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多核苷酸测序方法
    【发明领域】

    本发明涉及一种测定多核苷酸序列的方法。

    【发明背景】

    正如绘制编码人类基因组DNA的30亿个碱基图谱的人类基因组计划所展现出的，测定多核苷酸序列的能力具有极为重要的科学意义。

    在大规模DNA测序中普遍使用的基本方法是链终止法。这一方法最初由Sanger和Coulson发展起来(Sanger等，Proc.Natl.Aacd.Sci.USA，1977；74：5463‑5467)，该方法依赖于使用四种三磷酸核苷的双脱氧衍生物，这些衍生物在聚合酶反应中掺入到新生多核苷酸链中。一旦掺入，双脱氧衍生物就会终止聚合酶反应，用凝胶电泳将产物分离并加以分析，以揭示特定双脱氧衍生物在链中掺入的位置。

    尽管这种方法得到广泛应用，而且能产生可靠的结果，但还是被认为速度慢，劳动强度大以及费用昂贵。

    荧光标记已被用于在聚合酶反应中识别增长的新生多核苷酸链中核苷酸的掺入(WO91/06678)。但是这些技术有一个缺点，即由荧光团所引起的背景干扰的增加。随着DNA分子的增长，背景″噪音″也会增加，检测每个核苷酸掺入情况所需的时间也需要增加。这严重限制了这种方法在大分子核苷酸测序中的应用。基于荧光染料的多核苷酸测序系统的最大限制在于光褪色的问题。

    光褪色是一种已被广泛报道的存在于荧光染料系统中的现象，其为将染料暴露于激发波长时所导致的结果。所有的染料系统在发生光褪色前都能吸收有限数量的光子。一旦光褪色发生荧光染料就不能再被观测到，因此如果其结合了一个分子，则该分子也就不能被检测到。

    因此就有必要有一种改进的用于测定多核苷酸序列的方法，这种方法能极大地增高检测多核苷酸的速率以及片段大小，而且优选的不依靠对核苷酸的荧光标记。而且该方法可由自动化进程来执行，从而减少了与现存方法相联的复杂性和成本。

    发明概述

    本发明基于如下认识：当多核苷酸加工酶结合并且沿着靶多核苷酸推移时，酶的构象和/或质量和/或能量分布会发生变化，这一变化可以通过使用非线性光学成像技术进行检测，包括基于二次或三次谐波生成的非线性光学成像技术。

    根据本发明的一个方面，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤：

    (i)在足以诱导酶活性的条件下，将靶多核苷酸与固定在

    一固定位置上的多核苷酸加工酶相接触；和

    (ii)检测所述酶与多核苷酸相互作用的效果，所述效果用非线性光学信号或线性信号联合非线性信号的检测方法进行检测。

    本发明具有很多优点。测序只要少量的多核苷酸就可以进行，且可以测得单链多核苷酸分子，而且可以消除在开始测序前的扩增需求。可获得长的序列读取长度，而且可以最低限度地考虑二级结构。获得长的读取长度就不再需要经过计算对大量片段的重新组装。另外，由于本发明不依赖荧光标记的核苷酸或任何测量荧光的步骤，因此可以克服由于存在光褪色现象或其他不可预测的荧光效应所导致在单分子水平上的读取长度的限制。本发明同样允许用同一酶系统顺序地读取长多核苷酸片段。这样就具有如下优点，即允许在测定众多不同的多核苷酸模板序列时，单一酶系统可再生和重复使用。最后，使用不会带来光损失和光褪色效应的二次或三次谐波生成具备很多优点，这要归功于即使在焦平面上光化学反应也不会发生，这是因为由非共振性射线所激发的信号并不包含有限寿命的激活状态。

