骨形态发生蛋白和羟基磷灰石复合剂型的制造方法 本发明属于生物医学材料领域。主要适用于制取骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型。
骨形态发生蛋白(bone morphogenefic protein，简称BMP)是一种具有独特诱导成骨功能的机体蛋白因子，在机体骨组织再生和修复过程中发挥关键作用，可使断骨快速再接，缺骨快速再生修复，在骨科和口腔科中具有广泛和应用前景。
目前，制备BMP有两种方法：一种是利用生化提取法直接从牛、马、猪、羊、兔、鼠等畜牲骨或骨肉瘤中提取混合型BMP；另一种是利用基因重组法合成单一型的人BMP。基因重组BMP的诱骨或骨活性强，比生化提取法制备的BMP高103-106倍。BMP虽具有很强的诱导成骨活性，但植入人体时，吸收代谢快，作用时间短，难以充分发挥其诱导成骨效应；另外，BMP在修复大尺寸骨缺损时无支架作用。因此，BMP在临床应用时还需要与某一载体材料复合，才以使其自身得到缓释与支撑。
羟基磷灰石(Hydoxyapatite，简称HA)是磷酸钙基生物陶瓷的一种，其化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，它是构成骨和牙的主要无机质，植入人体后，可在其表面与骨和软组织形成化学键合，具有良好的生物活性和生物相容性，是BMP理想的载体材料之一。将BMP与HA复合，既有利于BMP诱导成骨效应的充分发挥，又能使羟基磷灰石的骨修复作用得到加强。
在现有技术中，《材料科学技术百科全书》第742-743页报导了磷酸钙基生物陶瓷与骨形态发生蛋白复合材料及其制备方法。其制备方法是将BMP溶于4M的盐酸胍中，再将多孔羟基磷灰石陶瓷颗粒置于BMP盐酸胍溶液中，然后将混合物用去离子水透析，除尽盐酸胍；透析后的混合物在容器中经负压抽干，再经冻干后用环氧乙烷消毒，备用。
该制造方法并未详细介绍其工艺流程及相应的工艺参数，另一方面，该方法还存在如下不足之处：即盐酸胍的离子强度高，难以使BMP在羟基磷灰石表面吸附，导致BMP吸附率低，这种复合型材料植入人体时，带入的BMP量也少，BMP的积极效果得不到充分发挥。
本发明的目的在于提供一种成本低，载体材料吸附骨形态发生蛋白高的有关骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型的制造方法。
根据上述目的，本发明以尿素为媒体来实现骨形态发生蛋白与羟基磷灰石的良好复合，具体的艺步骤如下：
(1)将骨形态发生蛋白溶解于含有磷酸缓冲液地尿素中，形成含有骨形态发生蛋白的尿素溶液；
磷酸缓冲液的浓度为5-50mM，酸碱度为PH6-8，尿素的浓度为5-8M。
磷酸缓冲液的加入量(体积比)为尿素量的1-10％，
骨形态发生蛋白加入尿素中的加入量为：0.01-0.05mg/ml；
(2)将粒状的羟基磷灰石加入上述步骤所形成的含有骨形态发生蛋白的尿素溶液中，并在20-30℃温度下搅拌后，静置0.5-2小时；
羟基磷灰石的加入骨形态发生蛋白尿素溶液中的加入量为：0.1-1.0g/ml；
羟基磷灰石为颗粒状，其粒度为50-500μm。
加入后进行搅拌并静置一定时间，是使骨形态发生蛋白尽可能的都吸附在羟基磷灰石颗粒的表面，提高吸附率。
(3)将乙醇加入上述工艺所形成的含有羟基磷灰石和骨形态发生蛋白的尿素溶液中，混合均匀后，在-60--80℃，存置0.5-2小时，随后采用离心方法，去除溶液中的液体部分，获得沉淀物。即表面吸附骨形态发生蛋白的羟基磷灰石。
乙醇加入量为尿素溶液的的1.5-3倍
加入乙醇的目的是为了加速骨形态发生蛋白从尿素溶液中的析出，然后附着或沉积在羟基磷灰石表面，进一步提高吸附效率，
(4)将上述经离心分离所得沉淀物用温度为1-10℃的、浓度为85％的乙醇溶液冲洗2-3遍，之后再用温度为1-10℃、浓度100％的乙醇冲洗一遍，并凉干，无菌保存，即成为本发明所述的骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型。
两次用不同的浓度的乙醇对沉淀物进行冲洗，是为了将混沉淀物中的尿素完全冲洗掉。剩余的则为纯净骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、所制备的骨形态发生蛋白与羟基磷灰石的复合剂型植入人体后，可使骨形态发生蛋白得到有效的缓释，同时使骨的修复过程加快。实验显示，术后7-21天就有大量新骨和软骨形成，术后21后可见成熟骨和骨髓形成。
2、尿素的离降强度低，使骨形态发生蛋白易于吸附在羟基磷灰石颗粒的表面，即BMP吸附效率高，吸附量大，使BMP的作用得以充分发挥。
实施例
采用本发明所述的制造方法，制备了三批骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型。
首先将一定量的骨形态发生蛋白溶解于含有磷酸缓冲液的尿素中，骨形态发生蛋白的加入量、尿素剂量和浓度、磷酸缓冲液的剂量和浓度如表1所示。
接着在上述尿素溶液中加入粒状的羟基磷灰石，经进行搅拌后在-60--80℃静置一定时间，再离心分离，将溶液中的液体部分分离出去，得到沉淀物。羟基磷灰石的粒度、加入量，搅拌温度和静置时间如表2所示。
最后将所得的沉淀物用不同浓度的乙醇冲洗两次，并凉干，即得到骨形态发生蛋白与羟基磷灰石复合剂型。冲洗所用乙醇浓度、冲洗温度、冲洗次数如表3所示。
采用本发明实施例1所制备的BMP与HA复合剂型用于由于骨囊肿造成的骨缺损，经清理后，在骨缺损处充填该复合剂型，缝合，一个月后即基本愈合。表1实施例BMP加入量、尿素浓度及剂量、磷酸缓冲液浓度及剂量表2实施例羟基磷灰石粒度及加入量、搅拌温度及静置时间表3实施例冲洗沉淀物的乙醇浓度及温度