PCK型C4循环 【发明背景】
本发明涉及通过导入两种或多种参与C4光合途径的酶来转化C3植物从而为其提供C4循环的方法。
现有技术
已知在高等植物中存在三种类型的光合途径，即C3,C4和CAM型。具有C4型光合途径的植物(下文中有时称之为C4植物)的叶组织含有叶肉细胞和存在于维管束周围的维管束鞘细胞，形成被称作克兰茨型解剖(Kranz-type anatomy)的特殊的叶组织结构。C4植物利用位于叶肉细胞胞质中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下文中有时称之为PEPC)的作用将二氧化碳固定为C4化合物，被固定的二氧化碳由维管束鞘细胞中的脱羧酶释放，增加了核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(下文中有时称之为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶)附近的二氧化碳水平，所述酶是必不可少的二氧化碳固定所需的酶。通过位于叶肉细胞中的丙酮酸，正磷酸二激酶(下文有时称之为PPDK)的作用，同时消耗ATP可将因维管束鞘细胞中的脱羧化作用产生的代谢物转移到叶肉细胞中并转化为PEPC的底物-磷酸烯醇丙酮酸(下文有时称之为PEP)。即C4植物绿叶中两种类型的细胞在功能上有所分化；叶肉细胞是最初固定碳时C4化合物形成的场所，也是PEPC底物重新产生的场所，而维管束鞘细胞是利用卡尔文-本森循环(Calvin-Benson cycle)使C4化合物脱羧和进行必要地二氧化碳固定的场所。
三个步骤构成了被称为C4光合途径的循环反应系统，即由PEPC固定二氧化碳，在核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶附近释放二氧化碳，和消耗ATP的同时重新产生PEPC底物。所述途径使C4植物积累二氧化碳的能力有所增强，并使光合效率不致于降低，否则，由于ATP的过量产生会使C4植物在高光强度下的光合效率降低(避免了光抑制)。在具有规则的光合途径(C3型光合作用)的C3植物中未发现这些特性，因此，C4植物未表现出如C3植物中的光呼吸，故当置于干燥的空气，高光强度或高温下时，前者光合作用的效率比后者较不易恶化，因此C4植物在其进行光合作用的能力方面优于C3植物。
预期利用杂交和育种可将C4光合途径导入C3植物，然而，具有C4光合途径的大多数种和具有规则的C3光合途径的种被分成不同的属或科，难以在它们之间进行杂交。另外，通过使C3植物与选自相同属orache的C4植物杂交来导入C4植物之特性的尝试未能成功(Ohsugi,R.Nogyo-gijutsu(1995)vol.50,p30-36)。
Hudspeth等人观察到：导入受烟草叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(cab启动子)控制的PEPC基因的转基因烟草的绿叶显示出倍增或PEPC活性以及苹果酸水平的增加(Hudspeth等，植物生理学(1992)98:458-464)。Kogami等人观察到导入受花椰菜花叶病毒35S启动子控制的PEPC基因的转基因烟草的绿叶所含的PEPC活性约为未转化烟草的2倍(Kogami等，转基因研究(1994)vol.3:287-296)。
因此，Hudspeth等人和Kogami等人只观察到C4化合物苹果酸的积累，而未进一步证实将PEPC作为单个基因导入C3植物烟草而导致的光合特性中的任何变化。C3植物的细胞不能快速使C4化合物脱羧从而为卡尔文循环提供二氧化碳，因此，当需要改善C3植物的光合特性时，通过将PEPC基因简单地导入C3植物尝试为植物提供C4光合途径浓缩碳酸盐或避免光抑制的能力是不可能的。
日本专利公开特许8-80197公开了编码转运肽的DNA片断与烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)基因连接，将嵌合基因导入C3植物水稻，由此检测到绿叶粗提取物中的酶活性，并且将PCK蛋白定位于叶绿体中。这些事实表明：可以允许将PCK活性定位于叶绿体中，然而，有关C4光合途径的建立或转基因植物中光合特性的改变未见描述。
Ichikawa等人(Nihon Sakumotsu Gakkai Kiji,vol.63,Suppl.2,(1994),p.247)公开了当将PPDK导入C3植物芥菜(Arabidopsis)和番茄时，植物中积累了蛋白质，然而，有关C4光合途径的建立或转基因植物中光合特性的改变未见描述。日本专利公开特许6-12990中公开了其中掺入了碳酸酐酶(本文中有时指的是CA)蛋白质的Lycopersicon esculentum的具子叶的原生质体中光合效率的变化。另一方面，Majeau等人公开了体内过量表达CA不会使植物的光合能力产生任何改变(植物分子生物学，1994,25:337-385)。
如上所述，以前通过基因工程方法欲将源于C4光合途径的基因导入C3植物的尝试只局限于导入单个基因，即CA,PEPC,PCK或PPDK基因。即使在一些尝试中观察到被导入基因的表达或酶活性，但这些尝试不能进一步证实任何C4光合途径或光合效率的变化。
发明简述
本发明的目的是提供改良C3植物之光合特性的方法，具体地说，本发明提供了通过导入两个或多个参与C4光合途径的酶以转化C3植物，为其提供C4光合途径的方法。
本发明的另一个目的是提供已根据本发明方法被转化从而具有C4途径的植物。
本发明的另一个目的是提供用于进行转化C3植物的载体。
图的简述
图1图示了PCK型C4光合循环。
图2图示了用于C3植物转化的基因构建体。
图3为同位素标记的碳化合物的相对量对时间进程作图。
图4显示了经转化的水稻的光合活性。
详细描述
本发明人通过将PEPC基因以及与编码转运肽的DNA片断连接的PCK基因一起导入C3植物深入研究的结果完成了本发明。
本发明人致力于以下事实，即在以前的尝试中，C4光合组分的各个基因作为单个基因被导入C3植物的细胞质中，因此本发明人假定上述事实可能是为何即使一些转基因C3植物获得了经导入酶的活性，但以前的尝试不能驱动C4光合途径或改良光合特性的原因所在。
在所述设想的基础上，本发明人设计了以下系统，其中：以每种酶在限定的胞内位置处表达的方式将两种或多种酶的基因导入C3植物；叶绿体将担当C4植物维管束鞘细胞的角色；C4光合途径中需要的所述两种或多种酶将在绿色的叶肉细胞中同时表达。根据所述的设计，也许不仅可为C3植物提供各个酶活性，也可以使C3植物能够利用模拟C4植物的C4光合途径的循环反应，从而增强在叶绿体中积累二氧化碳的能力，并避免由过量消耗ATP导致的光抑制作用。预期提供了这种特性的植物因光合特性的改良会表现出改良的生产能力，改良的干旱耐受性，改良的高温耐受性，和在低二氧化碳条件下改良的光合特性。
