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1、(10)申请公布号 CN 102869983 A(43)申请公布日 2013.01.09CN102869983A*CN102869983A*(21)申请号 201180021806.3(22)申请日 2011.03.2510290158.4 2010.03.26 EPG01N 21/64(2006.01)B82Y 15/00(2006.01)(71)申请人巴斯德研究所地址法国巴黎(72)发明人 K罗杰斯 SL肖特J德拉加翁 S布拉兹凯(74)专利代理机构北京戈程知识产权代理有限公司 11314代理人程伟(54) 发明名称生物标记物成像期间增加可检测光子数目的方法(57) 摘要本发明涉及在目标细。
2、胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物的方法。该方法基于不受发光约束的激发所产生的荧光（FUEL），并包括步骤：a）提供适于生物标记物通过发光产生至少一个第一光子的条件；b）提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FUEL探针对上游（FPP-U），其中步骤a）的至少一个第一光子激发FPP-U，FPP-U发射至少一个第二光子。FPP-U可选自量子点、碳纳米管、荧光蛋白、金刚石纳米晶体和金属卟啉。该方法特征在于所述生物标记物和所述FPP-U不结合，以及特征在于至少一个第二光子的每个比至少一个第一光子的每个波长更长。(30)优先权数据(85)PCT申请进入国家阶段日2012.10.30(86)P。
3、CT申请的申请数据PCT/IB2011/051282 2011.03.25(87)PCT申请的公布数据WO2011/117847 EN 2011.09.29(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书19页 附图9页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 2 页 说明书 19 页 附图 9 页1/2页21.一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的方法，包括步骤：a）提供适于FPP-L产生至少一个第一光子的条件；b）提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FPP-U，其中步骤a）的所述至少一个第一光子激发所述FPP-U，其发射至少一个第二光子；所述。
4、方法特征在于所述FPP-L和所述FPP-U不结合，且所述至少一个第二光子的每个比所述至少一个第一光子的每个的波长更长。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FPP-L是生物标记物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是生物发光的。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是化学发光的。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是荧光的。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述生物标记物发射具有650nm以下波长的光子。7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述FPP-U发射具有比所述生物标记物更长的波长的光子。8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所。
