血小板抗低温激 活的稳定作用 本发明涉及血液及血液成份领域，特别涉及血小板的功能和用途。具体说，本发明涉及血小板在贮存过程中的激活问题，并阐述了对不符合要求的激活作用和细菌感染必须加以控制。
【发明背景】
血液中的小板或血小板是人血液中的一个成分。它们对止血起着重要的作用。血小板形状通常为卵圆形至球状，直径为2-4μm，且含有大约60％蛋白质、15％脂质、和8.5％碳水化合物。血小板的化学组成包括血清素、肾上腺素、和去甲肾上腺素，每一种都在促进损伤部位血管的构造中起作用。血小板也包含一些血小板因子，包括血小板促凝血酶原激酶(这是一种脑磷脂型磷脂)和二磷酸腺苷，两者在血凝固作用中都很重要。维持血小板功能对于血库贮存中保存全血以及对保存浓缩的血小板成分是很重要的。
但是贮存血小板存在着一些问题。虽然用长期冷藏的办法来保持血液成分是能做到的，但血小板有低温激活的趋向，因而失去它的用途。为避免激活，可将血小板分成各个浓缩成分，在20℃下贮存。但这样又带来其它危险，即细菌感染以及发生代谢和酶反应，总称为“血小板贮存损害”。因而，血小板贮存一般仅限于5天。
发明概述
现已发现通过用已知为抗冻蛋白和抗冻糖蛋白的蛋白质处理血小板，可使血小板在足以控制细菌感染和血小板贮存损害的低温下长期贮存而没有早期激活的危险。目前有多种容易的处理方法，包括将血小板悬浮于所述蛋白质可溶解的液体溶液中使血小板可以在该条件下保存直到使用。因此降低了需要周期性更新血小板贮存的供应量，而周期性更新是满足各种要求中地一个难题。
为证明本发明而进行的试验表明，抗冻糖蛋白所达到的保护效果随所使用的抗冻糖蛋白的量而变化。试验也表明具有较高分子量的抗冻糖蛋白与具有相对低分子量的抗冻糖蛋白相比在给定的浓度下具有更大的保护效果。
根据下面的说明，本发明的上述及其它特征和优点将会更清楚。
附图简述
图1是由付立叶变换红外光谱数据绘制的图，表明人的血小板从凝胶至液晶相的转变。
图2表明如图1的相同数据，加上血小板激活百分率作为温度的函数所绘制的图。
图3是血小板激活百分率作为温度函数的曲线图，用和不用本发明处理的两种情况。
图4a是血小板激活百分率作为温度函数的曲线图，有和没有本发明处理的两种情况，包括不同程度的处理。
图4b是在两种温度下，根据本发明处理的血小板的激活百分率作为处理试剂浓度函数的曲线图。
图5是由付立叶变换红外光谱数据绘制的图，表明与图1相同的数据以及根据本发明处理的血小板的数据。
图6是荧光激活细胞分类数据的曲线图，表明标记蛋白从处理的和未处理的血小板中分泌的百分率。
图7是荧光激活的细胞分类数据的另一种曲线图，表明标记蛋白分泌百分率作为处理试剂浓度的函数。
发明的详细说明和优选的实施方案
自然界存在的称之谓“抗冻蛋白”、“热滞蛋白”、“抗冻糖蛋白”、和“抗冻多肽”的大分子物种是公知的，在文献中已有广泛报导。例如抗冻糖蛋白的发现首先由Devries,A.L.等人报导，“南极鱼的抗冷冻作用”(KreezingResistance in Some Antarctic Fishes)，《科学》(Science)163:1073-1075(1969年3月7日)。Devries等观察到各种不同种类的鱼在全年平均温度为-1.87℃的水中存活，尽管其血液中没有足够量的氯化钠和其它低分子量物质通过常规冰点降低法来降低其冰点。Devries等人将这些物种的生存归因于存在某些糖基化蛋白，其分子量范围大约2500至大约34000，称为抗冻糖蛋白或“AFGPs”。进一步的调查揭示北温带和北极鱼的很多物种其血液中携带有抗冻物质，其中一些化合物是糖蛋白而其它一些则没有糖基，因而被称为抗冻多肽或抗冻蛋白(“AFPs”)，分子量范围大约3300至大约12000。进一步说，尽管这些化合物降低了冰点，但熔点不受影响，因此称为“热滞蛋白”。
抗冻蛋白和糖蛋白已从很多不同来源中分离得到，而且文献中已广泛报导过这些来源和从中得到的各种蛋白质的结构。这些来源包括鱼类和非鱼类，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ。