本发明提供C4光合途径的方法包括：提供C3植物(如水稻)绿叶的叶肉细胞；使C4植物第一的二氧化碳固定过程的酶(PEPC)在所述细胞的细胞质中起作用；使C4化合物脱羧酶在所述细胞的叶绿体中起作用；和同时使酶表达以在所述细胞的细胞质或叶绿体中重新产生PEP。
用于所述目的的脱羧酶包括PCK,PCK是消耗ATP的同时使草酰乙酸脱羧以产生PEP的酶，因此，PCK可有利地用作脱羧酶，因为脱羧，ATP的消耗，和PEP的重新产生可由该单个酶实现。为了使脱羧酶在叶绿体中表现出其活性，可将此酶的基因与转运肽的序列连接。转运肽将脱羧酶多肽转移到叶绿体中以使酶在叶绿体中表现出其功能。
利用上文所述的转化，在C3植物中构成了二氧化碳固定途径，该途径模拟了得自C4植物分化的叶组织结构的C4光合途径，其中C3植物绿叶叶肉细胞的细胞质模拟C4植物的叶肉细胞，C3植物的叶绿体模拟C4植物的维管束鞘细胞(图1)，因此，可能为C3植物提供浓缩二氧化碳和避免光抑制的能力。
PEPC，脱羧酶和重新产生PEP的酶的联合足以构成所需的C4光合途径，然而，在优选的实施方案中，可在细胞质中共表达CA以提供碳酸氢盐离子作为PEPC直接的底物，以使C4光合途径更顺畅地行使功能。另外，如果作为PEPC底物的PEP的供应需要增加，则除了PEPC,PCK和CA外，也可共表达催化由丙酮酸形成PEP的PPDK，从而使C4光合循环仍能更顺畅地行使功能。
下文将更详细地描述本发明。
本发明涉及通过将编码PEPC的基因，已与编码转运肽的DNA片断连接的编码PCK的基因导入C3植物以转化所述植物，为其提供C4光合途径的方法。
可用于本发明的PEPC基因包括得自细菌，原生动物，植物等的PEPC基因，已知的细菌PEPC基因的具体的例子是棒状杆菌属产生谷氨酸之菌株的PEPC基因(日本专利特许公报7-83714)。
然而，优选的PEPC来源于植物，例如优选的那些PEPC得自玉米(日本专利特许公报6-30587),Amaranthus(Rydzik,E．和Berry,J.O.，植物生理学，1995,110:713),Flaveria trinervia(Poetsch,W等，FEBS Lett,1991,292:133-136)，烟草(Koizumi,N等，植物分子生物学，1991,17:535-539)，大豆(日本专利公开特许6-319567)，油菜(日本专利公开特许6-90766)，马铃薯(Merkelbach,S等，植物分子生物学，1993,23:881-888)，苜蓿(Pathariana,S.M等，植物分子生物学，1992,20:437-450),Mesembryanthenum crystallinum(Cushman,J.C和Bohnart,H.J，核酸研究，1989,6743-6744)，尤其优选玉米的PEPC。
用于本发明的PCK编码基因的例子是得自植物和细菌的依赖于ATP的PCK编码基因，植物PCK的例子包括得自Urochloa panicoides(日本专利公开特许8-80197)和黄瓜(Kim,D.J和Smith,S.M，植物分子生物学，1994,26:423-434)的PCK，细菌PCK的例子包括得自大肠杆菌(Medina,V等，细菌学杂志，1990,172:7151-7156)和根瘤菌属(Osteras,M等，细菌学杂志，1995,177:1452-1460)的PCK，优选得自植物，尤其是得自Urochloa panicoides的PCK基因。
另外，如上所述，需要PCK在叶绿体中表现出其功能。为了确保这一点，可将编码转运肽序列的DNA片断与PCK基因连接。
在定位于叶绿体的蛋白质中已报道了一些可与PCK基因连接的转运肽序列(Keegstra,K等，Annu.Rev.Plant Mol.Biol,1989,40:471-501)。本发明中优选转运肽序列得自水稻蛋白质，尤其优选转运肽序列是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位的序列(SEQ ID NO:2)，根据下文实施例中所述的方法可得到该序列。编码转运肽序列的DNA片断在框内与PCK结构基因在其上游，优选在其立即上游处连接。
在本发明中，编码CA的基因可进一步地被导入C3植物的细胞质中以提供碳酸氢盐离子作为上述PEPC的底物。
已知的可用于本发明的一些编码CA之基因的例子为得自动物和植物的那些基因，然而，高等植物和其它生物体的CA之间的序列同源性不高，而且，高等植物的CA的酶活性受无机磷酸盐的影响(Sultemeyer,D等，Physiol.Plant,1993,88:179-190)，因此，优选基因得自植物，如菠菜(Bumell等，植物生理学，1990,92:37-40)，豌豆(Roeske,C.A和Ogren,W.L，核酸研究，1990,18:3413)，芥菜(Arabidopsis)(Raines,C.A等，植物分子生物学，1992,20:1143-1148)，水稻(WO95/11979)和玉米(WO95/11979)，特别优选CA得自菠菜，因为菠菜CA位于叶绿体中，该酶基因含有转运肽编码区，因此，通过如实施例1所述诱导点突变可除去转运肽编码区SEQ ID NO:3，并将具有SEQ ID NO:3所示序列的基因用于基因构建。
本发明中所用的编码PPDK的基因包括玉米C4型PPDK基因(Matsuoka,M等，生物化学杂志，1988,263:11080-11083)，水稻PPDK基因(日本专利公开特许7-184657),Flaveria pringlei PPDK基因(Rosche,E等，植物分子生物学，1994,26:763-769),Mesembryanthemumcrystallinum(Fisslthaler,B等，Planta,1995,196:492-500)，优选玉米C4型PPDK基因。
PPDK基因可以在叶绿体中表达，也可在细胞质中表达。如果需要在叶绿体中表达PPDK基因，基因可与编码转运肽的DNA片断连接。
尽管优选特异于光合器官的启动子序列，但可用于表达上述酶基因的启动子序列并不局限于任何特定的种类，例如，优选玉米C4型PPDK启动子(Glackin等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3004-3008)，玉米C4型PEPC启动子(Hudspeth,R.L和Grula,J.W，植物分子生物学，1989,12:579-589)，水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位启动子(Kyozuka,J等，植物生理学，1993,102:991-1000)，和收集光的叶绿素a/b结合蛋白启动子(Sakamoto,M等，植物细胞生理学，1991,32:385-393)是优选的，特别优选的是玉米C4型PPDK启动子。在下文的实施例中，将SEQ ID NO:1用作启动子。
根据本发明，在用于转化C3植物的各个基因构建体(导入基因的构建体)上可携有编码上述各个C4途径酶的基因。然而，优选导入C3植物以实现其转化的基因-导入的单个构建体上携有两个或多个该基因，在这种情况下，对基因的次序没有特别的限制。