5、述FPP-U发射具有650-900nm波长的光子。9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述方法包括在细胞、组织或生物体中确定存在产生至少两个光子的生物标记物；其中所述至少两个生物标记物的每个发射在波长非重叠范围的光子，所述光子激发所述FPP-U的至少两亚组的至少一个，所述FPP-U各发射至少一个光子，其中由每个所述FPP-U的所述亚组发射的所述至少一个光子在波长非重叠范围。10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述FPP-U包括将其靶向所述细胞、组织或生物体的特定部位的装置。11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之内。12.根据。
6、权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之外。13.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之内和之外。14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述FPP-U选自量子点、碳纳米管、荧光蛋白、金刚石纳米晶体或金属卟啉。15.一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的方法，包括步骤：a）提供适合第一FPP产生至少一个第一光子的条件；b）提供置于接近所述细胞、组织或生物体的第二FPP，其中步骤a）的所述至少一个第一光子激发所述第二FPP，其发射至少一个第二光子；其中步骤b）再重复至少一次，其中。
7、对于每个额外的步骤进一步的FPP置于接近所述细胞、组织或生物体，而不是所述的第一或第二FPP，其由在先步骤中发射的至少一个光子所权 利 要 求 书CN 102869983 A2/2页3特异激发，且其随后发射至少一个进一步的光子；其中，在最终步骤中检测所述至少一个进一步的光子；其中所述生物标记物是所述第一或所述第二FPP；所述方法特征在于所述多个FPPs不结合，且特征在于每个所述至少一个光子比每个来自之前步骤的所述至少一个光子的波长更长。16.一种用于进行根据权利要求1至13任一项的方法的试剂盒，其包括至少：根据权利要求1至13任一项的FPP-U分子；用于进行权利要求1至11任一项的方法的说明书。
8、。17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括吸收由所述生物标记物产生的光子的化合物。18.未结合至生物标记物的量子点用于在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生所述光子的生物标记物的用途。权 利 要 求 书CN 102869983 A1/19页4生物标记物成像期间增加可检测光子数目的方法技术领域0001 本发明涉及一种新的使来自生物标记物的光信号红移的方法。尤其本发明涉及发光的生物标记物和荧光团之间的激发机制。本专利申请还涉及用于实施根据本发明方法的试剂盒以及未结合的荧光团产生光子的用途，与生物标记物产生的光子相比，未结合的荧光团产生光子为红移的。背景技术0002 产生光信号的。
9、生物标记物的用途已经改革了生命科学的多个方面，特别是其允许实时观察体内如内吞作用、胚胎发育、感染、肿瘤发展和钙信号的现象。越来越多地，此类相同的技术还被用于使更多的生物和药学过程在靶细胞、分离的组织或整个生物体中原位可视化。0003 实质上有三个用于使用生物标记物产生基于光信号的光发射的机制：0004 1、生物发光。0005 2、化学发光。0006 3、荧光。0007 生物发光是由活生物体或其片段如酶产生和发射光。生物发光是化学发光（见下文）的天然发生的形式，其中能量通过化学反应以光发射的形式释放。在大多数生物发光反应中涉及三磷酸腺苷（ATP），因而通常生物发光反应发生在体内。0008 化学发。
10、光是化学反应产生的光的发射。其不同于生物发光，因为化学反应的成分没有必要发生在体内。0009 荧光是由吸收不同波长辐射的物质的光发射。在大多数情况下，某一波长的光的吸收诱导具有更长波长的光的发射。荧光分子通常称为荧光团，在激发后光的发射中不涉及化学反应。0010 以生物发光为例，已经用编码生物发光探针（如水母发光蛋白（aequorin）或各种荧光素酶）的基因进行遗传修饰的生物体的使用，允许在活生物体或小动物模型中使得许多生物过程非侵入地可视化（1-3）。生物发光成像是高度敏感的，理由在于由于哺乳动物组织的非常低水平的内在生物发光，在完整生物体如小鼠中，信号可被视觉检测（4）。生物发光探针，如水。