表Ⅰ
鱼类中的热滞蛋白质蛋白质类型，组成和大小 鱼类来源 鱼种俗名抗冻糖蛋白(AFGPs): 南极鱼科：含有丙氨酸、苏氨酸和 Pagothenia borchgrevinkiGal-GalNAC二糖 Trematomus borchgrevinki 南极鳕鱼M.W.:2,600-33,700 Trematomus bernachii
Dissostichus mawsoni
北方海洋鳕类鱼：
Gadus agac 格陵兰鳕
Gadus morhua 大西洋鳕
Microgadus tomcod 大西洋小鳕
Boreogadus saida 北极鳕
Eligenus gracilis 远东宽突鳕抗冻多肽(AFPs),Ⅰ型： 右眼鲽富含丙氨酸； Pseudopleuronectus 美洲拟鲽M.W.:3,300-6,000 americanus
Limanda ferrugmea 美洲黄盖鲽
杜父鱼科：
Myoxycephalus scorpius 短角锯鲉
Myoxycephalus aenaeus 虻疮锯鲉
Myoxycephalus scorpiodes 北极锯鲉抗冻多肽(AFPs),Ⅱ型 杜父鱼科：富含半胱氨酸 Hemitripterus americanus 美洲绒杜父鱼同源于C型血凝素 Osmerus mordex 胡瓜鱼M.W:14,000-16,000 Clupea harengus harengus 鲱抗冻多肽(AFPs),Ⅲ型 绵鳚没有半胱氨酸且不富含丙氨酸 Macrozoarce americanus 海洋条鳕M.W:5,000-6,700 Rhipophila dearborni 南极绵鳚
Lycodes polaris 北极绵鳚
表Ⅱ
热滞蛋白质的非鱼类来源A．除甲虫之外的昆虫：
目 种
弹尾目 7 sPP.
翅目 Arcynopteryx compacta
直翅目 Parcoblata pennsylvanica(异翅木蠊)
半翅目 Oncopeltus fasciatus(美洲脊胸长蝽)
长翅目 Boreus westwoodi
鳞翅目 Choristoneura fumiferana(枞色卷蛾)B．鞘翅目(甲虫)：
科 种
拟步甲科 Tenebrio molitor(黄粉虫)
Meracantha contracta
Uloma impressa
Platydema sp.
叩头虫科 Ampedus lineatus
Ampedus sp.
Lepidotus discoideus
Melanotus sp.(梳爪叩头虫)
扁甲科 Cucujus clavipes(扁甲虫)
赤翅甲科 Dendroides canadensis
萤科 Photinus sp.(广额螳螂)
瓢虫科 Coccinella novemnotata(九星瓢虫)
棘胫小蠹科 Ips acuminalus(松六齿小蠹)
天牛科 Rhagium inquisitor(松皮天牛)C．非昆虫 节肢动物：
动物 种
蜘蛛 Philodromus sp.(逍遥蛛属)
Clubiona sp.(管巢蛛属)
Bolyphantes index
蜈蚣 Lithobius forficatus
蜱螨 Alaskozetes antarcticusD．其它无脊椎动物：
短齿蛤属 Mytilus edulis
被最为广泛研究，且被作为优选蛋白用于本发明的蛋白质是那些从鱼类分离出来的蛋白质。如表Ⅰ所表明的，这些蛋白质包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者分为三个一般类型，命名为Ⅰ型，Ⅱ型，和Ⅲ型。
尽管存在着各种变化，一般情况下AFGPs由一系列的三肽重复单元丙氨酰-苏氨酰-丙氨酰组成。同时双糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙酰基-D一半乳糖胺与苏氨酸残基的羟基连接。例如较小分子量的AFGP含有分别用脯氨酸和精氨酸残基替代一些丙氨酸和苏氨酸残基。对有代表性鱼种的AFGPs色谱研究已揭示出八个主要组分(片段)的分子量，如表Ⅲ所示。
