体外筛选得到的肝癌组织特异性粘附肽及其用途 技术领域
本发明涉及一种肿瘤导向治疗中的导向肽以及该导向肽的应用，尤其是涉及一种能特异性结合肝癌组织/细胞的粘附肽以及该粘附肽的应用，属于分子药理学技术领域。
技术背景
肝癌作为一种最常见的恶性肿瘤对人类健康造成了极大的威胁，据估计，全世界每年死于肝癌的患者达1 25万。目前用于肝癌治疗的方法主要有手术疗法、放射线疗法和化学疗法等，但这些方法对人体的健康组织和器官都存在不同程度副作用。
导向治疗技术为肿瘤的治疗开辟了广阔的前景。肿瘤导向治疗是指应用针对肿瘤特异性或相关抗原的单克隆抗体与杀伤肿瘤细胞的活性物质如：化疗药物、毒素、放射性核素等相偶联，将活性物质选择性地运送到肿瘤部位，定向杀伤肿瘤细胞的方法。肿瘤导向治疗作为近年来兴起的第四种肿瘤疗法即生物治疗法中的重要组成部分而受到了人们很大的重视。
关于利用噬菌体肽库技术对肿瘤组织特异性粘附肽的筛选，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上报道了该方法，并且利用该方法筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽。1997年他们成功筛选到一条对恶性黑素瘤和乳腺癌组织上地αV整合素特异性亲和的包含RGD的短肽，其与肿瘤细胞结合的特异性较与脑和肾正常组织结合高20倍以上；到目前为止，人们已发现多条特异性亲和人肿瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的两条短肽已在动物身上进行了抗肿瘤活性测定，抗癌效果良好。
在导向治疗中非常关键的在于如何筛选得到具有很强特异性的导向肽，目前噬菌体肽库技术是一种比较有效的筛选方法。噬菌体肽库技术自20世纪90年代诞生以来给探索生物大分子间相互作用的结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子以及给药物筛选、新型诊断试剂和疫苗等领域的研究带来了革命，其最大优点就是无需知道蛋白质的任何性质，就可筛选到特异性的结合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌体肽库技术筛选导向肽分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选法尤其在筛选组织或肿瘤组织特异性结合肽时有其明显的优越性：其一，噬菌体肽库进入机体的血液系统，在血液循环过程中可以去除大量与靶组织无关的噬菌体肽，经过多次重复操作后可以得到所需的组织或肿瘤特异性结合肽，其原理是不同的组织都有其特异细胞膜标志，如淋巴细胞的归巢、肿瘤细胞定向转移等；其二，在体内筛选到的是自然状态下的组织或肿瘤特异性结合肽，这在诊断和导向治疗中更有使用价值；其三，用体内筛选法经常能筛选到与肿瘤新生血管特异性结合的多肽，而肿瘤新生血管壁上存在着正常血管所没有或很少有的粘附分子，这些分子与肿瘤抗原相比其异质性和调变要少得多，也无需克服肿瘤的生物屏障，因此作为导向治疗的“弹头”有更多的优越性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能特异性结合肝癌组织/细胞粘附肽；本发明的另一目的在于提供该肝癌组织/细胞粘附肽的用途。
本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽，其多肽序列为：
序列一：NH2-T-A-C-H-Q-H-V-R-M-V-R-P-COOH
序列二：NH2-S-P-A-P-E-K-L-S-S-P-F-R-COOH
为得到上述肝癌组织/细胞粘附肽，本发明采取体外筛选方法。首先，用人肝癌细胞BEL-7402对噬菌体随机肽文库进行筛选，将得到的噬菌体肽扩增并纯化后，用人正常肝细胞L-02进行反向吸收，以去除非特异性的噬菌体肽，回收不与人肝脏细胞L-02结合的噬菌体并扩增完成一轮筛选。如此反复3轮，使噬菌体库中对肝癌细胞亲和力高而对正常肝细胞亲和力小的克隆得到富集。将第3轮得到的噬菌体单克隆化，随机挑取100个单克隆用细胞ELISA的方法进行鉴定。结果显示多数单克隆对人肝癌细胞BEL-7402有较高亲和力。选取亲和力高的阳性克隆用竞争ELISA、免疫荧光、流式细胞等方法来验证，通过荧光显微镜可以直接观察到阳性克隆与人肝癌细胞BEL-7402的结合。同时再将得到的阳性噬菌体克隆输到荷瘤裸鼠体内，通过不同组织的切片、免疫组化来确定其组织分布特异性，发现肿瘤组织吸附了较多噬菌体，验证了其导向效果，挑选阳性克隆，提取噬菌体DNA，测序，并分析测序结果。
