膜囊泡的制法 本发明涉及膜囊泡的新制法(特别是分离和/或纯化)。本发明亦涉及以此方法制成的膜囊泡与例如其生物学及医学应用。
膜囊泡通常是由包含细胞质部分的脂双层组成的直径小于100纳米的囊泡。特别的膜囊泡更特定地经由胞内区室与细胞膜的融合获得，这使这些膜囊泡释放于生物流体或培养的细胞的上清液中。这类囊泡通常名为胞外体(exosome)。胞外体直径通常介于约50～90纳米之间，更特定地是介于60～80纳米之间，并且，有利的是，其带有与在其起源细胞的细胞膜中取向相同的膜蛋白质(特别是主要组织相容性复合体蛋白)。此外，视起源而定，胞外体包括诸如CD40、CD80与HSP70等膜蛋白而且不含内质网或高尔基体。
已证实胞外体可由各种生理环境的不同细胞类型释放。在这方面，已证实，B淋巴细胞释放携带具有抗原呈递作用的第二类主要组织相容性复合体分子的胞外体(Raposo等.，J.Exp.Med.183(1996)1161)。同样地，已证实树状细胞生成胞外体，该胞外体具特定的结构特征与功能特征，并在免疫反应的介导，特别是在细胞毒性T淋巴细胞地刺激中起一定作用(亦名为树状细胞胞外体)(Zitvogel等.，Nature Medicine4(1998)594)。亦证实肿瘤细胞以受调控的方式分泌特定胞外体(亦名为肿瘤细胞胞外体)，其携带肿瘤抗原并可呈递这些抗原或将之传递至抗原呈递细胞(专利申请WO99/03499)。亦已知，肥大细胞在胞内囊泡区室中累积一些可在信号影响下分泌的分子(Smith与Weis，Immunology Today17(1996)60)。因此，作为一般规律，细胞发射信号并经由在不同生理状况下产生的膜囊泡彼此沟通，这些膜囊泡可能携带具特定结构特征与功能特性的抗原型、MHC分子或任何其他信号(细胞因子、生长因子等)。因此，这些囊泡，特别是胞外体，是一种特别希望用于诊断、疫苗接种或治疗性的应用或目的分子的传递的产品。因此，可以工业规模制备与生物性用途，特别是药理用途相容的膜囊泡的有效方法将具有特别的意义。
传统的制备膜囊泡(例如胞外体)的方法涉及一系列差速离心步骤，以从培养基中存在的细胞或细胞碎片中分离囊泡。在这方面，上述文献实质地描述通过在300g、10,000g与70,000g或100,000g下的一系列离心制备囊泡，所得的团粒则溶于盐溶液以构成浓缩的胞外体溶液。此制备物可利用传统生化技术进行分析，用于评价胞外体的蛋白质组成。优选的生化技术包括在变性介质中进行电泳，加上全蛋白质的染色；或根据Western印迹技术利用抗体检测特定蛋白质。最终制备物中的胞外体可在以4％戊二醛溶液固定制备物后利用电子显微镜术直接检测。
根据本方法，可得纯度令人满意的胞外体，因为该制备物可在动物模型中显示生物活性与抗肿瘤性质。然而，这些现有技术的离心方法，无法将膜囊泡(例如胞外体)与细胞蛋白质或某些大分子成份(DNA、RNA)或大分子复合体进行精细分离。因此，这些方法无法排除对人类的治疗用途不相容的未识别的生物污染物的存在。此外，这些步骤难以外延至工业规模，特别是在处理量很大时；或难以用于自体(即病人对病人)的体外应用，在其后者中该方法通常须应用于限定的系统中。
本发明现在提供对此问题的解决方式。本发明说明在与工业用途和药理应用相容的条件下制备(即分离和/或纯化)膜囊泡的新方法。特别可应用本发明的方法取得个体化的自体胞外体制备物和由确立细胞株获得胞外体制备物，以用于实验或生物用途、或者预防或治疗性的疫苗接种目的。
本发明更特定地基于层析分离法的使用来制备膜囊泡，特别是把膜囊泡和潜在的生物污染物分离开。
更具体而言，本发明第一个目的是由生物样品制备膜囊泡的方法，其特征在于，其至少包括样品的阴离子交换层析处理步骤。
事实上，申请人现已证明膜囊泡，特别是胞外体，可通过阴离子交换层析得以纯化。在这方面，在此应用中出人意料地证明，在阴离子交换层析后，胞外体呈一个均一峰。此结果是完全出人意料的，因为胞外体是由围绕在包括可溶蛋白的内体积周围的膜所组成的超分子复合物质。此外，胞外体包含膜蛋白。
因此，本发明的优选目的涉及由生物样品制备膜囊泡，特别是纯化膜囊泡的方法，其中至少包括一个阴离子交换层析步骤。
为应用本发明，可使用强或弱的阴离子交换，优选进行强的阴离子交换。此外，在一具体实施方案中，该层析是压力下进行。因而，更具体而言，其可以包括高效液相色谱法(HPLC)。
在阴离子交换层析中可使用不同类型的载体。更优选的是，这些载体可以包括纤维素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、琼脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、硅石、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物、或其混合物如琼脂糖-葡聚糖混合物。为对此举例说明，可采用由上述载体组成的不同的层析装置，特别是使用下列的凝胶：例如Source、Poros、Sepharose、Sephadex、Trisacryl、TSK-凝胶SW或PW、Superdex、Toyopearl HW与Sephacryl，上述凝胶皆适用于本发明。