表Ⅲ从Pagothenia borchgrevinki得到的AFGPs分子量组成片段编号 分子量
1 33,700
2 28,800
3 21,500
4 17,000
5 10,500
6 7,900
7 3,500
8 2,600
与AFGPs相比，AFPs互相之间的差别更大。如表Ⅰ所示，三种类型AFPs其残基含量相互都不同。Ⅰ型AFPs富含丙氨酸残基(大约65％)，其余大部分由极性残基如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成，分子量范围大约3,300至大约6,000。Ⅱ型AFPs被认为是富含半胱氨酸(实际上是半-半胱氨酸)残基，并且与C型植物凝血素同源。来自美洲绒杜父鱼的Ⅱ型AFPs含有7.6％半胱氨酸、14.4％丙氨酸、19％总量的天冬氨酸和谷氨酸、以及8％苏氨酸，分子量范围是大约14,000至大约16,000。Ⅲ型AFPs没有半胱氨酸残基，并且也不富含丙氨酸残基。任何特定的氨基酸显然都不存在明显的优势，氨基酸含量可在极性和非极性残基之间均匀分配。其分子量范围是大约5,000至大约6,700。此段中所有百分比均以摩尔为基础。
来自昆虫的抗冻蛋白主要是Ⅱ型AFPs，氨基酸残基的典型组成是那些来自鳞翅目(云杉芽虫)和拟步甲科(甲虫)的氨基酸残基。这些列于表Ⅳ，且Ⅳ也包括美洲绒杜父鱼的氨基酸组成作为比较。
表Ⅳ
Ⅱ型AFPs氨基酸成分的比较氨基酸残基 云杉芽虫组分Ⅱ 甲虫 美洲绒杜父鱼 Asx 9.5 5.3 10.7 Thr 6.0 2.3 7.9 Ser 13.0 11.1 8.2 Pro 5.0 0.0 6.7 Glx 11.0 12.4 9.1 Gly 15.0 11.4 8.1 Ala 8.0 5.0 14.4 1/2-Cys 6.0 28.0 7.6 Val 3.0 2.3 1.2 Met 0.0 0.0 5.4 Ile 1.2 1.0 1.7 Leu 6.5 2.2 6.2 Tyr 1.0 0.0 1.2 Phe 2.2 0.0 2.0 Lys 3.1 15.4 2.1 His 0.0 3.1 2.5Trp 0.0 0.0 2.8Arg 8.0 0.0 2.3
抗冻蛋白和糖蛋白可以通过常规方法从鱼或昆虫的血清或其它体液中提取。蛋白质的分离和纯化容易通过色谱法进行，并且通过吸附、沉淀和蒸发。文献中所公开的其它很多方法对本领域技术人员是显而易见的。
热滞蛋白也可以合成，或者通过常规化学合成手段，或者通过重组DNA的方法。形成这些蛋白质的基因其DNA编码序列已被阐明并已有广泛报导。例如参见Devries,A.L.等人的《生物化学》(J.Biol.chem.),246:305(1971)；Lin,Y.,等人的《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang,D S.C.,等人的《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y.,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl Acad.Sci.U.SA.)78:2825(1981)；Davies,P.L.,等《生物化学》79:335(1982)；Goarlie,B.，等《生物化学》259:14960(1984)；Scott,G.K.,等的《加拿大鱼类水生动物科学杂志》(Can.J.Fish.Aguat.Sci.)43:1028(1986)；Scott,G.K.等《分子学进展》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。将AFP基因成功地微量注射到非本种的其它物种也已有报导。参见，例如Zhu,Z.,等Angew.Ichthyol.1:31(1985)；Chourrout,D.