11、母发光蛋白（5、6）或酶荧光素酶（细菌、萤火虫、海萤（Cypridina）（7）或海肾（Renilla）（8）已被整合到宿主细胞或病原体中用于生物发光成像。这些工具已被应用于范围从感染和肿瘤发展到钙信号的研究。然而，这些生物标记物的大多数在色谱的蓝绿黄（400-650nm）区域内发射光（9），其与哺乳动物组织的主要吸收谱重叠，特别地与氧合血红蛋白、脱氧合血红蛋白和黑色素的吸收谱重叠，从而降低了检测效力（1、10）。由于这些吸收物的存在，体内光学成像中的主要挑战是通过开发近红外（NIR）红谱（650-900nm）发射光的光学探针，实现更高水平的灵敏度，在活哺乳动物组织中，该光仅被微弱吸收。001。
12、1 即使有这些缺点，该技术的使用其自身已便于应用于涉及比如麻醉的和非麻醉/清醒的小啮齿动物的实验中（21）。如上所述，在小啮齿动物模型中（以及更通常地在哺乳动说 明 书CN 102869983 A2/19页5物中），容易在色谱的蓝黄区域中被吸收的各种血红蛋白和组织的存在降低了激发和检测荧光团的能力，或者如果其在相同谱中，降低了监测由修饰的细胞和细菌产生的发光信号的能力。0012 改善来自生物发光源的可检测光子的数目的显著努力导致开发了大量新的和/或改善的生物发光探针以及增加在色谱红区域（650nm）发射光子的数目的技术。没有证实由于太难而不能够设计在近红外（NIR）-红区即能激发又能发射的荧光。
13、团或荧光蛋白（22）。0013 但是，已经证实，为了实现生物发光发射的相似红移更加困难。一种建立所需红移的方法已经开发能够在光谱NIR红区部分的这一部分发射的荧光素酶变体。但是，目前为止开发的大多数突变体/突变已经导致在黄绿区域发射（9），并且仅有几个成功的红色生物发光产物的实例（11），而且这样的NIR红区工程化的蛋白质通常产生比非工程化黄绿版本显著更低的信号。0014 考虑到产生NIR红区生物发光的困难，因而显著的努力已经朝向了创造可用的方法以使用生物发光共振能量转移（BRET）在发射的光子中产生红移（13）。一些小组已经证实利用结合至QDs的荧光素酶（8）或其它具有大的斯托克斯位移的荧光。
14、团（7）的技术是成功的。0015 在这些以前的方法中，研究者调查了通过使海肾线虫（Renilla reniformis）的八突变变体缀合至量子点的BRET，其中海肾线虫作为能量供体，量子点（QDs）作为能量受体，从而实现能量转移后来自QD的在655nm处的发射峰值（8）。更最近地，将生物素化的海萤荧光素酶缀合至远红荧光靛青衍生物，在675nm提供了发射峰（7）。但是，在BRET中，供体和受体必需极为贴近（10nm以下（12-15），因为其涉及从发光供体至受体的非辐射能量转移。0016 BRET的使用已经非常成功，但是实施可能困难，因为为了使供体荧光素酶缀合至受体QD或其它荧光团来实现想要的共振。
15、能量转移，必需利用各种合成技术。使生物标记物结合至QD或其它发射受体的“红”光子的需要，可能使生物标记物作为使“体内”细胞、组织或生物体可视化的手段的效率降低。适当时，这可以是干扰生物标记物产生信号和/或自由移动从而结合其靶的功能或能力的结果。发明内容0017 在本专利申请中，发明人提供了一种共振能量转移（RET）的替代，其不需要紧密分子接近的供体和受体源，但仍然能够提供从生物标记物发射的光子中想要的红移。这种现象的术语为不受发光约束的激发所产生的荧光（Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence（FUEL），不同于RET，因为供体和。