因此，在一具体实施方案中，本发明涉及由生物样品制备膜囊泡的方法，其至少包括一个步骤，在此步骤中该生物样品经阴离子交换层析处理，其中载体选自：纤维素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、硅石、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸盐共聚物，它们单独或以混合物使用，并得任选加以官能化。
此外，在本发明范畴中，为改善该层析分离度，优选所用的载体的小珠形式。理想情形为，这些珠子具有均一且已标准化的直径，和相当高的孔隙度以使物质能在层析过程中穿透过(即胞外体)。在这方面，若设定胞外体的直径(通常介于50至100纳米)，为应用本发明，优选使用高孔隙度凝胶，特别是介于10纳米至5微米，更优选介于约20纳米至约2微米，最优选介于约100纳米至约1微米。
对阴离子交换层析而言，所用的载体必须用能与阴离子分子作用的基团官能化。通常，此基团是由三级或四级胺组成，其分别限定弱或强的阴离子交换剂。
在本发明范畴中，使用强阴离子交换剂是特别有利的。在这方面，根据本发明，使用经四级胺官能化的上述层析载体。因此，根据本发明一更具体的实施方案，该阴离子交换层析在以四级胺官能化的载体上进行。甚至更优选，此载体选自聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖与硅石，其单独或以混合物形式使用，并经四级胺官能化。
经四级胺官能化的载体的实例包括Source Q、Mono Q、QSepharose、Poros HQ与Poros QE等凝胶、Fractogel TMAE型凝胶和Toyopearl Super Q凝胶等。
有一种特别优选用于进行阴离子交换层析的载体包括聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。可于本发明范畴中使用的这类凝胶的实例之一是SourceQ凝胶，特别是Source 15 Q(pharmacia)。该载体的优点是提供很大的内部孔隙，因此对流经凝胶的液体的循环只有低的阻力，同时使胞外体能快速扩散至官能团，这些官能团对指定大小的胞外体是特别重要的参数。
可采用不同方式洗脱保存在柱内的生物学化合物，特别是利用渐增浓度如0～2摩尔浓度的盐溶液梯度进行。特别可使用浓度例如为0～2摩尔浓度的氯化钠溶液。以此方式纯化的不同级分则通过利用连续式分光光度读数在柱出口处测量光密度(OD)而进行检测。就做为指标而言，在上述实例所用条件下，以离心强度大约介于350～700毫摩尔浓度的溶液洗脱包括膜囊泡的级分，所用浓度视囊泡类型而定。
根据需要及须处理的试样体积，层析步骤可使用不同类型的柱进行。例如，视制备物而定，可使用从约100微升至10毫升或更高的柱。在这方面，可用的载体例如具有可达25毫克蛋白质/毫升的容量。为此，100微升柱具有约2.5毫克蛋白质的容量，对于所述样品而言，这允许处理约2升的培养上清液(其在浓缩10～20倍之后，代表例如每个制备物体积为100～200毫升)。可以了解，例如通过增大柱体积亦可能处理较大的试样体积。
此外，为进行本发明，亦可能联合阴离子交换层析步骤与凝胶渗透层析步骤。在这方面，根据本发明一具体实施方案，将凝胶渗透层析步骤加于阴离子交换步骤，可置于阴离子交换层析步骤之前或后。在此实施方案中，该渗透层析步骤优选是在阴离子交换步骤后进行。此外，在另一具体实施方案中，该阴离子交换层析步骤被凝胶渗透层析步骤代替。本发明应用显示，也可利用凝胶渗透液相层析来纯化膜囊泡，特别是当此步骤与阴离子交换层析或其他生物样品处理步骤联合时，这如下面所详述的那样。
进行凝胶渗透层析步骤时，优选使用的载体选自硅石、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物或其混合物如琼脂糖-葡聚糖混合物。作为举例说明，对凝胶渗透层析而言，优选使用诸如Superdex 200HR(Pharmacia)、TSK G6000(TosoHaas)或Sephacryl S(Pharmacia)。
根据本发明的方法可能应用于不同生物样品。特别是，这些样品可包括来自某些个体的生物流体(骨髓、外周血液等)、培养上清液、细胞溶胞物、预纯化的溶液或任何其他包含膜囊泡的组合物。
就此方面言，在本发明一具体实施方案中，生物样品是膜囊泡生成细胞的培养上清液。
此外，根据本发明一优选实施方案，在层析步骤前处理生物样品，以富含膜囊泡(富集阶段)。在这方面，在一具体实施方案中，本发明涉及由生物样品制备膜囊泡的方法，其特征在于，其至少包括：
b)一个富集步骤，以制备富含膜囊泡的样品；与
c)一个在其过程中利用阴离子交换层析和/或凝胶渗透层析处理该样品的步骤。