等《水培技术》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman,R.A.,等的《美国鱼类科学学报》(Trans.Am.Fish.Soc.)116:87(1987)；Fletcher,G.L.,等的《加拿大鱼类水生动物科学杂志》45:352(1988)；Mac Lean,N.D.,等的《生物技术》(Bio Technology)5:257(1987)；Stuart,G.W.,等《发展》(Development)103:403(1988)；Mc Evoy,T.，等《水培技术》68:27(1988)；Ozato,K,等《细胞分化》(Cell Differ)19:237(1986)。
血小板可以根据常规技术分离和浓缩，如那些计数血小板用的方法用来分离血小板。根据这种技术，将血液收集于抗凝剂中，然后在制备富含血小板的上清液所选用的速度下离心。通过回收上清液，接着再进一步离心，可进行进一步的浓缩。其它方法是本领域技术人员公知的。
本发明用抗冻蛋白和糖蛋白处理血小板的方法是将血小板作为处理试剂在水溶液中的悬浮液进行温育。血小板成分是悬浮液的大约0.1mg/ml至大约1.0mg/ml，抗冻蛋白或糖蛋白的存在量优选为该悬浮液的大约0.1mg/ml至大约30mg/ml，更优选从大约0.5mg/ml至大约20mg/ml，最优选从大约0.5mg/ml至大约10mg/ml。该温育是在足够低的温度下进行以避免血小板被抗冻化合物激活，注意这些化合物在37℃有激活血小板的趋向。因此在这一温度或更高温度下生成的血小板在加入抗冻化合物之前要冷却到室温。
温育后，血小板可以保持在悬浮液中并冷却到低于20℃的温度直到使用前，或者在进一步浓缩或从悬浮液中回收后冷却。如果需要，可以将血小板冷却到或低于血小板经历自液晶相至凝胶相转变的热致相变温度。对于人血小板，该温度是大约17℃。为贮存目的优选的温度范围是大约1℃至大约10℃，最典型的贮存条件是大约1℃至大约6℃。当血小板需在临床使用时，最为优选的是在使用前立即用缓冲液在37℃将冷的样品稀释大约10倍而快速温热。用抗冻蛋白或糖蛋白处理血小板达到同等结果的其它方法对于血小板处理领域的技术人员来说是显而易见的。
下面的实施例是为了详细说明而不是限制本发明。实施例
通过不用真空的静脉抽取方法将人血采集到柠檬酸葡萄糖缓冲液(55mM柠檬酸、110mM柠檬酸钠、170mM葡萄糖)中。通过细心的离心，将富血小板血浆从缓冲液稀释的血液中提取出来。并用下面的溶液将血小板冲洗两次：
100mM NaCl
10mM KCl
10mM EGTA(乙二醇双(β-氨基乙醚)N,N,N′,N′-四乙酸)
10mM 咪唑
pH=6.8
通过付立叶变换红外光谱，用对称的CH2伸张频率对温度作图，测定血小板膜的相转变。制出的图见图1。在17℃出现频率位移的中间点，是该膜由凝胶至液晶相的转变温度。因为该温度正好对应于人血小板去稳定化的温度，这证明去稳定化作用是因为经过了相转变而引起的。
最初用形态学检定来测定血小板激活作为温度的函数。冲洗过的血小板在各种温度下温育1小时。然后用Karnovsky′s固定剂固定过夜并用Zeiss光学显微镜计数，使用100x物镜的Nomarski光学仪器。每一温育温度计数的血小板共计250个。如果血小板是球状的，或者有两个或多个假足，则它们被认为是“激活的”。如果血小板是盘状的并且有零至一个假足，则它们被认为是“静止”的。激活百分率对温度的制图见图2，其中圆点(●)代表激活百分率，而倒三角()是重复图1的数据。激活作用曲线证明激活百分率随温育温度的降低而增加。该图也表明激活作用增加最为陡峭处的温度是血小板膜相转变发生时的同一温度。
为了试验抗冻蛋白和糖蛋白对血小板激活的影响，用来自Trematomusbernachii的组分2-6和5-7混合的AFGP和来自Pseuclopleur Dnectusamericanus的AFPⅠ型进行试验。血小板以5×107个血小板/ml悬浮液的密度悬浮于抗冻化合物溶液中，在0℃至40℃的温度范围下，在抗冻化合物存在的浓度为每ml悬浮液有1至4mg化合物的条件下温育1小时，同时进行没有抗冻化合物的平行试验。