根据标准方法，通过将基因-导入的构建体导入选定C3植物的细胞中，即可用这种含有分开的或互相连接的衍生基因的基因-导入的构建体转化C3植物细胞。导入基因的一般性方法是本领域中已知的方法，如电穿孔，电注射，用如聚乙二醇(PEG)化学处理和基因轰击。其中优选使用农杆菌方法导入基因以转化C3植物细胞。农杆菌属方法是本领域中熟知的方法，能转化双子叶植物(日本专利公开特许4-330234)和单子叶植物(WO94/00977)。通过下文所述的方法可选择成功的转化体。
通过任何适当的常规的育种方法可固定转化体的表型，因此，被导入的基因可转移到转化体的后代中。
本发明的方法可适用于任何C3植物，所述方法对如水稻，小麦，大麦，大豆，马铃薯，烟草，油菜等的作物特别有利，而预期由于光合能力的提高会使每份干重的生产能力增加。优选本发明适用于单子叶植物，最优选适用于水稻。
本发明的C4光合途径由三个过程构成，即由上述PEPC固定二氧化碳，通过脱羧酶在核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶的附近释放二氧化碳，和利用ATP重新产生PEPC的底物。
下文实施例中将详细描述确证C4光合途径在被转化的C3植物中行使功能的方法。简单地说，所述方法包括：
(1)当使转化体和对照植物分离的叶掺入放射性的二氧化碳(14CO2)时，研究作为最初产物的C4化合物是否由转化体中的PEPC作用而形成，或通过检测标记的碳化合物随时间推移的比例而研究导入的C4光合途径是否在转化体中行使功能；
(2)使转化体和对照植物分离的叶掺入放射性的苹果酸([14C]苹果酸)，在确定的时间之后比较转化体和对照植物标记的蔗糖的相对量，从而研究C4化合物的脱羧作用是否在转化体中通过PCK作用而行使功能；和/或
(3)通过测量光合特性研究转化体光合特性中的任何变化。
实施例
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
A.PCK型C4光合途径
实施例1转基因的构建
(1)启动子序列
通过PCR法(Mcpherson,M.J,Quirke,P和Taylor,GR编，PCR：操作方法，Oxford Express Press,Oxford NY(1991))得到谷物(corn)C4型PPDK启动子区的DNA片断，所述PCR利用了根据已知的核苷酸序列(Glackin,C.A和Grula,J.W(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3004-3008)制备的下列两个合成引物：
5’-CTAAAGACATGGAGGTGGAAG-3’(5’侧)(SEQ ID NO:4)
5’-GTAGCTCGATGGGTGCACG-3’(3’侧)(SEQ ID NO:5)。
通过SDS-苯酚法，接着使用氯化铯-溴化乙锭超速离心从玉米近交B73绿叶中提取总核酸可得到玉米基因组DNA，使用所述DNA为模板进行扩增。将所得DNA片断插入质粒载体pCR1000(Invitrogen,USA)的克隆位点中，用SacⅠ消化所得质粒并使之成为钝端，然后在其中加入NcoⅠ接头，用HindⅢ消化后，将所得的含有PPDK启动子区的950bp DNA片断用于基因构建，SEQ ID NO:1显示出其中所用的DNA序列。
(2)PEPC基因
使用通过盐酸胍法由玉米秧苗(杂交品种“Harvest queen”)的绿叶和λZAP载体(Stratagene,USA)制备的mRNA可得到cDNA文库，根据所附手册中给出的说明，使用下列合成寡核苷酸为探针，通过筛选所述文库中的20,000个克隆可分离出玉米C4 PEPC的cDNA，所述寡核苷酸是通过常规方法(Sambrook,J,Fritsch,E.F和Maniatis,T编：分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))，根据已知的核苷酸序列(Hudspeth,R.L和Grula,J.W(1989)，植物分子生物学，12:579-589)制备得到的，其序列为：
5’-GCCATGGCGCGGCGGGAAGCTAAGCACGGAAGCGA-3’(SEQID NO:6)
用XhoⅠ消化所得克隆，然后用NcoⅠ部分消化，在基因构建中使用所得的约为3kbp的DNA片断。
(3)PCK基因
将Urochloa panicoides PCK的cDNA用于基因构建体中，以前曾报道过在该构建体中加入了编码水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位转运肽的区域(日本专利公开特许8-80197)，即在其插入物中存在的KpnⅠ位点处将λPCK170204和λPCK100101连接起来。通过使用所得DNA片断为模板，使用下列合成引物进行PCR:
PCK-f2:5’-GCTCTAGATCTCTGGCACGTGAATATGGCCCCAACCTCG-3’(SEQID NO:7)；和
PCK-r2:5’-CAGTGCATGCCGCCGAACAGGCATACAGATTTACACCAG-3’(SEQ ID NO:8)。
分别地，通过PCR法，使用根据水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位序列(Matsuoka等，植物细胞生理学，29:1015-1022(1988))合成的下列引物：
TP-f1:5’-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC-3’(SEQ ID NO:9)知
TP-r1:5’-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3’(SEQ ID NO:10)可分离出编码水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位转运肽的DNA片断。模板是通过SDS-苯酚法由日本水稻品种“Nihonbare”的绿叶中制备的水稻基因组DNA。
使用扩增的DNA片断为模板，使用下列合成的引物：
TP-f2:5’-GGAATTCCATGGCCCCCTCCGTGATGG-3’(SEQ ID NO:11)和上述引物TP-r1再次进行PCR。接着，将通过用XbaⅠ和SphⅠ部分消化经PCR扩增的PCK cDNA片断得到的约2kbp的DNA片断与通过用NcoⅠ和XbaⅠ消化经第二次PCR扩增的转运肽序列DNA片断得到的约150bp的片断(由SEQ ID NO:2表示)连接，所得的约为2.2kbp的DNA片断被用于基因构建。
(4)CA基因