    根据本发明的第二个发面，固体支持材料包括至少一种聚合酶和至少一种定位于聚合酶上或接近聚合酶的位置的偶极分子。

    根据本发明的第三个发面，一种为测定非线形光学信号而建立的成像系统包括固体支持物，其上固定有一种与多核苷酸相互作用的酶，和一种定位于酶上或接近酶的位置的偶极分子。

    【附图说明】

    参考所附的附图来描述本发明，其中

    图1.一种使用二次谐波生成的成像系统的示意图。

    图2.显示特定核苷酸掺入时源自聚合酶的二次谐波生成。

    发明详述

    本发明使用常规的非线性光学检测方法来确定，当多核苷酸加工酶与靶多核苷酸上的单个碱基发生相互作用或当新生多核苷酸分子整合核苷酸时，酶的构象和/或质量和/或能量分布所发生的变化。

    使用非线性光学方法对分子进行成像的技术是本领域内熟知的。但在使用不可移动的或固定的酶时，这些方法能被应用于多核苷酸测序的方面则是未知的。

    在一个单独的实施例中，除了非线性信号还生成了线性信号，且该线性信号亦被检测。这两种信号的联合结果可以增强检测效果。

    这里使用的术语″多核苷酸″应以广义解释，包括DNA和RNA，包括修饰的DNA和RNA，DNA/RNA杂交分子，以及其他杂交的核酸样分子如肽核酸(PNA)。

    这里使用的术语″多核苷酸加工酶″应以广义解释，涉及任何能与多核苷酸相互作用并能沿着多核苷酸连续移动的酶。该酶优选为聚合酶，而且可以是任何已知的类型。例如，聚合酶可以是任何DNA依赖的DNA聚合酶。如果靶多核苷酸是RNA分子，则聚合酶可以是RNA依赖的DNA聚合酶，即逆转录酶，或RNA依赖的RNA聚合酶，即RNA复制酶。在本发明的一个优选的实施方案中，聚合酶为T4聚合酶。在本发明更优选的实施方案中，聚合酶为大肠杆菌(E.Coli)III型聚合酶全酶(McHenry，Ann.Rev.Biochem.，1988；57：519)；T7聚合酶(Schwager等.，Methods in Molecular and Cellular Biology，1989/90；1(4)：155‑159)，或复合有大肠杆菌硫氧还蛋白的噬菌体T7基因5聚合酶(Tabor等，J.Biol.Chem.，1987；262：1612‑1623)。每种聚合酶都能以高的加工能力(和忠实度)与靶多核苷酸结合，并因此甚至能在未发生有效聚合的时候，维持聚合酶‑多核苷酸复合体。

    能与多核苷酸相互作用的可选择性酶包括解旋酶、引发酶、全酶、拓扑异构酶或促旋酶。这些酶能提供更多的优点。例如，使用解旋酶可以减低存在于多核苷酸分子内的二级结构所引发的问题，因为解旋酶与其遭遇即可克服这些在自然环境里存在的结构。第二，解旋酶能够支持室温条件下双链DNA的必需反应。

    当酶与多核苷酸上的连续碱基相作用时，该酶的构象将会发生变化，该变化依赖于与其相接触的靶点上的碱基(或核苷酸)。这样，反应过程中碱基对增加的实时次序就可以在核酸单分子上进行检测，也就是说，待测模板多核苷酸上的酶系统活性可被实时地跟踪。通过鉴别借助酶催化活性而掺入靶多核苷酸增长的互补链中的碱基(核苷酸)，即可推断出序列。

    本发明的一种重要方面为将酶固定于一个相对成像系统固定的位置上。优选的将酶固定在一个固体支持物上，而同时保持其活性。将适当的酶固定在固体支持物的方法是本领域内熟知的。例如，WO‑A‑99/05315中详细描述了将聚合酶固定在固体支持物上的方法。将蛋白固定在支持物上的一般方法即为适用的。

    本发明中使用的光学检测方法是要在单分子水平上成像的，即产生针对一个酶的清楚的影象/信号。多个酶也能以允许单酶分辨率的密度固定在固体支持物上。因此，在一个实施例中，即有多个酶固定在固体支持物上，而且本发明的方法可由这些酶同时实施。这就允许不同的多核苷酸分子一齐进行测序。

