生物感染免疫和检验领域。涉及利用分子生物学技术SELEX技术设计和制备一种能与感染人的伤寒杆菌(Salmonella Typhi)特有的病原性毒力岛上IVB型纤毛结构蛋白高亲和的RNA适配子(Aptamer)。
背景技术：
近2300种相关的沙门氏菌中，伤寒杆菌是最重要的致病菌，而且是唯一只对人致病并导致伤寒肠热症的细菌。伤寒杆菌可通过污染的食物和水而流行和传染。每年全世界感染伤寒杆菌的人数达16.6亿，我国伤寒也长期流行。最近我国将伤寒杆菌对人感染划定为10种法定的传染病之一。大多数沙门氏菌只引起肠炎，但伤寒杆菌可侵入人体血管导致高烧及更严重的肠热症和败血症，是临床治疗中颇为棘手的问题。遗憾地是至今为止全世界还没有完善的伤寒疫苗；而近十几年来，伤寒杆菌出现对多种抗菌素耐药(如抗氯霉素抗性等)的趋势，这也成为非常严重的问题。
我们近年克隆和发现伤寒杆菌IVB型纤毛操纵子，该操纵子含有11个基因，其中pilS基因是负责编码伤寒杆菌IVB型纤毛的结构蛋白PilS，并已构建好了高水平表达谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白(GST-PilS融合蛋白)的重组质粒菌株，见参考文献Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，FungA.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。该文献还介绍了谷胱甘肽硫转移酶-琼脂糖4B(GST-Sepharose 4B)和谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B(GST-PilS-Sepharose4B)。伤寒杆菌IVB型纤毛缺失突变株(Typhi J341pilS-)侵入人小肠细胞只有表达IVB型纤毛的伤寒杆菌(Serovar Typhi A21-6)侵入小肠细胞的5％-25％，加入可溶性的PilS蛋白可抑制伤寒杆菌对细胞的侵入。此外，PilS蛋白介导了伤寒杆菌之间的聚集，这种聚集可能与它的致病性毒性关系密切。种种证据均表明，IVB型纤毛尤其是PilS结构蛋白和伤寒杆菌对人体细胞的侵入性密切相关。
SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。
发明内容：
本发明的目的是，提供一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子，该RNA适配子为预防和治疗伤寒杆菌肠热症提供了新型的拮抗剂，为克服临床上伤寒治疗出现的日益严重的耐药问题，提供了新的解决途径。
本发明的另一目的是提供一种制备能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞RNA适配子的方法，该方法通过制备和纯化IVB型纤毛结构融合蛋白-琼脂糖4B、随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、RNA文库制备、SELEX筛选、荧光定量PCR选取，得到能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子，并检测其效果。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子，该RNA适配子的RNA
序列为：5’-GGGAACAGUCCGAGCCUCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGGGAUGAGGGUCAAUGCGUCAUAGGA-3’。
一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子的制备方法按下列步骤顺序进行：
1、制备和纯化谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B复合体(GST-PilS-Sepharose 4B)。将谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白重组质粒菌株(见参考文献Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。)接种于浓度为50μg/ml的氨苄抗菌素的2×TY液体培养基中，30℃振荡培养至600nm吸光度值为1～2，加入异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其浓度为0.1mmol/L诱导，30℃振荡培养4～6小时，浓缩菌株，超声破碎，加入三硝基甲苯-100(TritonX-100)使其浓度为1％，轻混30～40分钟，5000转/分钟离心5分钟，取上清，加入谷胱甘肽琼脂糖4B(Gluthathion-Sepharose 4B)，室温混合20～30分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2～4次，即得到纯化的谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B复合体(GST-PilS-Sepharose 4B)。
上述2×TY液体培养基为：1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl5g。