16、受体不需要是接近的分子，且FUEL可以在基本上较大的距离上发生（微米或更远）。0018 根据本发明的第一个方面，其提供了一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物的方法，包括步骤：0019 a）提供适于FPP-L产生至少一个第一光子的条件；0020 b）提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FPP-U，其中步骤a）的所述至少一个第一光子激发所述FPP-U，FPP-U发射至少一个第二光子；说 明 书CN 102869983 A3/19页60021 所述方法的特征在于所述FPP-L和所述FPP-U不结合，且特征在于所述至少一个第二光子的每个比所述至少一个第一光子的每个能量更低。002。
17、2 FUEL涉及FUEL探针对（FPP）的使用，其由两个成分组成：FPP下游（FPP-L）和FPP上游（FPP-U），其均可以是生物标记物。0023 例如，可以将加RFP标签的寄生虫引入易感的加GFP标签的细胞和所研究的细胞感染中。在此情况中，FPP-L，例如QD，也存在于所研究的系统中，其发射光子，从而激发RFP导致可检测的来自RFP的进一步的光子发射。因而，生物标记物是加标签的寄生虫，但这也是FPP-U。0024 或者，只要具有使其发射光子的条件，例如，内源或外源的激发光，加GFP标签的细胞可以是FPP-L，这些GFP光子然后激发置于接近细胞的FPP-U，其中然后可检测到来自FPP-U的光。
18、子。0025 在两种情况中，使用FUEL可检测生物标记物的存在。0026 FPP-L可以是发光的生物标记物，此生物标记物可以是，但不局限于，生物发光的、化学发光的或包括荧光蛋白的荧光团/荧光探针。FPP-U还是发光分子，发光分子可以是，但不局限于，包括量子点、荧光蛋白、碳纳米管、纳米金刚石或金属卟啉的荧光团/荧光探针。0027 FPP-L的发射谱有必要与FPP-U的激发谱重叠，以保证红移的光子的充分产生。0028 根据本发明的另一个方面，许多中间FFPs可以被插入到生物标记物和最终FPP-U之间的光子激发和发射的级联（cascade）当中，其产生可观察的光子。因此，特别地，本发明涉及一组FPP。
19、s，其每一个具有与在级联中在先成员的发射谱重叠的激发谱，继而产生级联中在后成员的激发谱内的光子。0029 根据本发明的这一方面，其提供了一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的“级联”方法，包括步骤：0030 a）提供适于第一FPP产生至少一个第一光子的条件；0031 b）提供置于接近所述细胞、组织或生物体的第二FPP，其中步骤a）的所述至少一个第一光子激发所述第二FPP，第二FPP发射至少一个第二光子；0032 其中步骤b）至少再重复一次，其中对于每个额外的步骤进一步FPP置于接近所述细胞、组织或生物体，而不是所述的第一或第二FPP，其中所述进一步的FPP特异地被至少。
20、一个在先前步骤中发射的光子所激发，且其随后发射至少一个进一步的光子；0033 其中，在最终步骤中检测所述进一步的光子；0034 所述方法的特征在于所述多个FPPs不结合，且特征在于每个所述至少一个光子比每个来自之前步骤的所述至少一个光子的波长更长。0035 在本方法的一个优选的实施方式中，其中所述生物标记物是所述第一或所述第二FPP。0036 此处涉及FPP-Ls或FPP-Us特性的任何详述的特异性特征可应用于本“级联”方法中使用的多个FPP。0037 此方法涉及被生物标记物（比如生物发光的细菌）发射的光子所充分激发的FPP-Us作为增强体内生物标记物非侵入检测手段的用途。量子点是由半导体核心。
21、物质（例如CdSe）和用官能化聚乙二醇（PEG）或其它外涂层共价修饰的两亲聚合物涂层组成的纳米说 明 书CN 102869983 A4/19页7晶体（10-40nm大小）（16）。QDs特征性地具有宽广的吸收谱，以及窄的发射谱，几乎适于所有可应用的激发波长（17），具有范围从60-85%的量子效率（18、19）。0038 碳纳米管是具有圆柱形结构的碳同素异形体，是富勒烯结构家族成员。单壁纳米管能够具有大约1nm的直径。碳纳米管具有大的斯托克斯位移，能够从大约600nm开始被激发，而在900nm以上发射（28）。0039 荧光蛋白是非常常见的应用。最早纯化于水母（Aequorea victori。