混合组分AFGP2-6的结果见图3，其中倒三角()代表用抗冻化合物进行的试验，圆点(●)代表没有用任何抗冻化合物进行的试验。该图表明在5℃的温育温度下，AFGP 2-6的激活程度降低43％。
在5℃下不同抗冻化合物之间的比较见下面的表Ⅰ。
表Ⅰ在5℃温育1小时后抗冻化合物对血小板激活百分率的影响
血小板激活百分率试验化合物 浓度(mg/ml) 用试验化合物处理 未处理 保护百分率 AFGP 2-6 1 37 80 43 AFGP 5-7 1 48 65 17 AFGP 5-7 4 34 65 31 AFP Ⅰ 1 44 69 25
图4a和4b说明保护作用随着抗冻化合物浓度增加的变化。在图4a中，在不同浓度下使用合并的成分AFGP 5-7，在5℃至37℃的温度范围温育1小时。图中的实心圆圈(●)代表在没有抗冻化合物情况下进行的对照试验，空方框(□)代表在0.2mg/ml浓度下进行的试验，实方框(■)代表在0.5mg/ml浓度下进行的试验，空心圆圈(○)代表在1mg/ml下进行的试验，空三角(△)代表在2mg/ml下进行的试验，实三角()代表在4mg/ml进行的试验。图4a中的数据表明，低于20℃时，随着AFGP浓度的增加，血小板激活百分率降低。图4b给出在5℃和15℃温育下剂量应答曲线表示的相类似数据。这些曲线表明，在这两种温度下，抗冻化合物浓度的增加导致激活百分率的降低，这意味着血小板保护百分率的增加。
为检测在正常激活条件下抗冻化合物实际上是否干扰血小板激活作用，将血小板在5℃下温育1小时后再升至37℃，在此温度测试到它们对凝血酶的激活反应。已经在1mg/ml AFGP5-7存在下温育过的血小板具有96％激活作用，而在相同温度下没有AFGPs条件下温育的血小板具有97％激活，差异不明显。结论是根据生态学试验的测定，AFPGs不干扰生理激活的级联系统。
为了证明抗冻蛋白对降低膜的相转变温度不起作用，用付立叶变换红外光谱测定存在AFGPs(2mg/ml AFGP5-7)和其不存在时的相转变温度。对称CH2伸张频率对温度的关系(即和图1所获数据的相同方式)见图5。这两条曲线表明它们没有明显区别，证明AFGPs不改变相转变温度。
上面的实验详细地说明了在冷冻过程中AFGPs对形态变化的急性影响。为研究在低于脂质相转变温度下血小板贮存过程中更细微的变化，使用了伴随激活作用的分泌标记。选择的标记是α-颗粒蛋白质，gp53。该蛋白质通常是在血小板胞质中膜结合的小泡中，但在激活过程中分泌到细胞表面。在一系列实验中，用Immunotech,Inc.(Westbrook,Maine USA)出售的对gp 53的荧光抗体检测到细胞表面存在该蛋白。通过荧光激活细胞分类检测荧光抗体与分泌的gp 53之间的相互作用。
图6给出分泌的标记物的百分数对形成血小板之后在5℃下温育天数的函数。在该图中，用来自Trematomus bernachii的AFGP混合成分5-7处理血小板，用空心方框(□)代表，其与用实心圆圈(●)所代表的没有用抗冻化合物处理的对照血小板相比较。这些数据表明两个体系中大约15％的血小板显示冷却后立即有gp53的分泌，其值只稍高于冷却前血小板所见到的值。在5℃保持7天后，将近50％的对照血小板显示出激活作用，而处理过的血小板保持在最初值15％。为实现该稳定化作用，将冷却的血小板很快进行回温。该回温是将冷却的血小板稀释到37℃的比较大体积(是贮存体积的10倍)的缓冲液中。这使血小板通过脂质相转变而快速温热，并且也稀释了AFGPs。
AFGPs的保护作用随着AFGP浓度而变化，这一点可从图7表明。图7是上面所使用的AFGP5-7相同组分在5℃贮存4天接着快速升温至37℃而得的。在1.5mg/ml的AFGP浓度时，分泌减少到大约5％。AFPGs对gp53分泌的影响在各个供体之间有明显的不同，但在所研究的每一种情况下，定性结果是相同的。
以上的阐述主要为详细说明本发明。本领域技术人员很清楚，这里所述的蛋白质、配比、处理方法以及本发明的其它参数的选择是可以作多种方式的改变或替代的，而并不超出本发明的构思和范围。