    对本领域普通技术人员来说，在适于促进酶活性的条件下实施成像方法是显而易见的。例如，关于聚合酶，进行聚合酶反应必须的其他组分也是需要的，这一点是显而易见的。在这一实施例中，多核苷酸引物分子和每种三磷酸核苷dATP，dTTP，dCTP，dGTP即为所需要的。三磷酸核苷可以顺序的加入，且要在加入下一种三磷酸核苷之前去掉那些未结合的核苷酸。选择性地，所有三磷酸核苷也可以在同一时间加入。优选使用具有一个或更多保护基团的三磷酸核苷，其中保护基团以用脉冲调制的单色光来选择地将其去除，从而避免非控制性的结合。WO‑A‑99/05315中已经披露了适用的保护的三磷酸核苷。

    高分辨率的非线性信号成像系统是本领域熟知的。通常，对物质的非线性极化可以表示为：

    P＝X⁽¹⁾E¹+X⁽²⁾E²+X⁽³⁾E³+.....

    其中P代表诱导的极化，X⁽ⁿ⁾代表n次非线性易感性，E为电场矢量。第一项描述了正常吸收和光反射；第二项描述了二次谐波生成(SHG)，和频和差频产生；第三项描述了光散射，激发的拉曼过程，三次谐波生成，以及二光子和光子的吸收。

    本发明优选的成像系统依赖于检测二次或三次谐波生成所产生的信号。

    使用二次或三次谐波生成(下文称做SHG)的单分子方案是本领域所熟知的(Peleg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999；95：6700‑6704和Peleg等，Bioimaging，1996；4：215‑224)。

    成像系统的一般结构已经在Peleg等，1996，supra中进行了描述，图1中给出示意。参照图1，激光(1)作为照射源，产生的激光束随即通过偏光器(2)。激光束的一部分可直接通过非线性晶体(3)从而产生绿色光束以辅助校正激光束。光敏二极管(4)置于接近于光路的位置，以便提供监测生成的近红外强度的手段。滤光器(5)被置于显微镜的进口端前方，以阻止任何二次谐波进入显微镜。激光束被聚焦于包含固定化酶的固体支持物上，非线性信号被透镜(7)收集后用单色仪(8)进行检测。用IR滤光器屏蔽基本强度。信号通过光电倍增器被放大，使用脉冲平均器(boxcar averager)和信道综合器(9)进行平均和总合。随后将产生的信号传送入计算机(10)以产生影象。

    为了生成二次或三次谐波，需要在固定化酶上或其附近放置合适的标记。高度偶极分子适用于此目的(Lewis等.Chem.Phys.，1999；245：133‑144)。一个合适分子的例子为染料，特别是苯乙烯基染料(例如膜染色剂JPW1259‑由Molecular Probes提供)。绿色荧光蛋白(GFP)是″染料″或″标记″的另一个例子，其可以用于通过SHG成像。在这里使用时，GFP不但指野生型蛋白而且也指谱移的突变体(Tsien，Ann.Rev.Biochem.，1998；67：509和US5,777,079和US5,625,048)。其他适用的染色剂包括di‑4‑ANEPPS，di‑8‑ANEPPS和JPW2080(Molecular Probes)。

    偶极分子可被定位于多核苷酸(或其互补体，如果该偶极分子连接于三磷酸核苷和被用于聚合酶反应中)的单个碱基上。

    本发明的一个优选实施例中，酶，例如聚合酶，与GFP制备成重组融合体。GFP可被定位于酶的N‑末端或C‑末端(如果聚合酶欲与″滑动钳″缀合使用，则最好定位于C末端)。可选择的，只要酶活性可被保留，GFP则可定位于酶内任何位置上。

    本发明一个独立实施例中，非线性光学成像系统为拉曼光谱法或表面增强的拉曼光谱法(SERS)，对拉曼光谱法的概述可以从McGlip，Progress in Surface Science，1995；49(1)：1‑106中获得。