通过将含有菠菜CA cDNA区域的1.8kbp的片断(用HindⅢ和KpnⅠ消化以前报道过的λ噬菌体克隆(λLCA48)(Bumell,J.N等，1990，植物生理学，92:33-40)得到的)插入pBluescriptSK-(Stratagene,USA)的HindⅢ/KpnⅠ位点可得到载体。从此cDNA中缺失编码转运肽的区域，所述转运肽参与CA至叶绿体的转移。为了实现缺失的目的，将转运肽区域中最终的氨基酸残基由丝氨酸转变为甲硫氨酸以使点突变可导入NcoⅠ识别位点，使用下列合成的寡核苷酸：
5’-GGTGGCACAGATAACCATGGATCCAGTTAGCCGACGGTGGC-3’(SEQ ID NO:12)和Mutan-KTM(Takara Shuzo有限公司)可进行突变。用NcoⅠ消化携有突变的所得质粒，籍此可从中缺失编码转运肽的区域。然后用SphⅠ消化此质粒，将所得的约700bp的DNA片断用于基因构建，SEQ ID NO:3显示出所述片断的序列。
(5)终止子序列
所用终止子序列是通过用SalⅠ和EcoRⅠ消化pBI121(Jefferson,RA.(1987),Plant Mol.Biol.Reptr,5:387-405)得到的NOS终止子区的DNA片断，和通过用SphⅠ和EcoRⅠ消化pGL2(Bilang,R等，1991，基因，100:247-250)得到的35S终止子区的DNA片断。
(6)构建导入的质粒
将启动子，cDNA和所得的终止子DNA片断组合并按下述方式连接，然后插入pBluescriptⅡSK-(Stratagene,USA)的HindⅢ-EcoRⅠ位点之间以构建质粒(用于导入单个基因的质粒，见图2)。
·PPDK启动子∷PEPC cDNA∷NOS终止子(pDPN)
·PPDK启动子∷CAc DNA∷35S终止子(pDCS)
·PPDK启动子∷PCK cDNA∷35S终止子(pDKS)。
另外，用ClaⅠ消化pDKS，使之成为平端，然后用XbaⅠ消化，将所得DNA片断插入pDPN的经SmaⅠ和XbaⅠ消化的位点处，得到携有两个基因，即PEPC和PCK的质粒pPK(见图2)。接着，用SmaⅠ消化pDCS,在其中加入HindⅢ接头，用HindⅢ消化后，将所得DNA片断插入pDPN的HindⅢ位点，从而得到质粒pCP。另外，用ClaⅠ消化pDKS，使之成为平端，然后用XbaⅠ消化，将所得DNA片断插入pCP的经SmaⅠ和XbaⅠ消化的位点处，得到携有三个基因，即CA,PEPC和PCK的质粒pCPK(见图2)。接着，用XbaⅠ消化pPK，然后用HindⅢ部分消化，从而得到约7.5kbp的DNA片断，同时用XbaⅠ消化pCPK，然后用HindⅢ部分消化，从而得到约9.5kbp的另一个DNA片断。将这些DNA片断分别插入pSB11(Komara,T等，植物学杂志，1996,10:165-174)的经XbaⅠ和HindⅢ消化的位点处，从而构建了超二元的中间体质粒pSPK和pSCPK。
将这些载体各导入E.coli LE392菌株中，然后通过与农杆菌LBA4404/pSB4和E.coli HB101/pRK2013的三亲本交配进行对农杆菌的导入和同源重组(Komari,T等，植物学杂志，1996,10:165-174)，从而得到质粒pSB4PK和pSB4CPK。
(7)构建携有CA,PEPC,PCK和/或PPDK的载体
用HindⅢ和EcoRⅠ消化通过如上所述的PCR法得到的具有PPDK启动子区的质粒载体pCR1000(Invitrogen,USA)，然后插入其中已缺失了SacⅠ位点的pBluescript ⅡSK-(Stratagene,USA)的HindⅢ和EcoRⅠ位点之间，然后用SacⅠ消化所得产物并使之成为平端，接着，在其中插入含有Ricinus communis过氧化氢酶的第一个内含子的约200bp的片断(通过用BamHⅠ和SalⅠ消化pIG221(Ohta等：在烟草中构建和表达在编码序列内含有内含子的β-葡糖醛酸酶(GUS)报道基因，植物细胞生理学，31:805-813(1990))，接着使之成为平端而得到)，从而得到含有PPDK(catⅠ)启动子的质粒pSK-Di，然后用NdeⅠ消化此质粒，接着使之成为平端，从而得到其中插入了NcoⅠ接头的另一个质粒pSK-Di2。
通过常规方法(Sambrook,J等，文献同上)，使用λZAP载体(Strata-gene,USA)可制备cDNA文库，通过使用根据已知的核苷酸序列(Matsuoka,M,Ozeki,Y,Yamamoto,N,Hirano,H,KanoMurakami,Y和Tanaka,Y：由cDNA序列推定的玉米丙酮酸，正磷酸二激酶的一级结构，生物化学杂志，163:11080-11083(1990))制备的下列合成寡核苷酸：
5’-TAGCTCGATGGGTTGCACGATCATATGGAGCAAGG-3’(SEQ IDNO:13)筛选上述cDNA文库可分离出玉米C4 PPDK的cDNA。另外，使用根据已知的序列(Sheen,J：玉米丙酮酸，正磷酸二激酶基因示差表达的分子机理，植物细胞，3:225-245(1991))制备的下列合成引物：
5’-TTTCATATGGCGCCCGTTCAATGTGCGC GTTCGCAGAGGGTGTTCCACTTC GGCAA-3’(5’侧)(SEQ ID NO:14)；和
5’-GTACTCCTCCACCCACTGCA-3’(3’侧)(SEQ ID NO:15)，通过PCR法(Mcpherson,M.J等，文献同上)扩增分离的玉米PPDK cDNA可得到约250bp的DNA片断。用NdeⅠ和SacⅡ消化此片断，用此片断取代上述PPDK cDNA的NdeⅠ和SacⅡ位点之间的区域，接着，用NdeⅠ和ClaⅠ消化，将所得的约2.9kbp的DNA片断用作基因构建中的PPDK cDNA。
使用质粒pPGA643A(Gynheung AN,Paul R.Ebeft,Amitava Mitra andSam B.HA：二元载体，植物分子生物学手册A3:1-19(1988))中所含的基因7终止子作为终止子区，通过用ClaⅠ和KpnⅠ消化pPGA643(GynheungAN等，文献同上)可得到基因7终止子，将该终止子插入pBluescriptⅡSK-(Stratagene,USA)的ClaⅠ和KpnⅠ位点之间可得到质粒，用KpnⅠ消化此质粒并使之成为平端，在其中加入XbaⅠ接头，用ClaⅠ和XbaⅠ消化后，将所得DNA片断用于基因构建。
将PPDK cDNA和基因7终止子插入pSK-Di的NdeⅠ和XbaⅠ位点之间，从而得到含有PPDK基因的质粒pSK-DiDT。
将通过用XbaⅠ消化然后用NcoⅠ部分消化上述pDPN得到的约3.4kbp的DNA片断插入pSK-Di2的NcoⅠ和XbaⅠ位点之间，从而得到含有PEPC基因的质粒pSK-DiPN。
将通过用NcoⅠ和XbaⅠ消化上述pDKS得到的约2.4kbp的DNA片断插入pSK-Di2的NcoⅠ和XbaⅠ位点之间，从而得到含有PEPCK基因的质粒pSK-DiKS。
将通过用NcoⅠ和XbaⅠ消化上述pDCS得到的约1kbp的DNA片断插入pSK-Di2的NcoⅠ和XbaⅠ位点之间，从而得到含有CA基因的质粒pSK-DiCS。