2、构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链DNA(ssDNA)文库：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表碱基A，G，T，C中的任意一个，该文库的容量约为1014～1015；构建上游引物：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性内切酶EcoRI的酶切位点；构建下游引物：5’GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，该引物中含有DNA限制性内切酶BamHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。
3、单链DNA文库合成双链DNA文库。将单链DNA文库0.1μg、下游引物0.3nmol、由立陶宛MBI公司生产的10倍的大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(KlenowFragment)反应缓冲液5μl、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段5个活性单位和1nmol脱氧核糖核酸(dNTP)加入双蒸水中，使总体积为50μl；然后放入PCR仪中，55℃反应10分钟，37℃15反应分钟，70℃10分钟灭活Klenow Fragment，得到双链DNA文库。
4、双链DNA文库的PCR扩增。将步骤3中的双链DNA文库10μl、上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、25mmol/L MgCl2 10μl、2mmol/LdNTP10μl，由立陶宛MBI公司生产的10倍DNA聚合酶反应缓冲液10μl和DNA聚合酶2.5个活性单位，加入双蒸水中，使总体积为100μl；然后放入PCR仪中，先进行94℃反应2分钟预变性，按以下条件循环8次：94℃反应30秒、60℃反应1分钟、72℃反应2分钟，再72℃反应3分钟，便得到双链DNA文库PCR扩增的产物。
5、PCR扩增产物的纯化。用含0.5μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶，对步骤4中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；
6、RNA文库的制备。将α-P32(P的同位素)标记的尿嘧啶(UTP)50μCi(微居)或UTP 0.5mmol/L、2μg～5μg双链DNA文库、T7RNA聚合酶(美国Promega公司提供)40个活性单位、5倍T7RNA聚合酶反应缓冲液(美国Promega公司提供)20μl、100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)10μl，100mmol/L核糖核酸ATP、GTP、UTP和CTP各0.5μl加入双蒸水中，使总体积为100μl；将其放入PCR仪中，在37℃条件下反应2小时，得到RNA文库。
7、RNA文库的纯化。将步骤6获得的RNA随机文库加入5个活性单位的无RNA酶的DNA酶(美国Promega公司提供)，将其放入PCR仪中，在37℃条件下反应15分钟，然后用美国Qbiogene公司提供的RNA纯化回收试剂盒纯化。
8、SELEX筛选。取0.2mg的谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B(GST-PilS-Sepharose 4B)，每次用1ml的SELEX筛选缓冲液洗涤3～5次。将步骤7的纯化RNA文库200-500pmol加入到50μl的SELEX筛选缓冲液中，再加入到GST-PilS-Sepharose 4B中，室温下轻轻振动15～20分钟，用5000转/分钟离心5分钟，去上清，以弃去未与GST-PilS-Sepharose 4B结合的RNA，用3～6ml的SELEX筛选缓冲液洗涤3～6次，然后加入SELEX筛选洗脱液100μl，4℃静置1小时，用5000转/分钟离心5分钟，取上清，然后用美国Qbiogene公司提供的RNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的RNA。
上述SELEX筛选缓冲液为：25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，200mmol/LNaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液为：25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，1mol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。
9、RNA逆转录PCR扩增(RT-PCR)。将上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、10mmol/L MgSO4 2μl、10mmol/L dNTP2μl、由美国Promega公司提供的5倍RT-PCR反应缓冲液10μl、DNA聚合酶2个活性单位、逆转录酶2个活性单位和步骤8中纯化的RNA 25μl加入到双蒸水中，使总体积为50μl，将其放入PCR仪中，48℃反应45分钟，94℃反应2分钟预变性，然后按下列条件循环20次：94℃反应30秒、60℃反应1分钟、72℃反应2分钟，再72℃反应3分钟，得到RT-PCR扩增产物。
10、重复步骤5～9，并将步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用步骤9得到的RT-PCR扩增产物替代，得到RT-PCR扩增产物；