    用于激发拉曼系统的光学辐射优选为近红外辐射(NIR)。NIR激发具有降低周围介质或溶剂中的荧光和拉曼信号的优点。

    本发明一个独立实施例中，非线性信号可用金属纳米粒子和/或粗糙化的金属表面予以加强(Boyed等，Phys.Rev.，1984；B.30：519‑526，Chen等，phys.Rev.Lett.1981；46：1010‑1012和Peleg等，1996，同上)。一个信号增强型金属纳米粒子可被缀合在酶上(例如纳米粒子缀合抗体，Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1999；96：6700‑6704)，固定在固定化/定位化的酶附近或被带至非常接近SHG染色剂/酶的位置。

    金属纳米粒子增强与来自纳米级区域的SHG相关的光谱成像，因此就允许在单分子水平上改进成像。基于拉曼散射的光谱成像也能够通过使用金属纳米粒子来得到改进。适用的金属纳米粒子是本领域所熟知的，包括金和银纳米粒子。该纳米粒子的直径为5nm至100nm，优选为10nm至60nm。该纳米粒子可被连接于多核苷酸上(或其互补体，如果该纳米粒子连接于三磷酸核苷和被用于聚合酶反应中)。

    粗糙化金属表面同样可以改进SHG进程的灵敏度(Chen等，1981，同上，和Peleg等，1996，同上)，而且也是SERS所必需的。金属表面通常为银或其他贵金属。金属表面以次波长空间分辨率进行的初次选择性修饰可以用多种技术来实施，包括使用原子力显微技术(atomic force microscopy)(AFM)。涂覆铂的AFM针尖，可被用于催化叠氮化物末端到氨基基团的氢化，该氨基基团适合于进一步的衍生化反应(Muller等.，Science，1995；268：272‑273)。酶可被置于“热点(hot spot)”内，其中大量局域场存在于光模(optical mode)局域化的区域内(Scalaev等.Phys.Rep.，1996；272：61)。

    本发明一个独立实施例中，纳米粒子可用AFM悬臂针尖端/探针带至非常接近酶的位置，从而增强非线性信号。

    AFM最近被认为具有可应用于蛋白构象改变动力学成象的时间分辨率和灵敏度(Rousso等，J.Struc.Biol.，1997；119：158‑164)。这被应用于本发明的优选实施例中，其中AFM探针/尖端被定位于酶上，联合非线性光学信息(如SHG)，其被用于检测当酶沿着靶多核苷酸移动时，由于酶和所述核苷酸序列的相互作用而导致的蛋白构象变化。该信息可以用光学系统在远场收集，或者，如果与全部内部反射(totalinternal reflection)联用，也可以用反射方式收集。

    在更进一步的实施例中，非线性信号(例如SHG)可以用近场扫描光学显微技术(Near‑Field Scanning Optical Microscopy)(NSOM)在近场进行监控。NSOM是一种扫描探针显微技术，其利用纳米针头(如在AFM中所用的)和样本之间的光学交互作用以获取空间分辨光学信息。近场光学显微技术与SHG的联合应用已经得到广泛的研究，而且已经显示出具有原子水平上的表面敏感性(McGilp，1995，同上)。使用NSoM作为成像系统一个组成部分的主要优点在于，其可以允许分辨率被大幅增至次波长尺度。因为本发明涉及监控单个酶(如聚合酶)与多核苷酸相互作用时的构象，故次波长空间分辨率是非常需要的。在本发明的关于此方面的描述中，AFM悬臂尖端被用做无孔近场扫描显微镜是优选的(Sangohdar等，J.Opt.A：Pure Appl.Opt.，1999；523‑530)。类似的，可以使用金属纳米粒子作为局域场增强源。优选的，针头由贵重金属或其他任何能够增强局域电磁场的金属所制备，或涂覆。可选择的，金属纳米粒子可以直接连接至悬臂尖端上。已有报道显示其可以应用于监控单分子水平的构象变化(Rousso等，同上)。