将SmaⅠ接头插入pSK-DiPN的XhoⅠ位点，然后用SmaⅠ消化，将所得的约4.5kbp的DNA片断插入pSK-DiCS经PstⅠ消化的位点处，使之成为平端，从而得到质粒pSK-CiPi。缺失了pSK-DiDT的XbaⅠ位点之后，在质粒的XhoⅠ位点加入XbaⅠ接头，用XbaⅠ和NotⅠ消化该质粒，将所得的约4.8kbp的DNA片断插入质粒pSK-CiPi的XbaⅠ和NotⅠ位点之间，得到质粒pSK-CiPiDi。在pSK-CiPiDi的XhoⅠ位点加入NotⅠ接头，用NotⅠ进行消化以得到约12kbp的DNA片断。用HindⅢ和EcoRⅠ消化pSB11(Komari,T等，植物学杂志，10:165-174(1996))并使之成为平端，接着，在其中加入NotⅠ接头。在此NotⅠ位点插入约12kbp的上述DNA片断，从而得到质粒pSBmCiPiDi。在pSK-DiKS的XhoⅠ位点加入XbaⅠ接头，用XbaⅠ进行消化，将所得的约3.3kbp的DNA片断插入pSBmCiPiDi的XbaⅠ位点，得到质粒pSBmCiPiKiDi。
通过在携有质粒pSBmCiPiKiDi的E.coli DH5a菌株，农杆菌LBA4404/携有pSB4和携有pRK2013的E.coliHB101菌株中的三亲本交配进行对农杆菌的导入和同源重组(Komari,T等，文献同上)，得到质粒pSB4CiPiKiDi。
实施例2转化体的构建
在水稻转化的整个研究过程中使用了Japonica水稻(品种为“Tsukinohikari”)。
通过先前描述的电穿孔法(日本专利公开特许8-80197)构建了其中已导入pDPN,pDKS和pDCS的水稻转化体。
通过文献中描述的农杆菌法(Hiei,Y等，1994，植物学杂志，6:271-282)构建其中导入了pSB4PK,pSB4CPK和pSB4CiPiDiKi的水稻转化体。
在空调温室(光照期：16小时，白天：28℃，夜晚：23℃)中培养这些转化体。
实施例3检测酶蛋白质并测定酶活性
用1ml冰冷的提取缓冲液(50mM HEPES-KOH pH7.0,10mM氯化镁，2mM氯化锰，1mM丙酮酸钠，1mM磷酸，1mM EDTA,0.1％2-巯基乙醇，20％甘油，1mM苯甲基磺酰氟，1mM苄脒，1mM 6-氨基-正己酸，0.2％(w/w)异抗坏血酸，和2％(w/v)polyclar AT)匀浆转化体或对照水稻(“Tsukinohikari”)约0.1g的绿叶，4℃下以15,000×g离心匀浆物20分钟，然后穿过室温下已用柱缓冲液(50mM HEPES-KOHpH7.0,10mM氯化镁，2mM氯化锰，1mM EDTA,0.1％2-巯基乙醇，和20％甘油)平衡的NAP5TM柱(Pharmacia,Sweden)使所得的上清液脱盐，从而得到粗的提取液。通过以前报道的方法(Wintermans和deMots(1965)Biochem.Biophys.Acta 109:448-453)测定匀浆物中叶绿素的含量，同时通过使用Protein Assay KitTM(BioRad,USA)测定粗提取物中蛋白质的含量。
按下述通过Western印迹检测转化体中酶的表达，以将蛋白质浓度调节为相同水平的方式对上文所得的粗提取物进行SDS-PAGE。将凝胶中分离的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜(Schleicher&Schull，德国)上，使用兔抗玉米PEPC蛋白，Urochloa panicoides PCK蛋白，菠菜CA蛋白或玉米PPDK蛋白的抗血清，与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG(OrganonTeknika,USA)和AP Immun-Blot Assay KITTM(Bio-Rad,USA)检测各个蛋白质的表达。
通过使用1ml含有25mM HEPES-KOH(pH8.0),5mM硫酸镁，4mM二硫苏糖醇，5mM碳酸氢钾，0.25mM NADH,1mM葡萄糖-6-磷酸，5mM烯醇丙酮酸磷酸，1U苹果酸脱氢酶(Boehringer Mannheim，德国)和25μl粗提取物的反应混合物测量340nm下NADH吸收降低的速率可测定PEPC的活性。
通过使用1ml含有25mM HEPES-KOH(pH8.0),4mM二硫苏糖醇，0.2mM草酰乙酸，1U丙酮酸激酶(Boehringer Mannheim，德国),0.2mMATP和50μl粗提取物的反应混合物测量280nm下草酰乙酸吸收降低的速率可测定PCK的活性。
通过在0.3ml用溴百里酚蓝染色的50mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.0)和10μl粗提取物中加入0.5ml冰冷的，用二氧化碳饱和的水，并测量反应混合物在冰上颜色消失所需的时间可测定CA活性。根据以前报道的方法(Burnell,J.N和Hatch,M.D(1988)，植物生理学，86:1252-1256)计算活性。
通过使用1ml含有25mM HEPES-KOH(pH8.0),10mM二硫苏糖醇，10mM碳酸氢钾，8mM硫酸镁，5mM氯化铵，2.5mM磷酸二氢钠，1mM ATP,1mM葡萄糖-6-磷酸，5mM丙酮酸钠，0.2mMNADH,2U苹果酸脱氢酶，2U PEPC(Wako Pure Chemical Industries，日本)和200μl粗提取物的反应混合物测量340nm下NADH吸收降低的速率可测定PPDK的活性。
实施例4用14CO2进行示踪实验
分离在空调温室中培养的水稻转化体和对照(“Tsukinohikari”)的叶尖(约5cm)，用浸满水的脱脂棉覆盖切下的每个叶尖。将这些样品放置在由本发明人自制的同化室(容量约为120ml或50ml)中，在约27,0001×的照射下，以约5升/分钟的流速通过空气达30分钟后，将通过在不漏气的注射器中混合100-180μl 60％高氯酸和50-70μCi NaH14CO3溶液(Amersham，英国)产生的放射性二氧化碳气体注射到密闭的系统中。5秒的脉冲后，将叶在液氮中冷冻以停止任何生物活性，然后将叶放入80％热乙醇中约30分钟以提取可溶性物质。脉冲5秒后，将空气导入系统，10,30和90秒后，从同化室中取出叶样品并浸入液氮中以停止任何生物活性，然后在80％热乙醇中提取可溶性物质。将所得的各个提取物在蒸发器中蒸发，并在Funaseru SF Cellulose Thin Layer PlateTM(FunakoshiJapan,20cm×20cm)上进行二维薄层层析。
室温下，通过使用苯酚-水-冰醋酸-0.5M EDTA(47∶84∶5.5∶1.14,v/v)的混合物作为主要的显色溶剂，溶液A(正丁醇∶水，74∶5,v/v)与溶液B(丙酸∶水，9∶11,v/v)等体积的混合物作为次要的显色溶剂来进行显色。完成显色之后，使层析板干燥，接着用Bioimage Analyzer Bas 1000System(富士胶片，日本)进行放射自显影以测定每个点的相对量，从而检查了被放射性同位素标记的物质比例。
