用分子遗传标记培育ZW型鳞翅目害虫性连锁平衡致死系的方法 所属技术领域
本发明涉及ZW型鳞翅目害虫的遗传育种与遗传防治领域，尤其涉及用分子遗传标记培育ZW型鳞翅目害虫性连锁平衡致死系的方法。
背景技术
对于鳞翅目害虫的防治目前多使用化学杀虫剂、辐射不育或生物防治。化学杀虫剂曾经在农作物害虫防治领域中取得了巨大的成就，但长期以来，由于高毒化学农药的大量使用，而导致产生三“R”问题(即次要害虫的再猖獗、害虫的抗性和农药残留)，并造成严重的环境污染，破坏了自然界的生态平衡。
害虫辐射不育防治技术是一种将人工饲养目标害虫，通过辐照后进行野外释放，与野生种群杂交等手段使害虫丧失繁育能力而使虫口数目自行下降的防治方法。这种技术具有不污染环境，灭虫专一性强等特点，但该项技术存在很大的缺陷，主要是需要在实验室里进行大规模的害虫饲养和辐照处理，成本高，辐照处理后的害虫往往生命力下降，野外生活竞争力降低，对于迁飞习性强的害虫防治效果差等缺陷，这些都限制了该技术的推广。
生物防治主要是利用天敌生物，如细菌、真菌、病毒、寄生蜂等自然生态系统的营养关系，各种生物之间相互依存、相互制约的生态学现象和某些生物学特征，使天敌和害虫之间保持一定的平衡关系，达到防治害虫的目的。生物防治虽然具有专一性强、持久控制害虫、不会造成环境污染的优点；但仍存在很多局限性，如：见效慢，生物制剂不易成批生产，使用复杂和效果不稳定等。
性连锁平衡致死控制技术是通过平衡鳞翅目害虫性染色体上两个不等位的致死突变基因，即致死突变基因隐性纯合致死、而杂合则都可以生存下来，从而实现性别控制。该技术的关键是培育具有正常生命活动能力的性连锁平衡致死品系。V.A.Strunnikov院士等运用辐射诱变等技术手段，在国际上首次育成了家蚕性连锁平衡致死系统，该系统可以繁衍继代，但当平衡致死系雄蚕与任何一个普通品种的雌蚕杂交，其后代的雌蚕卵皆在胚胎期死亡(不孵化)，而雄蚕卵均能正常孵化，使专养雄蚕变成了现实。同时他提出了利用性连锁平衡致死方法防治害虫地技术设想，即利用人工培育的鳞翅目害虫性连锁平衡致死品系的雄虫，人工释放至野外，与野生雌虫交配，其后代雌虫在致死基因的作用下自然死亡，后代雄虫虽能成活但仍携带致死基因，这种雄虫与野生的雌虫杂交，其后代的雌群体又有50％自然死亡，依次递减……，从而达到有效地控制害虫种群数目的目的。1990年捷克科学家Marec F利用EMS诱变技术，培育出了性连锁平衡致死的地中海粉螟品品系，使利用性连锁平衡致死方法防治害虫的技术设想变为现实。
与其他害虫防治技术相比，性连锁平衡致死方法防治害虫具有多方面的优势，其中最为突出的特点是：1、座位在性染色体上的致死基因遗传稳定，具有可持续作用；2、与辐射不育技术相比，释放虫量少，成本低，基因型相对较单纯；3、无毒、无残留、不伤害天敌、不存在害虫抗药性问题、与环境兼容性强；4、可以通过筛选分别位于两个同源染色体上相距很近的双致死基因的平衡致死系统，利用减数分裂时配子交换的特性，将害虫控制在危害程度下，又保持了生物种群平衡和生物链的连续。
虽然性连锁平衡致死方法防治害虫具有多方面的优势，但到目前为止，仅在家蚕和地中海粉螟中取得成功，还很难推广运用于整个鳞翅目害虫，其主要原因是人们对其他害虫的研究远远不如家蚕，尚缺少可以用于性连锁平衡致死研究的稳定品系，尤其是没有Z染色体上的可见表型性状标记。除家蚕、地中海粉螟外，人们对ZW型害虫的研究还仅仅停留在生物学和生态学上。很多害虫还不能人工饲养，更没有种群与品系的区分，对这样的物种，利用表型标记进行性连锁平衡致死品系的培育是非常困难的，这也就是为什么性连锁平衡致死技术至今没有能够用于害虫防治的主要原因。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种用分子遗传标记培育ZW型鳞翅目害虫性连锁平衡致死系的方法，利用分子遗传标记及比较定量PCR技术及多色荧光原位杂交技术，一只雄虫与正常雌虫和易位雌虫进行交配，同步筛选培育性连锁平衡致死的鳞翅目害虫。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1)用已知鳞翅目物种Z染色体上的基因序列，克隆目标害虫(被研究的害虫)的同源基因，以常染色体上的分子标记为参照，利用比较定量PCR技术寻找目标害虫Z染色体上的分子标记；