本发明还提供：
序列一：NH2-T-A-C-H-Q-H-V-R-M-V-R-P-COOH
和 序列二：NH2-S-P-A-P-E-K-L-S-S-P-F-R-COOH
的肝癌组织/细胞特异性粘附肽在制备肝癌的导向药物中的应用。
本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，是一个很好的肝癌导向治疗中的粘附肽，具有较广阔的应用前景。
具体实施方式
在说明具体实施方式前，先对本发明要用到的材料和试剂以及试剂的配置进行简单的说明：
试验材料与试剂
(一)试剂
1.噬菌体展示随机12-肽文库，环状7肽库，购自美国New England Biolab公司
2.人肝脏细胞L-02：购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库
3.人肝癌细胞BEL-7402购自中国科学院上海药物研究所
4.兔抗噬菌体M13抗血清、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体：购自瑞典Pharmacia公司。
5.辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、碘化丙锭(PI)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)等购自美国SIGMA公司
6.硝酸纤维薄膜(NC膜)(美国进口分装)
7.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone购自英国OXOID公司
8.RPMI-1640干粉剂、新生小牛血清购自美国GIBCO公司
9.二甲基亚砜购自德国SERVA公司
10.胰蛋白酶由Difco进口分装
11.异硫氰酸荧光黄(FITC标记的山羊抗兔IgG)购自华美公司
12.IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，X-gal购自华美公司)
(二)试剂的配制
培养基：
1.大肠杆菌ER2738的LB培养基
(1)LB液体培养基：蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L；酵母粉(Yeast Extract)5g/L；NaCl 5g/L。加入适量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH将pH值调到7.0-7.5之间，最后用dH2O定容至1L，分装后高压灭菌。
(2)LB固体培养基：上述分装好的液体培养基加入1.5％的琼脂糖后再进行高压灭菌即可。
(3)LB选择培养基：将高压灭菌后的LB固体培养基加热完全溶解，待到冷却至50℃左右时加入四环素、IPTG、X-gal，小心摇动三角烧瓶充分混匀，注意掌握时间在培养基凝固之前浇制平板。
抗生素的配制：四环素储备液的配制：四环素(tetracycline)1000×：用50％乙醇溶解20mg/ml，-20℃避光保存。
(4)软琼脂：
蛋白胨(Bacto-Tyrptone) 10g/L
酵母粉(Yeast Extract) 5g/L
NaCl 5g/L
MgCl·6H2O 1g/L
琼脂 7g/L
2.细胞培养基
(1)RPMI1640培养基：
基本培养基：800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉剂溶解，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3调节pH至7.0，0.22um过滤除菌，-20℃保存。
完全培养基：
基本培养基 90％
56℃灭活30min的新生小牛血清 10％
双抗 100单位/ml
(2)D-hank’s母液(10×)：
NaCl 10g
KCl 0.4g
KH2PO4 0.06g
Na2HPO4 0.12g加三蒸水，定容到100ml，配好后，用5％NaHCO3调pH至7.0左右，高压灭菌，4℃保存。
(3)胰蛋白酶消化液：称250mg胰蛋白酶(1∶250，Difco进口分装)粉末于烧杯中，加入D-Hanks液至100ml，搅拌均匀，置室温4小时或4℃过夜，经常振摇使其完全溶解。用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装，每只1ml，-20℃保存。临用前解冻，不宜反复冻融。