实施例5用[14C]苹果酸进行示踪实验
分离空调温室中培养的水稻转化体和对照(“Tsukinohikari”)的叶，将叶放入10mM磷酸盐缓冲液(pH6.4)中，然后以27,000 1×照射1小时，接着，将这些叶放入100μl其中已加入5μl 1μCi[14C]苹果酸(Amersham，英国)的溶液中，确定的时间之后，取出叶样品，然后取出浸在溶液中的部分，将之浸入煮沸的80％乙醇中以停止任何生物活性，煮沸30分钟以从中洗脱可溶性的物质，在蒸发器中蒸发洗脱物，通过二维薄层层析分离经放射性同位素标记的物质，接着用Bioimage AnalyzerBas 1000 System进行放射自显影以测定每个点的放射性，从而检查了被放射性同位素标记的物质的相对量。
实施例6测量光合活性
将空调温室中培养的导入了3个基因的水稻转化体和对照(“Tsukinohikari”)转移到生长培养箱(光照期：12小时，照明：约35,0001×,25℃)中培养以适应环境，然后用光合测定系统(LI-6200,LI-COR，美国)测定未显示出衰老迹象的完全张开的叶的光合活性。
实施例7生产具有PCK型C4途径的转基因水稻和检测数据
产生上文制备的各个基因构建体的转化体个体，并通过Western印迹检查转基因的表达。在19个其中导入了基因构建体pDPN的水稻转化体(PEPC转化体)中，在15个转化体中进一步证实了PEPC蛋白质的表达。在31个其中导入了基因构建体pDKS的水稻转化体(PCK转化体)中，在20个转化体中进一步证实了PCK蛋白质的表达。在41个其中导入了基因构建体pDCS的水稻转化体(CA转化体)中，在3个转化体中进一步证实了CA蛋白质相对高水平的表达。在21个其中导入了基因构建体pSB4PK的水稻转化体(两种基因的转化体)中，在12个转化体中进一步证实了两种蛋白质，即PEPC和PCK的表达。在40个其中导入了基因构建体pSB4CPK的水稻转化体(三种基因的转化体)中，在15个转化体中进一步证实了三种蛋白质，即CA,PEPC和PCK的表达。在72个其中导入了基因构建体pSB4CiPiKiDi的水稻转化体(四种基因的转化体)中，在22个转化体中进一步证实了四种蛋白质，即CA,PEPC,PCK和PPDK的表达。
由这些显示出导入酶的相对高表达水平的水稻转化体制备R1子代，然后检查绿叶粗提取物中每种酶的活性，表1显示了结果。表1清楚地表明：R1代转化体的粗提取物中导入酶的活性比对照水稻(“Tsukinohikari”)中的高。这些事实表明由转化体中被导入基因表达的酶表现出它们的酶活性。此实施例中所用的用于PCK导入的基因构建体为嵌合基因，其中加入了编码水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位之转运肽的区域，这一点类似于以前的报道(日本专利公开特许8-80197)，因此，因转运肽的作用，PCK蛋白可位于叶绿体中。
表1：水稻转化体中的酶活性
酶活性(U/mg叶绿素)
CA PEPC PCK PPDKCA转化体 18,760 0.458 0 未测PEPC转化体 2,250 1.880 0 未测PCK转化体 1,364 0.474 7.744 未测2种基因的转化体 2,143 1.171 5.780 未测3种基因的转化体 9,269 1.071 3.001 未测4种基因的转化体 9,450 1.490 3.170 0.37对照(Tsukinohikari) 2,171 0.322 0 0.29
为其中导入了两种和三种基因的水稻转化体和对照(Tsukinohi-kari)的R1子代植株的叶切片提供14CO2,5秒后，停止组织中的生物活性，检测经标记的C4化合物的相对量，结果发现转化体中经标记的苹果酸和经标记的天冬氨酸的含量分别约比对照样品中的高约10倍和约2倍(见表2)，这些事实表明导入的PEPC在转化体的绿叶组织中起作用以使其中进行了C4光合途径中的初次二氧化碳固定过程。
表2：14CO2示踪实验
14CO2摄取(％)
苹果酸 天冬氨酸
(Tsukinohikari) 0.7 0.9
2种基因的转化体 9.8 2.0
3种基因的转化体 8.1 1.9
对其中导入了两种，三种或四种基因的水稻转化体以及水稻对照(Tsukinohikari)和玉米对照的R1子代植株的叶切片提供14CO2达5秒，随后，随时间的推移追踪经标记的C4化合物的行为。在水稻转化体中，经标记的C4化合物与玉米(即C4植物)中的类似而有所减少。与之形成对照的是水稻对照中经标记的C4化合物未显示出任何显著的变化(见图3)，这些事实表明在水稻转化体中，由导入的PEPC固定的二氧化碳形成的C4化合物立即被代谢成其它物质，这与在C4植物绿叶组织中观察到的现象类似。
为其中导入了两种和三种基因的水稻转化体和对照(Tsukinohi-kari)的R1子代的叶切片提供[14C]苹果酸，15分钟后，停止组织中的生物活性，检测经标记的化合物比例，结果发现转化体中经标记的蔗糖的相对量约比对照样品中的高约3倍(见表3)，这些事实表明导入的PCK在水稻转化体的绿叶组织中起作用以使二氧化碳由C4光合途径中的C4化合物传递给卡尔文-本森循环(Calvin-Benson cycle)。
表3:[14C]苹果酸示踪实验
[14C]摄入蔗糖(％)
对照(Tsukinohikari) 6.2
2种基因的转化体 15.7
3种基因的转化体 22.5
改变提供给叶的二氧化碳的浓度，同时测定其中导入3个基因的水稻转化体和水稻对照(Tsuki no Hikari)的R1子代的光合活性，将光合速率对细胞间的二氧化碳浓度作图(见图4)。结果，在假定表观光合活性消失的点处(即图4线之X轴上的截距)，转化体细胞间二氧化碳的浓度低于水稻对照中的相应浓度，这一事实意味着水稻转化体的CO2补偿点低于对照的相应补偿点。通常，C4植物显示出低于C3植物的CO2补偿点，因此，可得出结论：本文构建的水稻转化体与水稻对照相比，其光合特性类似于C4植物。
上文所述的结果表明其中导入2个和3个基因的水稻转化体含有与C4光合作用相关的酶的活性形式，所述酶是导入基因的表达产物，另外，C4光合途径在这些植物中起作用以增强光合效力，因此，本发明能使PCK型C4光合途径在C3植物中起作用，从而改变光合效力。
本发明效果
根据本发明，可在C3植物的叶肉细胞中驱动类似于C4植物之C4光合途径的循环反应，以赋予C3植物提高叶绿体中二氧化碳浓度的功能和另一种可避免因ATP的消耗而导致的光抑制的功能。由于光合效力有所增强，预期获得这些功能的植物可提高每份干重的产量，改良对干旱的抗性，改良对高温的抗性，改良对高光强度的耐受性并增强低二氧化碳条件下的光合效力。