2)以寻找到的Z染色体上的分子标记为染色体易位检测标记，用比较定量PCR技术筛选发生染色体易位的雌性个体，并用多色荧光原位杂交技术进行验证；
3)用γ射线同时辐照雌雄虫，诱发隐性致死突变、互交产生F1代，用一个F1代雄虫先后与正常雌虫及易位雌虫进行交配，以W染色体特异片段为标记用PCR技术检测F2代中是否有雌虫存活，同步筛选两个分别位于不同Z染色体上的非等位、且紧密连锁、并能被易位染色体片段显性基因掩盖的隐性致死基因。
本发明的优点是：直接从分子水平寻找和利用生物个体在基因组或基因型上所含有的遗传信息，因而具有稳定性高、受环境条件的影响较小、信息量大、不同层次和类群之间广泛可比，摆脱了性状标记受种群和品系的限制；同时根据同源基因相对保守的特点，利用已知物种Z染色体上的基因序列，克隆目标害虫的同源基因，并通过比较定量PCR技术进行基因定位，从而彻底摆脱了物种的限制；利用比较定量PCR技术直接在F1代检测易位个体，避免了大大量饲养F2代幼虫的无效劳动；在双致死基因的筛选中采用一雄交二雌的选育方式，并用W染色体特异片段和PCR技术检测后代后代雌性个体的存活与否，大加快了致死基因的筛选进程；整个技术涉及面广，适用于所有鳞翅目ZW型害虫。
【附图说明】
图1是雌虫染色体组成、相应的基因比例及其定量PCR检测结果示意图；
图2是雄虫染色体组成、相应的基因比例及其定量PCR检测结果示意图；
图3是带有K基因的Z染色体片段易位到W染色体上成为基因型易位个体的染色体组成、相应的基因比例及其定量PCR检测结果示意图；
图4是γ射线辐照处理雌虫诱发带有K基因Z染色体片段向W染色体易位后与正常雄虫交配筛选易位个体模式图；
图5是γ射线辐照处理雌虫使带有K基因Z染色体片段断裂成为一个染色体外的片段并与正常雄虫交配产生假易位个体；
图6是假易位F1个体与正常雄虫交配的后代基因型模式图；
图7是易位F1个体与正常雄虫交配产生的后代的基因型模式图；
图8是分别位于两个Z染色体上隐性致死基因的诱变模式图；
图9是带有两个致死基因的雄虫与正常雌虫交配的后代基因型及雌雄性别比例；
图10是带有一个致死基因的雄虫与正常雌虫交配的后代基因型及雌雄性别比例；
图11是双致死基因(l1、l2)不能被易位染色体片段掩盖的后代基因型及雌雄性别比例；
图12是双致死基因(k1、k2)被易位染色体片段掩盖的后代基因型及雌雄性别比例。
【具体实施方式】
本发明主要是利用分子遗传标记结合比较定量PCR技术培育性连锁平衡致死的鳞翅目害虫，可用于鳞翅目害虫的遗传防治。具体地说，是以位于常染色体上的基因(如A基因)为参照基因，利用比较定量PCR技术寻找目标害虫Z染色体上的分子标记(如K基因)，Z染色体上的分子标记与常染色体上基因的比例(K/A)在雌雄之间存在差异，在雌性个体中K/A＝1/2，在雄性个体中K/A＝2/2；利用这一差异就可确定目标害虫Z染色体上的分子标记。用γ射线辐照诱变的Z染色体片段向W染色体易位，并以Z染色体上的分子标记(如K基因)为易位筛选标记，利用比较定量PCR技术及多色荧光原位杂交技术筛选发生染色体易位个体。用γ射线辐照，在Z染色体上诱变两个分别位于不同Z染色体上的非等位、且紧密连锁、并能被易位染色体片段显性基因掩盖的隐性致死基因，通过与染色体易位个体反复交配就可培育出目标害虫的性连锁平衡致死品系，用于目标害虫的遗传防治。
主要方法包括：利用RAPD技术寻找目标害虫W染色体特异片段；以常染色体上的分子标记为参照，利用比较定量PCR技术寻找目标害虫Z染色体上的分子标记；用γ射线辐照诱变，并用比较定量PCR技术及多色荧光原位杂交技术筛选发生染色体易位个体；用γ射线同时辐照雌雄虫，诱发隐性致死突变、互交产生F1代，用一个F1代雄虫先后与正常雌虫及易位雌虫交配，以W染色体特异片段为标记用PCR技术检测F2代中是否有雌虫存活，同步筛选两个分别位于不同Z染色体上的非等位、且紧密连锁、并能被易位染色体片段所掩盖的隐性致死基因并与染色体易位个体交配培育出性连锁平衡致死品系。
具体步骤如下：