    在本发明另一个独立的实施例中，一个独立生成的表面等离子(Surface plasmon)(或偏振子)/倏逝波场(evanescent field)可被用于增强非线性信号的信噪比。该倏逝波(evanescent wave)增强的成像技术比其他如SHG单独成像技术有更高的信噪比。在这一实施例中，来自标记酶的倏逝增强的SHG场信号可以用一NSOM纤维在同时获得AFM构象信息数据时于近场采集，同时，可以监测吸收的倏逝辐射以获得在倏逝波场和标记聚合酶/SHG场之间的联合量的信息。

    在这一方面(NSOM采集模式)中，系统即作为光子扫描隧道显微镜(PSTM)，且倏逝波场或表面等离子场被偶合至NSOM纤维探针尖端。任何通过聚合酶对到达探针尖端的信号的场强度的减弱都将借助定位于探针尖末端的探测器被监测到。

    表面等离子共振(Surface plasmon resonance)是本领域中熟知的，其依赖于使用一入射光照射入棱镜所产生的倏逝波。这一实施例中这一应用的典型装置包括棱镜以及与之光学耦联的以金属涂层的玻片，玻片上固定有酶。该玻片是微流流体室系统的一个组成部分，具有一个入口以导入配体(核苷酸)至固定的酶上。所述酶也被标记以便产生非线性效应。入射光束作用于棱镜以产生表面等离子场。同时，通过以下方式产生了非线性信号(如二次谐波场)，即，将脉冲调制的近红外激光通过偏光器和半波偏振片，进入光学扫描器，该光学扫描器通过滤片控制光束，从而消除光学二次谐波噪音，然后激光进入样品。使用透镜和滤光器采集非线性信号并将其送入单色器，再进入检测用的光电倍增管，将信号放大并记录在计算机系统中。

    当非线性光学信号与那些产生倏逝波场的相偶合时，被检测的信号也可以是线性的(倏逝)信号。在这一实施例中，NSOM可用于采集线性信号。

    在本发明一个独立的方面，多核苷酸测序可以在细胞内实施。

    已经证明，在其天然细胞环境中，DNA聚合酶以及与其关联的复制复合体被锚定(或被局域化)在胞内适当的位置上(Newport等，Curr.Opin.Cell Biol.，1996；8：365；和Lemon等.，Science，1998；282：1516‑1519)。这一天然锚定的复制复合体即类似于固定在固体支持物上的酶。

    这就允许在活体内的单分子水平上实时监测在DNA复制和/或细胞分裂期间发生的复制体相关分子构象的变化和模板序列相关的变化。

    为了实施这一内容，就需要修饰酶以便可以使用非线性光学检测技术予以成像。这种修饰可以通过将酶和，如绿色荧光蛋白(GFP)进行基因融合的方式完成。为了能够进行检测，细胞也应被固定。

    表达的融合蛋白可借助非线性光学检测方法(二次谐波生成)在其锚定的细胞内位置上得到监测/检测。

    下列实施例解释本发明

    在本实验中，借助本领域内熟知的重组技术来制备绿色荧光蛋白(GFP)和聚合酶的融合蛋白。

    石英芯片(直径14mm，厚度0.3mm)旋转涂以一层50nm厚的金，然后涂以一层平面葡聚糖。这些覆金石英芯片随即置于传统近场扫描光学显微镜(NSOM)的流体室中。该覆金石英芯片可借助指标机油(index matching oil)与石英棱镜完成光耦合。流体室随即被密封，然后使聚合酶缓冲液流过芯片。

    将聚合酶固定在芯片表面可以根据记载于Jonsson等.，Biotechniques，1991；11：620‑627中的内容来实施。芯片环境用操作缓冲液(10mM hepes，10mM MgCl₂，150mM NaCl，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)进行平衡。将等量的N‑羟基琥珀酰亚胺(0.1M水溶)和N‑乙基‑N’‑(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(0.1M水溶)混合在一起，然后经注射越过芯片的表面以激活羧甲基葡聚糖。聚合酶‑GFP融合蛋白(150μl)与10mM醋酸钠(100μl，pH5)混合经注射越过被激活的芯片表面。最后，将芯片表面上的残留N‑羟基琥珀酰亚胺与乙醇胺(35μl，1M水溶，pH8.5)反应，未结合的聚合酶就从芯片表面被洗脱掉。固定步骤于25℃使用连续的操作缓冲液流(5μl/min)完成。