根据一优选实施方案，生物样品是经处理以富含膜囊泡的培养上清液。特别是，该生物样品可能是由源于一群膜囊泡生成细胞的培养上清液或源于生物流体的预纯化溶液组成，并且预纯化溶液是经诸如离心、澄清、超滤、纳过滤和/或亲和层析等处理而获得，特别是利用澄清和/或超滤和/或亲和层析获得。
因此，根据本发明，制备膜囊泡的优选方法更特别地包括下列步骤：
a)在允许囊泡释放的条件下培养一群膜囊泡(例如胞外体)生成细胞，
b)一个使样品富含膜囊泡的步骤，与
c)对样品进行阴离子层析和/或凝胶渗透层析的处理。
如上述，该样品(例如上清液)富集步骤可能包括对上清液进行一或多个离心、澄清、超滤、纳过滤和/或亲和层析步骤。在第一具体实施方案中，富集步骤包括(i)清除细胞和/或细胞碎片(澄清)，可能继之以(ii)一个浓缩和/或亲和层析步骤。在另一具体实施方案中，该富集步骤包括一个亲和层析步骤，并任选在其前进行清除细胞和/或细胞碎片(澄清)的步骤。根据本发明的优选富集步骤包括(i)清除细胞和/或细胞碎片(澄清)、(ii)浓缩以及(iii)亲和层析。
可利用样品的低速离心清除样品中的细胞和/或细胞碎片，例如利用低速离心进行，优选低于1000g，例如介于100至700g。在本步骤中的优选离心条件，例如为约300g或600g，时间为1至15分钟。
欲清除样品的细胞和/或细胞碎片亦可利用过滤，并可能结合上述的离心步骤。该过滤步骤特别可采用孔隙度逐渐缩小的滤器进行连续过滤。为此目的，优选使用孔隙大于0.2微米的滤器，例如孔隙度介于0.2至10微米之间的滤器。特别可能的是连续使用孔隙度为10微米、1微米、0.5微米、继之以0.22微米的滤器。
为减低层析阶段须处理的样品体积，亦可进行浓缩步骤。就此方式，浓缩可通过高速离心进行，例如以介于10,000与100,000g间进行离心，以沉降膜囊泡。此可包括一系列差速离心，且最终的离心在约70,000g进行。所得团粒中的膜囊泡可以较小体积溶于适当缓冲剂中，以进行本方法中的后续步骤。
亦可利用超滤进行浓缩步骤。事实上，此超滤既可浓缩上清液又可进行初步的膜囊泡纯化。根据一优选实施方案，将生物样品(例如上清液)超滤，优选切向超滤。切向超滤包括浓缩与分级分离由具有确定截止限的膜所隔离的两个区室间的溶液(滤液与保留液)。进行该分离时是将一定流量施加在保留液区室中并在此区室与滤液区室间施予跨膜压力。进行超滤时可使用不同系统，诸如螺旋膜(Millipore，Amicon)、扁平膜或中空纤维(Amicon，Millipore，Sartorius，Pall，GF，Sepracor)。在本发明范围内，所用的膜的截止限为小于1000kDa，优选介于300kDa至1000kDa，最优选介于300kDa或500kDa间。
亲和层析步骤得采用不同的层析载体与材质以不同方式进行。目的在于保留(即结合)溶液内所有的某些污染物而不保留目的物质(即胞外体)的非特异性亲和层析是有利的。故其是负选择。优选在染料上进行亲合层析，以清除(即保留)诸如蛋白质与酶等污染物，例如白蛋白、激酶、脱氢酶、凝血因子、干扰素、脂蛋白或辅因子等。更优选本层析步骤所用的载体是如离子交换层析所用的载体并用染料官能化。就具体实例而言，染料可选自蓝琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)(Pharmacia)、黄色86、绿色5号和褐色10号(Sigma)。载体更优选琼脂糖。应明白，本发明可使用任何其他载体和/或染料或允许保留(结合)所处理的生物样品中的污染物的反应基团。
在本发明一个具体实施方案中，通过对膜囊泡生成细胞的培养上清液进行至少一个过滤阶段，获得该生物样品。
在本发明另一个具体实施方案中，通过令膜囊泡生成细胞的培养上清液进行至少一次离心步骤而获得生物样品。
在本发明一个优选实施方案中，通过令膜囊泡生成细胞的培养上清液进行至少一次超滤步骤而获得生物样品。
在本发明另一优选实施方案中，通过令膜囊泡生成细胞的培养上清液进行至少一次亲和层析步骤而获得生物样品。
本发明范畴内有一个更具体的优选膜囊泡制备方法，包括下列步骤：
a)在允许囊泡释放的条件下培养膜囊泡(例如胞外体)生成细胞的群体，
b)以至少一个超滤或亲和层析步骤处理培养上清液，以生成富含膜囊泡(例如胞外体)的生物样品，与
c)对生物样品进行阴离子交换层析和/或凝胶渗透层析处理。
在一优选实施方案中，上述步骤b)是包括过滤培养上清液，接着超滤，优选切向超滤。
在另一优选实施方案中，上述步骤b)包括澄清培养上清液，随之在染料上进行亲合层析，染料优选蓝琼脂糖凝胶。
此外，如果适用，可在步骤c)之后对所收集的物质进行一或多个额外处理和/或过滤步骤d)，特别是用于灭菌时。对于此过滤处理步骤，所用滤器直径优选小于或等于0.3微米，甚至更优选小于或等于0.25微米，这类滤器的直径为例如0.22微米。
步骤d)之后，将所得物例如分装于含适当贮存介质的诸如瓶、管、袋、注射器等适当装置中。以此方式所得的已纯化的囊泡可冷藏、冷冻或立即使用。
因此，本发明范畴中的一个具体制法至少包括下列步骤：
c)生物样品的阴离子交换层析和/或凝胶渗透层析处理，与