(4)双抗：高温高压灭菌D-Hanks液，用5ml无菌D-Hanks溶解80万单位的青霉素钠，吸取5ml；另用5ml无菌D-Hanks溶解100万单位的硫酸链霉素，吸取4ml，补充无菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。
(5)细胞冻存液：
基本培养基 70％
小牛血清 20％
二甲基亚砜(DMSO) 10％
噬菌体纯化、DNA提取试剂配制：
(1)PEG-NaCl；
PEG8000 100g
NaCl 116.9g
加蒸馏水定容到 475ml
搅拌溶解(可以加热至65℃)，高压灭菌，终体积应为600ml，4℃避光保存
(2)TBS：1M Tris-HCl(pH7.5)5ml；NaCl 0.9g；加dH2O至100ml，高压灭菌
(3)NaI缓冲液：1M Tris-HCl Ph8.0-1mM EDTA-4M NaCl，室温避光保存ELISA试剂配制：
(1)洗板液：
10×pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)：
NaCl 80g
KH2PO4 2g
Na2HPO4·12H2O 29g
KCL 2g
加dH2O定容至1000ml。
洗板液PBST05和PBST5：
PBST05：pH7.4 PBS，0.05％Tween 20
PBST5：pH7.4 PBS，0.5％Tween 20
(2)封阻液：3％BSA：0.3g BSA，溶解于10ml PBST05
(3)固定液：3％多聚甲醛：30g多聚甲醛，1000mlPBS，加热溶解
(4)OPD底物缓冲液(PCS)：
柠檬酸 4.66g
Na2HPO4·12H2O 18.4g
dH2O加至1000ml，于4℃保存。
(5)OPD底物显色液：
PCS 9ml
30％过氧化氢 10μl
OPD 4mg
(6)酶终止液：2M H2SO4
荧光染色液：
PI 100ug/ml
TritonX-100 0.1％
柠檬酸三钠 0.1％
筛选前期的准备工作：
1.肝癌细胞及正常肝细胞的体外培养
肝癌细胞BEL-7402；正常肝细胞L-02均购于中国科学院上海生物化学与细胞研究所的细胞库。细胞在含1％双抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，以37℃，5％CO2传代培养。传代时采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷冻保存。
2.荷瘤裸鼠动物模型的建立及饲养
与中科院实验动物中心合作完成肝癌细胞株BEL-7402荷瘤裸鼠动物模型的建立。方法是采用2周龄裸鼠，腋下注射200μl约106个肿瘤细胞BEL-7402。4-6周后选用肿瘤直径达到1cm左右的荷瘤裸鼠进行体内筛选或体内鉴定。
3.噬菌体肽库筛选实验方法
3.1噬菌体的扩增
在含有四环素抗性的LB中过夜培养大肠杆菌ER2738，次日按照1∶10稀释后，37℃、230rpm剧烈振荡50分钟制备成感受态细菌。转入待扩增噬菌体克隆后37℃、230rpm剧烈振荡4.5～5小时。培养物4℃ 8000rpm离心15分钟去除菌体，取上清夜加入1/6体积的PEG-NaCl充分混合后置于4℃下沉淀过夜。沉淀过夜后溶液于4℃10000rpm离心20分钟。弃上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm离心10分钟以去除剩余的菌体，将上清夜转入到另一干净的小离心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小时，4℃ 10000rpm离心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒温20分钟。加入0.7％二甲基亚砜与0.02％叠氮化钠-70℃保存。
3.2噬菌体效价测定
按一定比例稀释待测噬菌体，取10μl稀释后噬菌体悬液与200μl感受态细菌充分混合后静置3-5分钟，与3ml顶层琼脂混和后迅速倒入37℃保温的IPTG/X-Gal平板，待冷却后37℃倒置培养过夜。次日对平板上蓝斑进行计数，按照以下公式计算效价：效价＝y×10x×102TU/ml(其中10x代表稀释度。y代表平板上蓝斑数目)
下面结合实施例详细说明具体的筛选步骤：
1、肝癌细胞的筛选
贴壁培养人肝癌细胞BEL-7402至铺满培养瓶底面(约12.5cm2)，加入无血清培养基继续培养1小时，用D-hank’s液洗去未贴壁及细胞分泌物，加入封阻液稀释的噬菌体(等量12肽和7肽库)1011约1ml孵育1～2小时。用PBST洗脱8～10次以除去未结合噬菌体，最后以pH2.2甘氨酸一盐酸缓冲液洗脱结合的噬菌体，中和后取2μl用于测效价，其余扩增，纯化后用于下一轮筛选。