序列表(2)SEQ ID NO:1的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：930个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅵ)来源：
(A)生物体：Zea mays
(B)种子：近交B73
(ⅸ)特征：C4型PPDK基因启动子区域(部分)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：CTAAAGACAT GGAGGTGGAA GGCCTGACGT AGATAGAGAA GATGCTCTTA GCTTTCATTG 60TCTTTCTTTT GTAGTCATCT GATTTACCTC TCTCGTTTAT ACAACTGGTT TTTTAAACAC 120TCCTTAACTT TTCAAATTGT CTCTTTCTTT ACCCTAGACT AGATAATTTT AATGGTGATT 180TTGCTAATGT GGCGCCATGT TAGATAGAGG TAAAATGAAC TAGTTAAAAG CTCAGAGTGA 240TAAATCAGGC TCTCAAAAAT TCATAAACTG TTTTTTAAAT ATCCAAATAT TTTTACATGG 300AAAATAATAA AATTTAGTTT AGTATTAAAA AATTCAGTTG AATATAGTTT TGTCTTCAAA 360AATTATGAAA CTGATCTTAA TTATTTTTCC TTAAAACCGT GCTCTATCTT TGATGTCTAG 420TTTGAGACGA TTATATAATT TTTTTTGTGC TTACTACGAC GAGCTGAAGT ACGTAGAAAT 480ACTAGTGGAG TCGTGCCGCG TGTGCCTGTA GCCACTCGTA CGCTACAGCC CAAGCGCTAG 540AGCCCAAGAG GCCGGAGTGG AAGGCGTCGC GGCACTATAG CCACTCGCCG CAAGAGCCCA 600AGAGACCGGA GCTGGAAGGA TGAGGGTCTG GGTGTTCACG AATTGCCTGG AGGCAGGAGG 660CTCGTCGTCC GGAGCACAGG CGTGGAGAAC GTCCGGGATA AGGTGAGCAG CCGCTGCGAT 720AGGCGCGTGT GAACCCCGTC GCGCCCCACG GATGGTATAA GAATAAAGGC ATTCCGCGTG 780CAGGATTCAC CCGTTCGCCT CTCACCTTTT CGCTGTACTC ACTCGCCACA CACACCCCCT 840CTCCAGCTCC GTTGGAGCTC CGGACAGCAG CAGGCGCGGG GCGGTCACGT AGTAAGCAGC 900TCTCGGCTCC CTCTCCCCTT GCTCCATATG 930(2)SEQ ID NO:2的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：153个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA-mRNA
(ⅵ)来源：
(A)生物体：Oryza sativa
(B)品种：Nihonbare
(ⅸ)特征：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶小亚单位的转运序列区
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：ATG GCC CCC TCC GTG ATG GCG TCG TCG GCC ACC ACC GTC GCT CCC TTC 48Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe 1 5 10 15CAG GGG CTC AAG TCC ACC GCC GGC ATG CCC GTC GCC CGC CGC TCC GGC 96Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly
20 25 30AAC TCC AGC TTC GGC AAC GTC AGC AAT GGC GGC AGG ATC AGG TGC ATG 144Asn Ser Ser Phe Gly Ash Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met
35 40 45CAG TCT AGA 153Gln Ser Arg
50(2)SEQ ID NO:3的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：697个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA-mRNA
(ⅵ)来源：
(A)生物体：Spinacia oleracea(ⅸ)特征：无转运肽编码区的碳酸酐酶mRNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：CC ATG GAG TTA GCC GAC GGT GGC ACA CCA TCC GCC AGT TAC CCG GTT 47 Met Glu Leu Ala Asp Gly Gly Thr Pro Ser Ala Ser Tyr Pro Val
5 10 15CAG AGA ATT AAG GAA GGG TTT ATC AAA TTC AAG AAG GAG AAA TAC GAG 95Gln Arg Ile Lys Glu Gly Phe Ile Lys Phe Lys Lys Glu Lys Tyr Glu
20 25 30AAA AAT CCA GCA TTG TAT GGT GAG CTT TCT AAG GGC CAA GCT CCC AAG 143Lys Asn Pro Ala Leu Tyr Gly Glu Leu Ser Lys Gly Gln Ala Pro Lys
35 40 45TTT ATG GTG TTT GCG TGC TCA GAC TCC CGT GTG TGT CCC TCG CAC GTA 191Phe Met Val Phe Ala Cys Ser Asp Ser Arg Val Cys Pro Ser His Val
50 55 60CTA GAT TTC CAG CCC GGT GAG GCT TTC ATG GTT CGC AAC ATC GCC AAC 239Leu Asp Phe Gln Pro Gly Glu Ala Phe Met Val Arg Asn Ile Ala Asn