d)阶段c)之后，对所收集的物质的一个过滤步骤，特别是灭菌过滤。
在第一种变化中，根据本发明的方法包括：
c)生物样品的阴离子交换层析处理，与
d)阶段c)之后，对所收集的物质的一个过滤步骤，特别是灭菌过滤。
在第二种变化中，根据本发明的方法包括：
c)生物样品的凝胶渗透层析处理，与
d)阶段c)之后，对所收集的物质的一个过滤步骤，特别是灭菌过滤。
根据第三种变化，本发明的方法包括：
c)生物样品的阴离子交换处理，在该步骤之前或之后则进行渗透层析，与
d)阶段c)之后，对所收集的物质的一个过滤步骤，特别是灭菌过滤。
各实施例的结果显示，将胞外体制备物注射入层析柱后，可得到完全分离的对称吸收峰(图1)。在变性凝胶中使用传统蛋白质电泳技术并继之以考马斯(Loomassie)蓝染色技术或利用抗体使用特异性蛋白检测技术，可分析以此方法分离的不同级分。因此有可能证明，对肿瘤细胞胞外体而言，利用400毫摩尔浓度盐溶液在阴离子交换层析中洗脱的峰与利用传统方法制备的胞外体制备物具有相同的蛋白质分布情形(图2)。事实上，这使以较低或较高盐溶液浓度洗脱的峰特性化为与独特的生物性污染物相关。在另一实验中，以介于约500至700毫摩尔浓度的离子浓度洗脱由树状细胞生成的膜囊泡(树状细胞胞外体)或某些肿瘤细胞胞外体，而肥大细胞衍生的囊泡则以约350毫摩尔浓度进行洗脱。
此外，各实施例的结果亦显示，根据本发明的方法允许检测制备物中由培养基中的主要蛋白如牛血清白蛋白造成的可能的污染。事实上，在上述条件下标准牛血清白蛋白溶液的层析确实显示，在不同于胞外体峰的盐溶液浓度下有一峰洗脱出(图3)。
因此，本发明的方法，(i)在与药理用法相容的定量和定性条件下纯化膜囊泡，与(ii)检测所处理的生物样品中特定生物性污染物的存在。
可应用本发明的方法来制备不同来源的膜囊泡。特别是，这些囊泡例如可包括由抗原呈递细胞或肿瘤细胞产生的胞外体。此外，他们可包含例如培养的初级细胞，或是确立细胞系，例如无限增殖化的膜囊泡生成细胞系。他们可以包含哺乳类来源的细胞，特别是来源于鼠类或人类的细胞。
在本发明一具体实施方案中，膜囊泡是由抗原呈递细胞生成的囊泡，特别是由树状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞与肥大细胞所生成的囊泡，并优选先经一或多种选定抗原致敏这些细胞。本发明有一种特别优选的应用是基于由树状细胞所生成的膜囊泡的制备物。这些细胞可为人或动物的树状细胞，特别是人源或鼠源树状细胞。这些细胞可为收集自受测体的生物流体或由前体细胞在活体外产生的初级细胞，或亦可是源于确立细胞系，例如源于经致癌基因无限增殖化的确立细胞系(EP701604)。
本发明的一个特定目的是一种制备膜囊泡(树状细胞胞外体)的方法，其特征在于，其包括下列步骤：
a)获得树状细胞群落，
b)在允许生成膜囊泡(树状细胞胞外体)的条件下培养这些树状细胞，与
c)使用至少包括一个上述阴离子交换层析处理的方法纯化这些膜囊泡(树状细胞胞外体)。
有一更优选的实施方案涉及树状细胞胞外体的制备方法，包括下列步骤：
a)获得树状细胞群落，
b)在允许生成树状细胞胞外体的条件下培养树状细胞，
c)处理培养上清液以产生富含树状细胞胞外体的生物样品，特别是利用超滤或亲和层析步骤进行处理，与
d)在上述条件下，利用至少包括一种阴离子交换和/或凝胶渗透层析步骤的方法来纯化树状细胞胞外体。
更具体而言，为了进行这一实施方案，该树状细胞优选获自由一研究对象例如骨髓或外周血液所得的生物样品。
就此方面而言，已有现有技术公开了树状细胞产生技术，而且熟练的技术人员皆可使用这些技术(特别参见专利申请WO99/03499所述的技术，并列于本申请中以供参考)。因此，该树状细胞可由免疫系统干细胞、单核细胞前体制成，或可直接在分化状态下分离(参照Hart，血液(Blood)90(1997)3245的综述)。
有一种本发明范畴中的优选方法是基于由单核细胞前体或骨髓产生树状细胞。更具体而言，在本发明范畴中，优选使用通过在GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13组合存在下处理的单核细胞前体(含于血或骨髓中)而获得的树状细胞。
此外，为本发明的进行，使用包括不成熟树状细胞的树状细胞群落是特别有利的。更有利的是，所用的树状细胞的群落主要(即至少60％，优选70％)由不成熟树状细胞组成。
因而，树状细胞制备步骤可有利地包括制备包含不成熟树状细胞的树状细胞群落，特别是人源树状细胞，尤其是来自单核细胞前体的树状细胞，更具体而言是经诸如GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13的细胞因子组合的处理来进行制备。
此外，在本发明范畴中，亦可能使用无限增殖化的树状细胞群落。这些群落可由无限增殖化的树状细胞系(例如D1细胞系或例如通过将myc致癌基因导入树状细胞而生成的任何其他细胞系)组成。他们亦可由在体外制备并无限增殖化的树状细胞组成。无限增殖化的树状细胞的目的是构建对指定抗原基团敏感的细胞库，其可在工业上用于制备对于施用给全体病人相容的树状细胞胞外体。