2、正常肝细胞L-02反向吸收
贴壁培养人肝脏细胞L-02至铺满培养瓶底面(约12.5cm2)，加入无血清培养基继续培养1小时，用D-hank’s液洗去未贴壁及细胞分泌物，加入封阻液稀释的噬菌体1ml约1011个孵育1～2小时。吸出封阻液取2μl用于测效价，其余扩增，纯化后用于下一轮筛选。
3、噬菌体的单克隆化
完成3-4轮筛选和反向吸收后，选取最后一次筛选测效价平板中蓝斑数目介于10～100之间的平板，用灭菌牙签挑取单个蓝斑，随即放入含有1ml感受态细胞的15ml指管中，37℃、230rpm剧烈振荡4.5～5小时。培养物经PEG-NaCl纯化后保存并测序。可以看出通过三轮正向，两轮反向的筛选，目标噬菌体对于肝癌细胞产生了比较好的特异性吸附作用，同时L-02的反向吸收大大减少了噬菌体对于正常细胞的非特异性吸附。
4、细胞ELISA法鉴定筛选克隆
(1)选择生长状态良好的细胞，把人肝癌细胞BEL-740和人肝脏细胞L-02分别消化下来，记数后将细胞悬液浓度调至5×105cells/ml。分别加入96孔细胞培养板，使培养板上下两个孔分别对应相同浓度的肝癌和正常肝细胞。
(2)细胞板每孔加100μl细胞悬浊液，37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁，D-Hanks缓冲液清洗细胞后无血清培养基培养1小时。
(3)D-Hanks缓冲液清洗细胞后3％多聚甲醛固定1小时，每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100μl，37℃封阻1小时。
(4)洗板，即细胞板去上清液，每孔加PBST05 100μl，反复3次。再每孔加PBST5 100μl清洗2次。
(5)每孔加噬菌体单克隆，并留一孔不加噬菌体作空白对照。在37℃温育1小时
(6)每孔加一抗(兔抗噬菌体M13抗血清，1∶1000PBST05-1％BSA稀释)100μl，37℃温育2小时，如第(4)步洗板。
(7)每孔加二抗(羊抗兔酶标抗体，1∶10000PBST05-1％BSA稀释)100μl，37℃温育1小时，如第(4)步洗板。
(8)每孔加OPD底物显色液，振荡显色。待反应完全后加入终止液，每孔加酶终止液，终止显色
(9)细胞板3000rpm离心3分钟，将每孔中的上清显色液以在细胞板上同样位置转移到酶标板中，酶标仪490nm波长读数。从中挑选较高值的噬菌体。同时做空白对照及野生型噬菌体对照。
本发明采用的是线性12肽与环状7肽共同筛选的方法，进行了三轮肿瘤细胞筛选，同时用正常肝细胞进行了二轮反相吸收。筛选结束后将目标噬菌体单克隆化后随机挑取98个单克隆进行扩增、纯化。分别取等量噬菌体单克隆(1011)进行细胞ELISA的筛选和鉴定：即将等量体外培养的肝癌细胞BEL-7402和正常人肝脏细胞株L-02分别加入96孔细胞培养板中，使细胞贴壁并固定；将等量的目标噬菌体肽分别与肝癌细胞和正常肝细胞反应后，用免疫酶技术显色，酶标仪读取每个反应孔的OD490nm值了。
按下列公式计算每个目标噬菌体肽的特异结合系数：
结果发现每个噬菌体单克隆对于肿瘤细胞的结合均高于正常细胞(ELISA比值大于1)，显示筛选到的噬菌体肽与和人肝癌细胞BEL-7402有一定亲和性，筛选具有富集作用。同时做空白对照组(不加噬菌体)、阴性对照组(加入野生型噬菌体)，结果均低于目标噬菌体，野生型噬菌体对照组较不加噬菌体对照组ELISA值高，但在两种细胞中差别不大，表明噬菌体和细胞有一定的非特异性结合。
5、免疫荧光细胞化学法
(1)选取待鉴定噬菌体单克隆扩增、纯化。
(2)培养细胞培养至105左右，用D-hank’s缓冲液洗4遍，无血清培养基37℃培养细胞1小时。再次用D-hank’s缓冲液清洗细胞，用细胞刮刀刮下贴壁细胞，计数后稀释至相同浓度。
(3)取出酒精中浸泡的玻片自然风干，用蜡笔圈出加细胞的位置(使细胞集中在玻片中央)，将200μl细胞悬浮液滴加到玻片上，37℃培养箱放置。30分钟后，加3％多聚甲醛固定液200μl，固定10-20分钟，PBST05清洗3遍
(4)每片加PBST05-3％BSA封阻液200μl，37℃封阻1小时；加入噬菌体(PBST05-1％BSA稀释)，37℃温育1小时
(5)一抗(兔抗噬菌体M13抗血清稀释，PBST05-1％BSA1∶1000稀释)，37℃孵育1.5小时
(6)每孔加羊抗兔的荧光抗体和PI(PBST05-1％BSA，1∶100稀释)，振荡，冰育15分钟后荧光显微镜镜检，拍照。