11、将步骤5～9重复6轮，把步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用每次新得到的RT-PCR扩增产物替代，并将其中的步骤8改为：将步骤7得到的RNA文库溶于50μl的SELEX筛选缓冲液，将其加入到0.5mg的谷胱甘肽硫转移酶-琼脂糖4B中，室温下轻轻振动15分钟，以吸附与谷胱甘肽硫转移酶-琼脂糖4B结合的RNA，离心，取上清，再将上清加入到0.2mg的谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B中，室温下轻轻振动15～20分钟，离心，去上清，用SELEX筛选缓冲液洗涤3～6次，再加入SELEX筛选洗脱液100μl，4℃静置1小时，离心，取上清，用RNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的RNA；
12、重复步骤5～7，将步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用步骤11最后一轮得到的RT-PCR扩增产物替代，得到可与伤寒杆菌IVB纤毛结构蛋白高度亲和的RNA适配子库；
13、将步骤11最后一轮得到的RT-PCR扩增产物，经DNA限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序；
14、将各单个生长菌落所对应的RNA适配子3μg分别加入含有3.0×106个野生型伤寒杆菌的50μl菌液中，15～20℃静置15分钟后，将处理过的伤寒杆菌加入到500μl含有2.5×105个人白血病单核细胞(THP-1)的1640细胞培养液中，在5％二氧化碳培养箱中37℃反应2小时，随后加入1mlPBS，2000转/分钟离心10分钟，去上清，如此洗涤3～5次，洗涤后加入庆大霉素使其浓度为100μg/ml，在5％二氧化碳培养箱中37℃反应1小时，再用PBS洗涤3～5次后，加入500μl的细胞裂解液，在55℃的烤箱内裂解细胞1小时，然后迅速放于94℃的烤箱内反应10分钟，随后在其中加入酚、氯仿抽提液1ml，上下颠倒振荡5分钟使液体充分混合，然后12000转/分钟离心5分钟，取400μl上层水相，在该水相中加入0.8ml乙醇，再将其静置于-80℃冰箱中12小时沉淀DNA，最后20000转/分钟离心15分钟，去上清，15～20℃自然风干残余水分后，加入15～20μl双蒸水溶解沉淀的DNA，取34.4ngDNA作为模板，用荧光定量PCR试剂盒(QuantiTectTM SYBR Green PCR kit由德国Qiagen公司提供)进行定量PCR反应，扩增所用的上游引物为5’GCTTCTATAACTAGCAACGT 3’；下游引物为：5’CTTCTGGCAAGATATTCTGA 3’，反应条件为95℃，15分钟预变性，然后按下列条件循环40次：95℃反应45秒、50℃反应45秒、72℃反应30秒，再进行72℃反应3分钟，在进行反应的同时，运用定量PCR仪检测细胞内伤寒杆菌基因组DNA的含量，选取细胞内伤寒杆菌基因组DNA含量较少的一组，该组即为能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子。
本发明的优点是：能特异性的结合在伤寒杆菌致病过程中发挥关键作用的IVB型纤毛上，可显著抑制伤寒杆菌侵入人体细胞，RNA适配子可直接作为伤寒杆菌的拮抗剂使用，可预防和治疗伤寒杆菌肠热症。因为采用了新的组合化学技术-SELEX技术进行伤寒杆菌IVB纤毛结构蛋白的RNA适配子的筛选，确保了获得的RNA适配子可特异性结合在伤寒杆菌IVB型纤毛上，从而封闭了伤寒杆菌的致病位点，使其不能进入人体细胞。
其二，为克服临床上伤寒治疗出现的日益严重的耐药问题，提供了新的解决途径。目前治疗伤寒感染多采用广谱抗菌素，如氯霉素(chloramphenicol)，氨苄青霉素(ampicillin)，和三甲氧苄氨嘧啶(黄胺增效剂)/黄胺甲异恶唑(trimethoprim/sulfamethoxazole)，这些药物不仅杀伤伤寒杆菌也杀伤寄生在人体内的多种有益菌群，同时伤寒杆菌的对这些药物产生的耐药问题也日益严重。本发明制备的RNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同与任何广谱抗生素，因而无耐药性之忧；同时RNA适配子只针对伤寒杆菌发挥作用，对人体内的多种有益菌群并无危害。RNA适配子也别于传统的蛋白质抗体，其分子量小，可快速渗入细胞，无抗原性，不引起副作用。
其三，由下表可知，用RNA适配子处理野生型伤寒杆菌Serovar Typhi J341后，伤寒杆菌侵入人白血病单核细胞(THP-1)的数目明显减少，用荧光定量PCR检测细胞内的伤寒杆菌DNA含量由未加RNA适配子时的0.000163ng/μl下降到0.000024ng/μl，抑制率为85.28％，说明本发明的适配子能有效地抑制伤寒杆菌侵入人体细胞，可以直接作为伤寒杆菌的拮抗剂使用。此外，该RNA适配子已克隆到DNA质粒上，并且该质粒已转化到大肠杆菌DH5α中，可直接用该菌株进行大规模生产制备。 名称 类型初始伤寒杆菌DNA量(ng/μl) Ct值 野生型伤寒杆菌J341 样品 0.000163 11.93 RNA适配子+野生型伤寒杆菌J341 样品 0.000024 14.5 人白血病单核细胞对照 对照 15.23
具体实施方式：
一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子，该RNA适配子的RNA序列为：5’-GGGAACAGUCCGAGCCUCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGGGAUGAGGGUCAAUGCGUCAUAGGA-3’。
一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子的制备方法按下列步骤顺序进行：