为了产生膜囊泡(树状细胞胞外体)，可于本领域技术人员所知的传统条件下培养树状细胞。然而，优选于刺激树状细胞胞外体产生的条件下，特别是在可刺激树状细胞胞外体产生的因子存在下，特别是在细胞因子诸如γ干扰素、白细胞介素10或白细胞介素12存在下(例如参照WO99/03499的应用)，培养这些细胞。在本发明方法的一优选实施方案中，在上述步骤b)中，于足以刺激膜囊泡产生的条件下培养树状细胞。
而且，在一具体变化中，在产生膜囊泡前，先令树状细胞经抗原敏感化。在此实施方案中用特定抗原集中树状细胞，以产生具指定免疫原性的树状细胞胞外体。此敏感化步骤可以利用不同的已知技术进行，例如包括令细胞与抗原性肽、抗原、蛋白质复合物、表达抗原的细胞或其膜、凋亡体、膜囊泡、脂质体、肿瘤RNA或可编码一或多个抗原的任何核酸、抗原决定簇或表位(可能由病毒载体或非病毒的载体所携带)等等进行接触(例如参见申请WO99/03499)。在一优选方法中，利用其与肽、抗原、RNA或核酸一起温育进行敏感化。应了解，此申请不限于树状细胞的敏感化或产生技术。
本发明另一特别有利的实施方案是基于由肿瘤细胞(特别是人源肿瘤细胞)产生的膜囊泡的制备。特别是，其可包括任何源于实性或柔软(liquid)肿瘤的细胞与任何在体外转化或无限增殖化的细胞。更常提到的可能是实性、造血的或腹水肿瘤。
本发明的一个具体实施方案亦在于制备膜囊泡，该膜囊泡包括一或多种异种分子，特别是重组分子。就此方式，例如有可能在遗传上修饰膜囊泡生成细胞(例如肥大细胞系)，使之在其所产生的囊泡内或表面上表达目的分子(PCT/FR99/02691)。本发明也可用于纯化这类已修饰的囊泡。
更普遍而言，可应用本发明制备由任何细胞类型所产生的膜囊泡，特别是胞外体类型的囊泡，优选其直径小于约100纳米。这些细胞可以包括巨噬细胞、肥大细胞、网状细胞等等。在实验部分，使用源于(i)细胞系如鼠类肿瘤细胞系(TS/A)、树状细胞系(D1)、肥大细胞系(RBL)与(ii)人类单核细胞衍生的树状细胞的胞外体制备物。所得结果可以直接转换至其他可在工业上可接受的条件下得以培养的原代培养物诸如人类肿瘤细胞、树状细胞、B淋巴细胞等。因此，本发明的方法可用来纯化在人类治疗中使用的胞外体。
视其来源而定，以此方式所得的膜囊泡代表用于癌症或免疫系统调控研究的工具，以及用于分子转移、抗体产生、标记、诊断、库构建、疫苗或药物成份等等的工具。
此外，亦可使用本发明的方法做为对培养基中或膜囊泡制备物中可能存在的污染物(特别是污染性蛋白)进行定量和定性控制的方法。
因此，就此方面而言，本发明既可应用于膜囊泡的制备方法，又可应用于用以测试不论制法的膜囊泡制备物定量和定性的分析系统。
因此，本发明亦涉及测试膜囊泡(尤其是胞外体)制备物中污染物(尤其是蛋白或核酸来源的污染物)，其包括对该制备物的级分至少进行阴离子交换层析与污染物存在的检测。
作为常规，本发明亦涉及阴离子交换层析，特别是高效液相层析，用以制备或纯化膜囊泡的应用。其亦涉及使用亲和层析制备或纯化膜囊泡。
本发明亦涉及使用本发明方法制备的膜囊泡与包括这类囊泡的任何组合物。
通过下列实施例更详细说明本发明，这些实施例只用于说明而非限制。附图说明
图1：经差速离心制成的胞外体样品进行阴离子交换层析后的洗脱分布。
图2：一种胞外体制备物的不同洗脱级分通过SDS PAGE电泳继之以考马斯蓝染色而进行的蛋白质分布分析。
图3：标准牛血清白蛋白阴离子交换层析后的洗脱分布。
图4：包括膜囊泡的生物样品的切向超滤处理图。
图5：树状细胞胞外体上清液经600与10,000g离心后的蓝琼脂糖凝胶6快速流动步骤的一般分布。
图6：未吸附级分与蓝琼脂糖凝胶6快速流动步骤的洗脱物中的胞外体MHC II分子的Western印迹。
图7：蓝琼脂糖凝胶6快速流动步骤后的Source Q15步骤的一般分布。
图8：蓝琼脂糖凝胶6快速流动步骤后的Source Q15上的洗脱梯度的详细情形(图7右下部的放大图)。
图9：由RBL DR+细胞系产生(53微克蛋白质当量)并在DNA酶与RNA酶处理后经Source Q15柱纯化的胞外体的纯化分布情形。
图10：利用不连续的NaCl梯度于Source Q15载体上进行的胞外体分离。
图11：经HPLC分离与超速离心的每一峰的人类MHC II分子的Western印迹。阳性对照组：表达MHC II分子的人类树状细胞。阴性对照组：超速离心过的培养基(背景信号)。MW：分子量；NA：未吸附的级分。一般细胞培养与分子生物学技术
1)细胞培养
TS/A细胞系是由自发的乳腺癌确立的鼠类细胞系。此细胞系于37℃、5％CO2下在含10％胎牛血清(Dominigue Dutcher)的RPMI培养基中培养。
树状细胞系保存于含10％灭活的胎牛血清、2毫摩尔浓度L-谷氨酰胺、50微摩尔浓度2-βME、100单位/毫升青霉素与100微克/毫升链霉素的IMDM培养基中。
2)SDS PAGE蛋白质分析