分组及对照：亲和力高的噬菌体选3个，野生噬菌体做对照，人肝脏细胞L-02的对照。选取阳性较强的目标噬菌体肽克隆与体外培养的肝癌细胞BEL-7402和正常人肝脏细胞株L-02做荧光免疫鉴定。结果显示肝癌细胞BEL-7402和正常人肝脏细胞株L-02的细胞核均被核染料PI染为明亮的红色，加入目标噬菌体肽WP5，WP70、WP68的肝癌细胞样本中，均可看见细胞周围有一圈的绿色荧光；而在同样操作的正常肝细胞样本中大部分的细胞周围几乎未见绿色荧光。用野生型的噬菌体作同样实验，则肝癌细胞和正常细胞周围只有微弱的绿色荧光。可见筛选到的目标噬菌体与肝癌细胞有较好的特异性结合，与正常肝细胞几乎没有结合，这与细胞ELISA的结果是吻合的。
6、免疫组织化学法
(1)取出保存在3％甲醛中的样品，解冻用PBS冲洗并修正组织，切片，然后贴于载玻片，晾干，丙酮固定5分钟，PBST洗3遍，每遍3分钟。
(2)1％过氧化氢甲醇混合液室温处理30分钟，PBST洗3遍，每遍5分钟。
(3)5％脱脂奶粉室温封阻20分钟，加一抗(兔抗噬菌体M13抗血清1∶1000稀释)，37℃温育1h，PBST洗3遍，每遍5分钟。
(4)加入酶标二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)，37℃温育1小时，PBST洗3遍，每遍5分钟，DAB37℃温育12分钟，充分水洗，苏木素复染3min，自来水冲洗，加饱和碳酸锂，用酒精脱水，二甲苯3分钟透明，最后用中性树脂封片观察。
为了验证筛选到的阳性克隆在体内的导向效果，取噬菌体的混合物200微升(含噬菌体总量约1011)注射到裸鼠体内，取其个器官做组织切片，固定，封阻，先后加一抗、酶标二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)孵育，苏木素复染、显色，最后用中性树脂封片观察。细胞核被染成蓝色，噬菌体被染成黄褐色。结果显示：肿瘤组织结合了大量噬菌体，心、脾、肺等组织基本未与噬菌体结合，肾、脑、肝等组织特别是在这些组织的血管壁上也结合了一些噬菌体，但比肿瘤组织少。可见们体外用细胞筛选得到的噬菌体展示肽在体内也有较高的导向性。这些肽确实与肝癌细胞具有特异性的亲和力。
7、流式细胞法
(1)取长满的大瓶细胞，倒去培养液，D-hank’s液洗，无血清培养1小时，用D-hank’s液洗两遍，细胞刮刀刮取细胞，D-hank’s液打匀，1500rpm离心10分钟，弃去上清，加入PBS，细胞计数，调节细胞浓度为1×106/ml；
(2)取1ml细胞悬液，1500rpm离心10分钟，弃去上清，加入1mlPBST05-3％BSA 37℃封阻1小时，1500rpm离心10分钟，弃去上清
(3)加入1ml PBST05-1％BSA，再加入各个阳性噬菌体克隆10μl(1013pfu/ml)，37℃孵育1小时，1500rpm离心10分钟，弃去上清，PBS洗3遍；
(4)加入1ml兔抗噬菌体M13抗体(1∶1000，用PBST05-1％BSA稀释)，37℃孵育1小时，1500rpm离心10分钟，弃去上清，PBS洗3遍；
(5)加入FITC-羊抗兔抗体(1∶100，用PBST05-1％BSA稀释)，避光，4℃孵育1小时，PBS洗3遍，每个样品500μl。500目尼龙网过滤，流式细胞仪检测。
为了定量的检测目标噬菌体肽与细胞的结合特性，我们用流式细胞仪测定目标噬菌体肽与肝癌细胞BEL-7402和正常细胞的结合量。将1×106/ml培养细胞与1011/ml目标噬菌体肽反应后，用免疫荧光技术显色。对照为不加噬菌体的细胞、正常细胞的对照、不加荧光抗体的对照、加野生型噬菌体的对照。每个样品用流式细胞仪检测2000个细胞。流式细胞仪检测的结果表明：目标噬菌体肽的荧光明显强于野生噬菌体对照、正常细胞对照、不加噬菌体的对照。
8、噬菌体DNA的提取、测序
将需要测序的噬菌体单克隆化扩增，离心取上清液500μl，加入200μlPEG/NaCL，反复颠倒至混匀，室温静置10分钟，10000rpm离心去上清，然后低速离心，去除剩余上清。加100μl Iodide缓冲液将沉淀溶解，再加250μl无水乙醇室温孵育10分钟，这样可以使单链的噬菌体DNA沉淀而溶解噬菌体蛋白，10000rpm离心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE缓冲液溶解沉淀。样品送华大基因上海鼎安生物科技有限公司测序，结果经GENGRUNNER、CLONE MANNAGER等软件翻译、分析。得到两个多肽系列：
序列一：NH2-T-A-C-H-Q-H-V-R-M-V-R-P-COOH
序列二：NH2-S-P-A-P-E-K-L-S-S-P-F-R-COOH