    50μl抗体结合缓冲液(10mM MES pH6.0，150mM NaCl，3mM EDTA)于25℃流过在芯片表面固定的聚合酶/GFP，流速为5μl/min。一抗(GFP(B‑2)B生物素缀合200μl ml‑1，Santa Cruz Biotechnology)用抗体结合缓冲液稀释为1∶3000，继而以5μl/min的流速流经芯片表面30分钟。然后用抗体结合缓冲液以5μl/min的流速流经芯片表面30分钟以洗脱掉多余的抗体。

    二抗(免疫金缀合EM山羊抗小鼠IgG(H+L)40nm，British BiocellInternational)用抗体结合缓冲液稀释为1∶1000，继而以5μl/min的流速流经芯片表面30分钟。然后用抗体结合缓冲液以5μl/min的流速流经芯片表面30分钟以洗脱掉多余的抗体。该缓冲液随即返回至操作缓冲液，其将在开始下一步骤前以5μl/min的流速流经芯片表面30分钟。

    使用标准的亚磷酰胺生化方法合成两个寡核苷酸。示于SEQ IDNO.1中的寡核苷酸被用作靶多核苷酸，示于SEQ ID NO.2中的寡核苷酸被用作引物。

    SEQ ID NO.1

    CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG

    SEQ ID NO.2

    CTCTCCCTTCTCTCGTC

    该两个寡核苷酸于杂交条件下反应以获得靶序列‑引物复合物。该引物化的DNA随即悬浮于包含150μl能形成围绕引物DNA的滑动钳的β亚基的缓冲液(20mM Tri s‑HCl，pH7.5，8mM MgCl₂，4％(v/v)甘油，5mM二硫苏糖醇(DDT))。这一过程一般被称为预初始化(pre‑initiation)。

    为检测聚合酶的构象变化，一种使用牵拉石英多模态100μm长的纤维悬臂的修饰的NSOM被用于分支模式(tapping mode)。所述悬臂被驱动至接近其共振频率，然后对包含固定化抗体的芯片表面做一个初始区域扫描。二次谐波生成借助脉冲调制的近红外激光源的初始照射而由流体室中的固定化聚合酶产生。然后将NSOM探针头扫描在流体室中的芯片表面，以获取流体室中与聚合酶结合的40nm金粒子的影像。然后将探针头在聚合酶上保持为静止模式。

    预初始化的前引物化复合物随即以5μl/min的流速注入流体室中，从而使得环绕引物‑模板分子的“钳”与固定化的酶一起形成一复合物。然后使用流体室中的冷却设备将流体室保存在25℃。

    然后用操作缓冲液以500μl/min的流速连续冲洗流体室。10分钟后将0.4mM dATP(8μl)注入500μl/min流速的缓冲液中以启动测序反应。4分钟后向流体室中注入0.4mM dTTP(8μl)。然后再4分钟后注入0.4mM dGTP(8μl)，再4分钟后注入0.4mM dCTP(8μl)。将这一循环重复10次。这一完整的时间段内，借助多模态纤维进行传输的二次谐波信号经过单色仪而进入光电倍增器。从光电倍增器中出来的信号被放大并被输入计算机以备分析和存储。

    在每次注入开始10秒钟期间内的源自聚合酶复合体的二次谐波信号的强度改变被随后计算出来，根据注入流体室的核苷酸而绘制图形。测序反应的结果显示于图2中。从该图中可以看出，大的强度改变(更大的强度改变说明相互毗邻的为相同核苷酸)符合SEQ ID NO.1的互补序列(自右向左读，减去与引物序列杂交的那一部分)。