20微升样品以连力(Laemmli)缓冲液(Nature 227(1970)680-685页)稀释，然后在95℃热变性10分钟，然后负载于10％丙烯酰胺凝胶上(Novex1毫升×10孔)。在迁移后，将该凝胶以考马斯蓝染色。实施例
1)由肿瘤细胞(TS/A细胞系)产生的胞外体制备物的阴离子交换层析：不同洗脱级分的SDS PAGE蛋白分布分析。
此实施例说明阴离子交换层析处理怎样用来分离来自胞外体制备物的杂质。
1.1方案：
在此实验中，起始材料是利用差速离心由TS/A细胞培养上清液制备式的胞外体浓缩物组成，用于将胞外体由培养基中的细胞或细胞碎片中分离出。为使来自培养上清液的悬浮液中的细胞得以沉降，初次离心是以低速(300g，5分钟)进行。另外进行两次离心(1200g、20分钟，随之为10,000g、30分钟)使细胞碎片形成团粒。然后，令以此方式澄清化的上清液以70,000g高速超速离心1小时以使胞外体得以沉降，然后将此制备物以大量盐溶液洗过并经上述条件再次离心。然后将该凝块溶于近100微升的盐溶液以形成浓缩的胞外体溶液。蛋白量以Bradford技术(Biorad，Ivry，法国)测量。此浓缩物的蛋白质总量介于500至1000微克/毫升。
令稀释于500微升pH8的50毫摩尔浓度HCl/Tris缓冲液的40微克的此胞外体制备物注射入包含经pH8、50毫摩尔浓度HCl/Tris缓冲液稳定的Source Q15凝胶(Pharmacia)的柱。冲洗后，在30倍体积的柱上用0～500毫摩尔浓度线性梯度的NaCl随之为2摩尔浓度NaCl溶液洗脱吸附物。洗脱级分则以260与280纳米(nm)用分光光度法分析，将洗脱级分分成5个主要级分(F1至F5)以分别进行其蛋白质分布分析。以1/10体积的100％三氯乙酸溶液沉淀每一级分的蛋白质，然后再以丙酮溶液漂洗。以20微升连力溶液溶该蛋白质团粒并负载于SDS PAGE丙烯酰胺凝胶，然后进行考马斯蓝染色。
1.2结果：
图1所示为260与280nm时的洗脱分布。该分布显示3个明显的分别洗脱于盐溶液浓度为105毫摩尔浓度、400毫摩尔浓度与2摩尔浓度NaCl的对称峰。
相对于不同峰的级分的蛋白质分布情形分析显示，于400毫摩尔浓度NaCl洗脱出的峰与经离心制成的传统胞外体制备物具有相同的蛋白质分布情形(图2)。测定值为0.8的260与280nm吸收间的比例与蛋白质的情况相容。
然而，以105毫摩尔浓度NaCl洗脱的峰(F2级分)显示不同的蛋白质分布，仅显示两个不同带。260与280nm的吸收测定值的比例为1.6，意指存在核酸与蛋白质的组合。
以2摩尔浓度NaCl洗脱的F5级分对应于与柱有力连结的生物化合物。
因此，有可能以阴离子交换步骤将不纯物与胞外体分离。
2)标准牛血清白蛋白溶液的阴离子交换层析
亦可使用此阴离子交换层析技术评估胞外体制备物受培养基中的蛋白质污染的程度。在这方面，利用相当于培养基中主要蛋白质的10微克牛血清白蛋白溶液进行的层析，证明它以205毫摩尔浓度NaCl洗脱出，为窄峰，可以与上述胞外体的峰有所分别。
3)包含胞外体的培养上清液的超滤处理。
此实施例证明，可利用超滤浓缩胞外体。此外，该胞外体制备物仅含少量诸如BSA的蛋白质污染。
方法：(图4)
以0.22微米孔隙率的滤器(Millipore)过滤由TSA细胞于300g离心后所得的150毫升细胞培养上清液。以PBS等倍稀释滤液。生成的300毫升液体以300,000D(Sartorius)截止限的过滤匣(10平方厘米的膜)进行切向过滤。
结果：
经1小时过滤后可得7毫升保留液。令保留液进行超速离心(79,000)以取得团粒并分析胞外体。经SDS-PAGE分析加上考马斯蓝染色后显示，样品所含BSA明显比超滤的溶液所含的少。此外，亦可见由TSA生成的胞外体的特殊蛋白质带。
因此，为分离胞外体与污染的蛋白，可在胞外体纯化方法中使用超滤法。
4.由人类单核细胞衍生的树状细胞产生的人类胞外体的HPLC纯化。
4.1)材料与方法
·缓冲液与贮存溶液
除了水与碱液外，皆使用经0.22微米过滤的贮存液。第一种缓冲液为缓冲至pH＝6的100毫摩尔浓度(Sigma，纯度99％)Bis-Tris-丙烷(BTP)溶液，此缓冲液连接至层析用的通道A(BioCad Sprint，Perkin-Elmer)。第二种缓冲液是缓冲至pH＝9的100毫摩尔浓度Bis-Tris-丙烷溶液，此缓冲液连接至层析用的通道B。水是在电阻18MΩcm下用Milli-Q系统于树脂上产生的。水连接于通道C。令3摩尔浓度氯化纳贮存液(NaCl，Prolabo，纯度99.5％)连接于通道D。令0.1摩尔浓度的碱液(NaOH，Prolabo，最小纯度98％)连接于通道F。通道E是用以将培养上清液负载于柱上。
所有缓冲液皆由用Milli-Q系统产生的水制成，且未经脱气。
·柱
蓝琼脂糖凝胶6快速流动(Blue Sepharose 6 fast flow，Pharmacia)：