22、a）的绿色荧光蛋白现在通常被克隆至许多细胞和动物中。已经开发了大量的衍生物用于几乎每个激发和发射波长。这些蛋白质可能具有大的量子效率，但是，通常地，其不具有大的斯托克斯位移。0040 金刚石纳米晶体，或纳米金刚石，生产于具有高氮含量的金刚石材料。这些富含氮的金刚石被高能电子辐射产生带负电的氮空位中心。而后被辐射的金刚石在高温下退火以增加中心。这些材料可能具有名义上100nm的大小，具有以560nm为中心的吸收，并在700nm高效地发射。据报道它们具有接近1的量子效率，在化学和生物上是惰性的，可在其上进行表面化学作用（surface chemistries）（29、30）。0041 金属卟啉，特。
23、别是铂、钯和钌卟啉具有一些有趣的性质。它们通常在400nm或更低时可被激发，而在650nm以上的波长发射。许多金属卟啉具有在500-550nm间的二级激发范围。上述列表中的金属卟啉也是氧敏感的，因而它们的发光强度和寿命衰减率是局部氧浓度的函数（31-33）。0042 在本专利申请中，术语“光子能量”和“光信号波长”用于描述由FPP-L和FPP-U发射的光子/信号的各方面。因为电磁辐射被认为既是粒子（光子）又是电磁波，所以相同的光子/波将具有能量值以及波长。这些不同值的关系是直接的，通常认为光子的能量越低波长越长。因而，当提到由FPP-U产生的第二光子比由FPP-L产生的第一光子具有更低的能量时。
24、，也可以认为第二光子的波长大于第一光子的波长（这也是事实）。0043 根据本专利申请，生物标记物可以是用于使用FUEL使光信号红移的FPP的FPP-L。或者，生物标记物可以是最终通过系列中间激发导致光信号红移的一系列FPPs中的第一个。0044 因而，生物标记物的参照可以是FPP-L的参照或一系列FPPs中的第一个的参照。或者，生物标记物可以是FPP-U，其中其被所研究的系统中存在的FPP-L激发或者其可以是FPPs级联中的一个FPP。0045 根据本发明，术语“体外”指的是任何来自活的或死的生物体的细胞、组织、有机物或其它材料的混合物或溶液，在预定义的条件下，所述混合物或溶液组合有化学物质、。
25、试剂。0046 根据本发明，术语“体内”指的是当在完整的动物上进行时，使用任何来自活的或死的生物体的细胞、组织、有机物或其它材料的混合物或溶液所进行的任何操作，在预定义的条件下，所述混合物或溶液组合有化学物质、试剂。0047 根据本发明，适于允许生物标记物产生至少一个光子的条件将取决于选定的生物标记物而不同。例如，在生物发光的生物标记物，例如荧光素酶的情况下，有必要诱导/允许该酶的表达，然后提供酶可以在体内、体外或在原位产生光信号的条件，如果有必要，提供荧光素酶可能需要利用的所有成分试剂。同样地，对于化学发光的生物标记物，反应所需的所有的成分试剂有必要存在，或者在荧光生物标记物的情况下，适合的。
26、激发光源有必要说 明 书CN 102869983 A5/19页8存在。0048 根据本发明，生物标记物可以在靶细胞、组织或生物体的内部；或者置于其一些或所有的表面；或者即在这些目标的内部又在表面。0049 根据本发明，FPP-U位于接近靶细胞、组织或生物体，特别地，其可能位于这些结构内和/或其表面上和/或围绕这些结构的介质内，条件是不发生RET。特别地，FPP-U必须足够地接近生物标记物，从而使得由生物标记物产生的光子可以激发FPP-U，其继而可以产生至少一个第二光子。0050 根据本发明，生物标记物和FPP-U是非共价地，或通过任何其它手段彼此相互结合，这意味着它们在靶细胞、组织或生物体中彼。
27、此不相互结合，以这样一种方式即其中RET可能发生。0051 根据本专利申请，生物标记物可以是任何生物发光、荧光或化学发光的分子、化合物、酶或产生确定性质的光子的其它结构。例如生物发光的大肠杆菌（Escherichia coli）（命名为RT57）（20），其携带表达luxCDABE操纵子的质粒，该质粒包括编码具有以480nm为中心的发射的生物发光产物的基因，所述大肠杆菌被用于此处一些具体实施例中在体外和体内条件下激发量子点。0052 如上所述，发明人现已经表明BRET在生物标记物的输出的红移中不是必要的步骤。例如，在此处的表1中使用Cy5.5滤光器，观察到当允许生物发光细菌RT57和QD705。