1、制备和纯化谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B复合体(GST-PilS-Sepharose 4B)。将谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白重组质粒菌株接种于浓度为50μg/ml的氨苄抗菌素的2×TY液体培养基中，30℃振荡培养至600nm吸光度值为1～2，加入异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其浓度为0.1mmol/L诱导，30℃振荡培养4小时，浓缩菌株，超声破碎，加入三硝基甲苯-100(TritonX-100)使其浓度为1％，轻混30分钟，5000转/分钟离心5分钟，取上清，加入谷胱甘肽琼脂糖4B(Gluthathion-Sepharose4B)，室温混合30分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，即得到纯化的谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B复合体(GST-PilS-Sepharose 4B)。
上述2×TY液体培养基为：1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 5g。
2、构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链DNA(ssDNA)文库：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表碱基A，G，T，C中的任意一个，该文库的容量约为1014～1015；构建上游引物：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性内切酶EcoRI的酶切位点；构建下游引物：5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，该引物中含有DNA限制性内切酶BamHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。
3、单链DNA文库合成双链DNA文库。将单链DNA文库0.1μg、下游引物0.3nmol、由立陶宛MBI公司生产的10倍的大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(KlenowFragment)反应缓冲液5μl、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段5个活性单位和1n mol脱氧核糖核酸(dNTP)加入双蒸水中，使总体积为50μl；然后放入PCR仪中，55℃反应10分钟，37℃15反应分钟，70℃10分钟灭活Klenow Fragment，得到双链DNA文库。
4、双链DNA文库的PCR扩增。将步骤3中的双链DNA文库10μl、上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、25mmol/L MgCl2 10μl、2mmol/L dNTP10μl，由立陶宛MBI公司生产的10倍DNA聚合酶反应缓冲液10μl和DNA聚合酶2.5个活性单位，加入双蒸水中，使总体积为100μl；然后放入PCR仪中，先进行94℃反应2分钟预变性，按以下条件循环8次：94℃反应30秒、60℃反应1分钟、72℃反应2分钟，再72℃反应3分钟，便得到双链DNA文库PCR扩增的产物；
5、PCR扩增产物的纯化。用含有浓度为0.5μg/ml溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶，将步骤4中的双链DNA文库PCR扩增的产物进行电泳，电泳后将2％的琼脂糖凝胶放在260nm荧光透视板上，将凝胶中呈橘红色条带的双链DNA文库PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化。
6、RNA文库的制备。将α-P32(P的同位素)标记的尿嘧啶(UTP)50μCi(微居)或UTP 0.5mmol/L、2μg～5μg双链DNA文库、T7RNA聚合酶(美国Promega公司提供)40个活性单位、5倍T7RNA聚合酶反应缓冲液(美国Promega公司提供)20μl、100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)10μl，100mmol/L核糖核酸ATP、GTP、UTP和CTP各0.5μl加入双蒸水中，使总体积为100μl；将其放入PCR仪中，在37℃条件下反应2小时，得到RNA随机文库。
7、RNA随机文库的纯化。将步骤6获得的RNA随机文库加入5个活性单位的无RNA酶的DNA酶，将其放入PCR仪中，在37℃条件下反应15分钟，然后用德国Qbiogene公司提供的RNA纯化回收试剂盒纯化。
8、SELEX筛选。取0.2mg的GST-PilS-Sepharose 4B，每次用1ml的SELEX筛选缓冲液洗涤3～5次。将步骤7的纯化RNA文库200-500 pmol加入到50μl的SELEX筛选缓冲液中，再加入到GST-PilS-Sepharose 4B中，室温下轻轻振动15分钟，用5000转/分钟离心5分钟，去上清，以弃去未与GST-PilS-Sepharose4B结合的RNA，用3～6ml的SELEX筛选缓冲液洗涤3～6次，然后加入SELEX筛选洗脱液100μl，4℃静置1小时，用5000转/分钟离心5分钟，取上清，然后用美国Qbiogene公司提供的RNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的RNA。