第一个步骤是用蓝琼脂糖凝胶6快速流动(Pharmacia)柱进行。基质是为与蓝琼脂糖凝胶6快速流动蓝3G(7％)连结的琼脂糖，颗粒大小介于45至165微米间。最大线性流速为750厘米/小时。该凝胶在pH4～12时稳定，在4与12的pH极限时，凝胶可能损坏，其引起固定容量的下降(蓝琼脂糖凝胶6快速流动的分离)与压力的增加(精细形成)。
蓝琼脂糖凝胶6快速流动是特异于诸如白蛋白、激酶、脱氢酶与其他诸如包含NAD+辅酶的酶、凝血因子、干扰素与脂蛋白等的化合物。
蓝琼脂糖凝胶6快速流动的理论固定容量，约为15～20毫克血清白蛋白/毫升凝胶。
所用的柱体积约5.5毫升的凝胶(C10/10，Pharmacia)，或是为80～110毫克血清白蛋白的理论容量。所使用若为BioCad Sprint系统，则流速为2毫升/分钟(150厘米/小时)，若为Pharmacia检测系统则流速为3.5毫升/分钟(260厘米/小时)。所用压力不超过2.5巴，而且实质上视OD测定池而定。
Source 15Q：
第二个步骤是在一种强的阴离子交换剂即Source 15Q(Pharmacia)柱上进行。基质为与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。珠子是均质性的且大小为15微米。令珠子通过大小从20变化至1000纳米的孔隙系统。这些凝胶具有高抗压性并抗高线性流动性(1800厘米/小时以上)，同时亦可维持令人满意的分离度及容量，之所以能够如此，是由于珠子的均质性以及其上可以促成分子与官能团接近的孔隙。
凝胶于pH2～12间呈稳定状态，逾此范围则凝胶易明显损坏，从而减低其容量。
此交换剂的理论固定容量约为25毫克蛋白质/毫升凝胶。当使用0.8毫升柱(PEEK柱，内径4.6毫米ID/长50毫米，Perkin-Elmer)时，其最大容量为20毫克蛋白质。确保有良好的分离度时的实际容量为约此最大容量的10％或2毫克蛋白质。所用流速为5毫升/分钟(1880厘米/小时)并允许快速分离。柱则在15毫升/分钟、150巴下用Poros selfPack系统充填。
·层析(BioCad Sprint)
该BioCad是一种可以在高压下(最大的巴)与在流速0.2～60毫升/分钟下操作的HPLC(高效液相层析)系统。其可连接多达6种缓冲液(目前使用6个通道)并可以使用0.1摩尔浓度碱液(pH12)处理该系统以防止管道与柱过热。
分离过程可以在室温或4℃进行。利用可达的通道之一或经可供小体积(100微升至5毫升)用的注射圈负载样品。该检测系统是使用双通道UV测定池；对UV使用190至450纳米，对可见光使用366至700纳米。传统上，检测核酸是使用254纳米，检测蛋白质是使用280纳米(此是有吸收的诸如酪氨酸、色氨酸与苯丙氨酸等具有苯环的氨基酸)。该系统是完全电脑化的(由Perspective生物系统公司发展的软体)。其可监测每次分离时的所有参数(压力、流速、导电性、光密度、pH等)。
最后，为将非特异性的作用减至最低，将分离的样品回收于50毫升Falcon管中或收集于硅化的Eppendorf管中(Advantec SF-2120收集器)。
·由树状细胞产生胞外体
首先，由外周血液单核细胞前体获得树状细胞。将分离的单核细胞于GM-CSF与IL-13或IL-4的组合下培养(参照WO99/03499申请中所述技术)。为产生胞外体，优选使用未成熟树状细胞群落。
4.2)蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段
将培养上清液在负载于蓝琼脂糖凝胶6快速流动柱前先经600g离心两次与10,000g离心一次。
所用柱为5.5毫升，流速2毫升/分钟(线性流速150厘米/小时，接触时间2.7分钟)、压力约2.5巴(图5)。柱经12毫摩尔浓度BTP缓冲液(150毫摩尔浓度NaCl、pH7)平衡。平衡过后，将上清液负载入柱中，然后以相同缓冲液洗柱直至O.D.下降为止。以12毫摩尔浓度BTP缓冲液(1.5毫摩尔浓度NaCl、pH7)(3至4倍柱体积)洗脱已固定的蛋白质。通过通入水(2～3倍柱体积)随之2倍体积0.1摩尔浓度碱液(pH12)使柱再生。最后则以12毫摩尔浓度BTP(150毫摩尔浓度NaCl、pH7)使柱再次稳定。
蓝琼脂糖凝胶6快速流动柱阶段的定量与定性
如上述，蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段特异地针对蛋白质，例如白蛋白这一培养上清液的主要污染物。使用Biorad技术(在600纳米测量OD)测量蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段每一级分的蛋白浓度。结果列于表1。
表1蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段每个级分的蛋白质浓度 上清液 未吸附 洗脱峰 再生峰蛋白质浓度(毫克/毫升) 3.69 0.18 3.32 1.48体积(毫升) 25 37.5 20 20蛋白质总量(毫克) 92.2 6.7 66.4 29.6产率(％) 100 7.3 72 32.1