28、共同设置时，观察到从FPP-U、QD705的显著发射，当全距离接近3cm时（包括10mm的琼脂）仍然发现实质上的增加，分隔两种成分（6.101.79相对于2.211.00）导致FUEL。图4显示在远超出共振能量转移的距离下可能发生FUEL现象。0053 该比较表明（1）生物发光细菌能够从相当的距离激发QDs，和（2）为实现FPP-U高效激发，策划的BRET条件不是必需的。考虑到光子发射物和荧光团的相对大小，与包含它们在内的总体积相比，当发光源和荧光探针没有结合在一起时，BRET发生的可能性充其量是最小的。因此，当发光细菌和QD705非常接近时有更多的红光子这一事实最有可能归因于增加的能够激发F。
29、PP-U的光子的数目。换言之，观察到的光子流越大FPP-U越接近生物标记物，通过生物标记物发射的光子激发FPP-U的可能性增加。0054 相反地，FPP-L和FPP-U间的距离越大，激发的可能性越小，这解释了红光子的降低。考虑到激发的相当距离（m-cm，图3-6），FPP-U的激发是辐射过程，并不涉及RET所必需的偶极子偶极子的相互作用。0055 尽管此处描述的方法描述了生物发光的特定参照，其可以扩展到其它辐射能量转移系统，比如荧光和化学发光。0056 在生物标记物和产生可检测信号的FPP-U间直接接触的缺少，经初步检查可被争论为表明在FUEL方法中缺少特异性，但是，如图3-6和表1中所示的，。
30、吸收物（在此情况中为刚果红）的存在证明了生物标记物和FPP-U间距离的依赖性。因此，FUEL能够鉴定特定位置中生物发光细菌的存在，或者，潜在地，鉴定细菌和“标记的”细胞间的相互作用。从图3、4、7中，还能推断由于FPP-U光子中的红移，这些细菌的检测可能发生在较低的滴度，增加了生物发光成像的总灵敏度。0057 在本专利申请中，发明人还提出了一套体内实验，进行该实验以确定在典型的实验条件下FUEL的可行性。如图9和10和表3和4中所见，存在强大的证据表明FUEL现说 明 书CN 102869983 A6/19页9象可以被容易地利用。但是，对于生物发光成像的FUEL的有效性和有用性主要地依赖于FP。
31、P-U。0058 发明人认为QDs适合于短期用作根据此处描述的FUEL技术的FPP-U，有许多利用QDs用于生物发光成像的理由，包括宽的吸收谱、窄的发射谱、显著的斯托克斯位移和接近1的量子效率。在测量时QDs必须存在于宿主或靶。在图9的情况中，注射后立即使小鼠成像（对照表明在几小时内没有可能改变细菌、量子点或它们的FUEL相互作用定量的显著扩散）。0059 因此，发明人证明了没有必要使用BRET使生物发光光子红移至光学上更希望的深红或NIR。不受发光约束的激发可以且确实发生在生物标记物（如生物发光细菌）和FPP-U（即QD）之间，如果没有生物发光吸收物存在，这种转移发生在相当的距离。0060 。
32、发明人已经表明FUEL的使用可以实质上增加体内和体外应用中红光子的数目，因而增加生物发光成像的灵敏度。0061 因而，根据本发明的另一些方面，生物标记物是生物发光的。0062 现在许多生物发光的分子被常规用于标记、分离和监测细胞、病毒和相关物质的各种成分。实例包括水母发光蛋白或酶，其产生作为其催化来自各种生物体的如荧光素酶的反应产物的光子。所有此类生物发光标记物和变体可以被用作本专利申请的FPP-L。0063 或者，生物标记物是化学发光的。0064 或者，生物标记物是荧光的。0065 特别地，生物标记物发射具有650nm以下波长的光子。0066 最特别地，生物标记物发射具有400-650nm波。
33、长的光子。0067 特别地，FPP-U发射具有波长大于FPP-L发射的光子波长的光子。0068 特别地，FPP-U发射具有650-900nm波长的光子。0069 尽管为FPP-L和FPP-U提供了特定的发射范围，这些成分没有必要被波长范围限定，关键的技术特征是每个FPP-L具有比其FPP-U更短的波长，FPP-L的发射谱与FPP-U的激发/吸收谱重叠，以及生物标记物（无论是FPP-L或FPP-U）发射的所有光子更容易被检测。0070 根据本发明另一方面，生物标记物和/或FPP-U可以作为被研究的细胞、组织或生物体内的一个或多个拷贝存在。0071 根据本发明的另一方面，方法包括在细胞、组织或生物。