65 70 75ATG GTG CCA GTG TTT GAC AAG GAC AAA TAC GCT GGA GTC GGA GCA GCC 287Met Val Pro Val Phe Asp Lys Asp Lys Tyr Ala Gly Val Gly Ala Ala 80 85 90 95ATT GAA TAC GCA GTG TTG CAC CTT AAG GTG GAG AAC ATT GTC GTG ATT 335Ile Glu Tyr Ala Val Leu His Leu Lys Val Glu Asn Ile Val Val Ile
100 105 110GGA CAC AGT GCT TGT GGT GGA ATC AAG GGG CTT ATG TCT TCT CCA GAT 383Gly His Ser Ala Cys Gly Gly Ile Lys Gly Leu Met Ser Ser Pro Asp
115 120 125GCA GGA CCA ACC ACA ACT GAT TTT ATT GAG GAT TGG GTC AAA ATC TGC 431Ala Gly Pro Thr Thr Thr Asp Phe Ile Glu Asp Trp Val Lys Ile Cys
130 135 140TTG CCT GCC AAG CAC AAG GTG TTA GCC GAG CAT GGT AAT GCA ACT TTC 479Leu Pro Ala Lys His Lys Val Leu Ala Glu His Gly Asn Ala Thr Phe
145 150 155GCT GAA CAA TGC ACC CAT TGT GAA AAG GAA GCT GTG AAT GTA TCT CTT 527Ala Glu Gln Cys Thr His Cys Glu Lys Glu Ala Val Asn Val Ser Leu160 165 170 175GGA AAC TTG TTG ACT TAC CCA TTT GTA AGA GAT GGT TTG GTG AAG AAG 575Gly Asn Leu Leu Thr Tyr Pro Phe Val Arg Asp Gly Leu Val Lys Lys
180 185 190ACT CTA GCT TTG CAG GGT GGT TAC TAC GAT TTT GTC AAT GGA TCA TTC 623Thr Leu Ala Leu Gln Gly Gly Tyr Tyr Asp Phe Val Asn Gly Ser Phe
195 200 205GAG CTA TGG GGA CTC GAA TTC GGC CTC TCT CCT TCC CAA TCT GTA 668Glu Leu Trp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ser Val
210 215 220TGAACCAACA CAACCATTTG ACTGCATGC 697(2)SEQ ID NO:4的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:
CTAAAGACAT GGAGG TGGAAG 21(2)SEQ ID NO:5的资料：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:
GTAGCTCGAT GGGTGCACG 19(2)SEQ ID NO:6的资料：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:
GCTCTAGATC TCTGGCACGT GAATATGGCC CCAACCTCG 39(2)SEQ ID NO:8的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
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CAGTGCATGC CGCCGAACAG GCATACAGAT TTACACCAG 39(2)SEQ ID NO:9的资料：
(ⅰ)序列特征：
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(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GGAATTCCAT GGTGCATCTC AAGAAGTAC 29(2)SEQ ID NO:10的资料：
(ⅰ)序列特征：
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(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
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GCTCTAGACT GCATGCACCT GATCC 25(2)SEQ ID NO:11的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
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GGAATTCCAT GGCCCCCTCC GTGATGG 27(2)SEQ ID NO:12的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:
GGTGGCACAG ATAACCATGG ATCCAGTTAG CCGACGGTGGC 41(2)SEQ ID NO:13的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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TAGCTCGATG GGTTGCACGA TCATATGGAG CAAGG 35(2)SEQ ID NO:14的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：56个碱基对
(B)类型：核酸
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(D)拓扑结构：线性
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:TTTCATATGG CGCCCGTTCA ATGTGCGCGT TCGCAGAGGG TGTTCCACTT CGGCAA 56(2)SEQ ID NO:15的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(合成的)
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