1寻找目标害虫Z染色体上的分子标记
随着以家蚕为代表的鳞翅目昆虫分子生物学的飞速发展，ZW型鳞翅目昆虫Z染色体上的基因越来越多的被人们发现，利用同类物种间基因相对保守的特点，根据已知模式昆虫如家蚕Z染色体上的基因(如K基因)序列，克隆目标害虫的同源基因(如K基因)；以位于常染色体上的基因(如A基因)为参照基因，利用比较定量PCR技术鉴定目标害虫的K基因是否在Z染色体上。Z染色体上的基因(如K基因)与常染色体上基因(如A基因)的比例(K/A)在雌雄之间存在差异，这是因为雌虫的基因型为WZKAA，只有一个K基因，两个A基因，K/A＝1/2(如图1)；而雄虫的基因型为ZKZKAA，有两个K基因，两个A基因，K/A＝2/2(如图2)；利用这一差异就可确定目标害虫Z染色体上的分子标记。实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种基因检测与诊断技术，是在荧光定量PCR仪上将基因的PCR扩增与基因的荧光检测结合起来一种非常准确的基因检测手段。比较定量PCR是以一个基因为内参照，与被检测基因同时进行实时定量PCR扩增，然后通过参照基因的拷贝数计算被检测基因的拷贝数。
2筛选染色体易位体
用γ射线辐照处理雌虫，以K基因作为易位筛选标记，使带有K基因的Z染色体片段向W染色体易位。经辐照处理的雌虫与正常的雄虫交配，对F1代雌虫逐个进行单虫比较定量PCR检测(如图4)。正常雌虫的基因型为WZKAA，K/A＝1/2(如图1)；如果带有K基因的Z染色体片段易位到W染色体上，则易位个体的基因型为将有两个K基因，K/A＝2/2(如图3)。
对于没有易位但带有一个标记基因的染色体片段的个体(如图5)，虽然K/A＝2/2，但当这样的个体与正常的雄虫交配后，则ZK染色体片段发生分离，后代中雌的个体的基因型将发生变化，有的为WZAA型，K/A＝1/2；有的为WZKZKAA型，K/A＝2/2(如图6)。而易位个体与正常雄虫交配，后代雌虫的基因型全为K/A＝2/2(如图7)。通过对F2或F3代雌虫的跟踪调查，就可鉴定出易位个体。并且对于经定量PCR检测为染色体易位的个体，可以用W特异片段和K基因片段为探针进行多色荧光原位杂交技术验证。
3培育性连锁平衡致死的鳞翅目害虫品系
3.1分子水平鉴定目标害虫的雌雄
ZW型鳞翅目害虫的染色体组成在雌雄个体间存在显著差异，雌虫的性染色体为ZW，雄虫的性染色体为ZZ，利用RAPD技术寻找目标害虫W染色体特异的分子标记，经序列分析，合成特异的引物，直接通过PCR技术在分子水平鉴定目标害虫的雌雄。
3.2 Z染色体上非等位、且紧密连锁的隐性胚胎期致死基因的诱变和筛选
同时用γ射线辐照处理雌虫、雄虫，在Z染色体上诱变致死突变。雌雄交配(如图8)，F1雄虫与正常雌虫及易位雌虫先后进行单蛾交配、隔离饲养，如果某个F1雄虫的两个Z染色体上分别带有一个致死基因(如k1，k2)，且不等位、又紧密连锁，当这个雄虫与正常的雌虫交配后，其F2代成活的全部为雄虫，雌虫全部致死(如图9)；如果某个F1雄虫仅有一个致死基因或完全没有致死基因，则其与正常雌虫交配后，F2代就有雌虫成活(如图10)。在幼虫刚孵化出来时，提取数十、甚至上百头幼虫的DNA，利用W染色体上的雌性特异性片段进行PCR检测，如果有雌虫存活，PCR检测为阳性；如果没有雌虫存活，PCR检测为阴性。这样既可以避免大规模饲养F2代幼虫，又可以判断F1代雄虫的遗传特性。
3.3 Z染色体上隐性致死基因与易位染色片段的平衡
被易位染色体片段掩盖的Z染色体上隐性致死基因的筛选与前面双致死基因的筛选同时进行，如果发现F1代雄虫与正常的雌虫交配产生的F2代幼虫全为雄虫(如图9的结果)，则用同样的W染色体上的雌性特异性片段进行PCR方法检测其与易位雌虫交配后产生的F2代幼虫，如果PCR检测为阴性，说明这个F1代雄虫的两个Z染色体上的致死基因(如图11)不能被易位染色体片段显性基因掩盖；如果PCR检测结果为阳性，说明这个F1个体的两个Z染色体上的致死基因(如图12)可以被易位染色体片段显性基因掩盖，可被显性基因掩盖F1代雄性个体和相对应的易位雌性个体就组成了目标害虫的性连锁平衡致死品系。