上述SELEX筛选缓冲液为：25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)，50mmol/L KCl，200mmol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。
上述SELEX筛选洗脱液为：25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，1mol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。
9、RNA逆转录PCR扩增(RT-PCR)。将上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、10mmol/L MgSO4 2μl、10mmol/L dNTP2μl、由美国Promega公司提供的5倍RT-PCR反应缓冲液10μl、DNA聚合酶2个活性单位、逆转录酶2个活性单位和步骤8中纯化的RNA 25μl加入到双蒸水中，使总体积为50μl，将其放入PCR仪中，48℃反应45分钟，94℃反应2分钟预变性，然后按下列条件循环20次：94℃反应30秒、60℃反应1分钟、72℃反应2分钟，再72℃反应3分钟，得到RT-PCR扩增产物；
10、重复步骤5～9，并将步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用步骤9得到的RT-PCR扩增产物替代，得到RT-PCR扩增产物；
11、将步骤5～9重复6轮，把步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用每次新得到的RT-PCR扩增产物替代，并将其中的步骤8改为：将步骤7得到的RNA文库溶于50μl的SELEX筛选缓冲液，将其加入到0.5mg的谷胱甘肽硫转移酶-琼脂糖4B中，室温下轻轻振动15分钟，以吸附与谷胱甘肽硫转移酶-琼脂糖4B结合的RNA，离心，取上清，再将上清加入到0.2mg的谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白-琼脂糖4B中，室温下轻轻振动15～20分钟，离心，去上清，用SELEX筛选缓冲液洗涤3～6次，再加入SELEX筛选洗脱液100μl，4℃静置1小时，离心，取上清，用RNA纯化回收试剂盒纯化，得到纯化的RNA；
12、重复步骤5～7，将步骤5中的“步骤4中的PCR扩增产物”用步骤11最后一轮得到的RT-PCR扩增产物替代，得到可与伤寒杆菌IVB纤毛结构蛋白高度亲和的RNA适配子库；
13、将步骤11最后一轮得到的RT-PCR扩增产物，经DNA限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序；
14、将各单个生长菌落所对应的RNA适配子3μg分别加入含有3.0×106个野生型伤寒杆菌的50μl菌液中，15～20℃静置15分钟后，将处理过的伤寒杆菌加入到500μl含有2.5×105个人白血病单核细胞(THP-1)的1640细胞培养液中，在5％二氧化碳培养箱中37℃反应2小时，随后加入1mlPBS，2000转/分钟离心10分钟，去上清，如此洗涤3～5次，洗涤后加入庆大霉素使其浓度为100μg/ml，在5％二氧化碳培养箱中37℃反应1小时，再用PBS洗涤3～5次后，加入500μl的细胞裂解液，在55℃的烤箱内裂解细胞1小时，然后迅速放于94℃的烤箱内反应10分钟，随后在其中加入酚、氯仿抽提液1ml，上下颠倒振荡5分钟使液体充分混合，然后12000转/分钟离心5分钟，取400μl上层水相，在该水相中加入0.8ml乙醇，再将其静置于-80℃冰箱中12小时沉淀DNA，最后20000转/分钟离心15分钟，去上清，15～20℃自然风干残余水分后，加入15～20μl双蒸水溶解沉淀的DNA，取34.4ngDNA作为模板，用荧光定量PCR试剂盒(QuantiTectTM SYBR Green PCR kit由德国Qiagen公司提供)进行定量PCR反应，扩增所用的上游引物为5’GCTTCTATAACTAGCAACGT 3’；下游引物为：5’CTTCTGGCAAGATATTCTGA 3’，反应条件为95℃，15分钟预变性，然后按下列条件循环40次：95℃反应45秒、50℃反应45秒、72℃反应30秒，再进行72℃反应3分钟，在进行反应的同时，运用定量PCR仪检测细胞内伤寒杆菌基因组DNA的含量，选取细胞内伤寒杆菌基因组DNA含量较少的一组，该组即为能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子。
上述细胞裂解液为：25ml双蒸水中加入250μl的1mol/LTris-Cl，500μl的0.5mol/LEDTA，2.5ml的10％硫酸十二烷酸钠(SDS)，1ml的1mol/LDTT，0.25ml的20g/L蛋白酶K。
上述酚、氯仿抽提液为：将25ml的酚，24ml的氯仿，1ml异戊醇混合。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子及其制备方法
<130>能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的RNA适配子及其制备方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>65
<212>RNA
<213>Salmonella typhi
<400>1
gggaacaguc cgagccucac uguuauccga uagcagcgcg ggaugagggu caaugcguca 60
uagga 65