34、体中确定存在产生光子的至少两个生物标记物；其中至少两个生物标记物的每个发射在波长非重叠区域的光子，光子激发所述FPP-U的两亚组的至少一个，FPP-U发射至少一个光子，其中由各亚组FPP-U发射的至少一个光子在波长非重叠区域。0072 除了使用FUEL从生物标记物的单一类型传导信号外，其还可能通过提供不同的FPP-Us亚组从几个生物标记物传导几个非重叠信号。这些FPP-U亚型的每个发射非重叠信号，从而允许不同生物信号的可视化。0073 根据本发明的这一特定方面，不同的FPP-Us亚组可以是相同类型的分子，或者它们可以是不同类型的分子。在一个优选的实施方式中，FPP-U的一个亚组是QD，其它的亚。
35、组是碳纳米管。0074 特别地，FPP-Us包括使其靶向所述细胞、组织或生物体特异性部分的装置。说 明 书CN 102869983 A7/19页100075 可获得多种装置使特定分子或化合物靶向细胞内或细胞外位置，包括核定位信号、细胞渗透肽、抗体和适体。因而这种成分和FPP-U的组合将允许FPP-U被定位于最佳的位置，从而接受（如果存在）来自生物标记物的光子，并将其转化为可检测的信号。0076 特别地，生物标记物可以是游离的或与靶细胞、组织或生物体的成分结合。例如，生物标记物可以是融合蛋白的部分。0077 特别地，FPP-U置于细胞、组织或生物体内。0078 或者，FPP-U置于细胞、组织或生。
36、物体外。0079 或者，FPP-U置于细胞、组织或生物体内和外。0080 使用上面列出的特异机制使FPP-U定位于目标细胞、组织或生物体内或外，或仅通过调准可视化步骤使得允许FPP-U充分扩散至靶，本方法允许恰当的FPP-U定位从而最好地阐明由生物标记物产生的信号。0081 根据本发明另一方面，生物标记物（FPP-L）和其配对物（FPP-U）可以相互结合，例如更大分子的成分，但是FPP-L和FPP-U并不相互结合，从而允许RET发生。0082 根据本发明的第二方面，其提供了用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少：0083 至少一个根据本发明的FPP-U；和0084 用于进行本发明方法的说明书0。
37、085 其中，至少一个FPP-U具有与生物标记物的发射谱重叠的激发谱，因而当置于接近所研究系统中的生物标记物时，将通过FUEL机制发射光子，光子继而可以被检测。0086 特别地，根据本发明的这一方面，试剂盒可以包括至少一个根据本发明的生物标记物。0087 特别地，试剂盒进一步包括吸收由所述生物标记物产生的光子的化合物。0088 考虑到吸收物的存在将以其浓度的函数降低此距离，通过提供由生物标记物产生的光子的吸收物，试剂盒的使用者在进行本方法的同时，可以控制生物标记物和将允许FPP-U被激发的FPP-U之间的距离。对于生物标记物的每一个能想到的发射波长，已知有许多可能的吸收物，且所有此种吸收物包括。
38、在本专利申请中。0089 根据本发明的另一方面，其提供了用于进行本发明方法的试剂盒，其包括：0090 至少一个根据本发明的FPP-L；和0091 用于进行本发明方法的说明书0092 其中，至少一个FPP-L具有与生物标记物的激发谱重叠的发射谱，因而当置于接近所研究系统中的生物标记物时，将通过FUEL机制使生物标记物发射光子，光子继而可以被检测。0093 根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包括顺次与发射和激发谱重叠的多个FPPs，如此处详述地，其可被用于级联的FPP系统中。0094 根据本发明的第三方面，提供了FPP-U（例如未结合的QD）在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物中的用途，其中FUEL发生在生物标记物和未结合的QDs之间，导致了生物标记物发射的信号的红移。0095 根据本发明另一方面，提供了FPP-L在目标细胞、组织或生物体中产生光子和确定存在生物标记物中的用途，其中FUEL发生在FPP-L和生物标记物之间，导致了信号的红移。说 明 书CN 102869983 A10。