蛋白质多数可在洗脱物(72％)或再生液(32％)中测得。未吸附的级分仅代表负载于蓝琼脂糖凝胶6快速流动柱上的总蛋白的7～10％。该阶段特异性针对上清液的主要污染物。为检查蓝琼脂糖凝胶6快速流动柱的特异性，将每一级分于还原条件下沉积在SDS-PAGE凝胶中并以硝酸银染色。对柱的过度负载(50毫升上清液负载于5.5毫升蓝琼脂糖凝胶6快速流动柱)是欲计算柱中每毫升的凝胶可能负载上清液中蛋白质的最大容量(表2)。在本情形中，未吸附的级分的百分比由负载的蛋白量的7％增加至超过30％。此质相当于每毫升蓝琼脂糖凝胶6快速流动凝胶可容纳16至18毫克蛋白质。总之，1毫升的蓝琼脂糖凝胶6快速流动凝胶可以纯化约5～6毫升培养上清液(2.5％HSAAIMV)。这个质对大规模的研究非常重要，这是因为其决定所用的柱的大小，并因此决定此阶段的成本。
表2第一阶段蓝琼脂糖凝胶6快速流动固定相的过度负载研究 上清液 未吸附 洗脱峰 再生峰蛋白质浓度(毫克/毫升) 3.02 0.87 3 1.56体积(毫升) 50 60 20 20蛋白质总量(毫克) 151 52.2 60 31.2产率(％) 100 34.6 39.7 20.6
正如预期的，经600与10,000g离心后，培养上清液的主要污染物为白蛋白。经蓝琼脂糖凝胶6快速流动固定后，可在洗脱液与再生液级分中检测到此污染物。除此污染物外，亦可检测到其他很多低分子量与高分子量的污染物。
该蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段可以消除约90～95％的培养上清液污染物。胞外体则可在蓝琼脂糖凝胶6快速流动的未吸附级分中发现(图6)。
4.3)阴离子交换步骤：Source 15Q(Pharmacia)。
使用0.8毫升的Source 15Q柱，流速为5毫升/分钟(线性流速1880厘米/小时，接触时间0.1分钟)，压力约50巴。直接将蓝琼脂糖凝胶6快速流动的未吸附的级分负载到Source 15Q上(图7)而其盐溶液(NaCl)浓度或pH不变。
结合步骤后，以12毫摩尔浓度pH7的BTP缓冲液(280毫摩尔浓度NaCl)(35倍柱体积)清洗柱直至OD值降至接近0。第二个清洗步骤以150毫摩尔浓度NaCl盐浓度(10倍柱体积)进行，以增强胞外体与载体(固定相)的作用。
所采用的第一个梯度为由150至420毫摩尔浓度的NaCl，7倍柱体积(图8)，然后以9倍柱体积结束该梯度。第二个梯度则以25倍柱体积由420毫摩尔浓度NaCl至1摩尔浓度NaCl。胞外体则在第二个梯度中分别于550与700毫摩尔浓度NaCl洗脱出成两个峰(图8)。通过通入10倍柱体积的水，随之为10倍柱体积0.1摩尔浓度碱液(pH12)以及最后通入10倍柱体积的3摩尔浓度NaCl，使柱再生。然后以12毫摩尔浓度BTP缓冲液(150毫摩尔浓度NaCl、pH7)平衡柱。
Source 15Q阶段的定量与定性。
如图6所示，未吸附的蓝琼脂糖凝胶6快速流动级分的大部分蛋白质皆未保留在柱中。蛋白质浓度是以Biorad实验(在600纳米测量OD吸收)测量的并概括于表3中。
表3蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段后Source 15Q阶段的定性问题起始(蓝琼脂糖凝胶6快速流动的未吸附的 级分) 未吸附 source 15Q 洗脱级分 4～6 洗脱级分 19～23蛋白质(毫克/毫升) 0.17 0.14 0.01 0.02体积(毫升) 85 98 3 5总蛋白(毫克) 14.45 13.72 0.03 0.10产率(％) 100 94.9 0.2 0.8
负载于Source 15Q柱中的蛋白质95％皆未保留。收集的第4～6级分与收集的第19～23级分代表约1.5％。再生级分则未分析。产率接近100％.所有负载的蛋白质与囊泡皆洗脱出柱外。就柱的蛋白质浓度而言，Source 15Q可以结合约25毫克蛋白质(制造商的资料)，对应于0.8毫升柱可以容纳20毫克蛋白质。很清楚地，这些值与柱的最大容量距离很远，并且只占良好灵敏度所对应的容量的5～10％，因为其结合了1～2毫克的蛋白质。在这些条件下，使用0.8毫升Source 15Q柱有可能纯化200～400毫升的培养上清液。
每一洗脱峰皆经超滤(10,000g，1小时)并合并用于进行电子显微镜观测。第一个峰(于150～420毫摩尔浓度NaCl洗脱出)实质上包含蛋白质、细胞碎片与一些经抗MHC II的抗体标记的囊泡。
经相同方式处理的第二个峰(以550毫摩尔浓度NaCl洗脱出)显示较低的背景噪音与较多的以抗MHC II的抗体标记的囊泡，囊泡的大小不均匀。
第三个峰(于700毫摩尔浓度NaCl洗脱出)未显示任何背景噪音，该囊泡实质上均经抗MHC II的抗体标记且其大小非常均一。
以这两个级分(第2与3峰)与那些使用传统超速离心纯化方法所取得的级分做比较。在此情况中，与两个层析峰比较可见明显的背景噪音而且囊泡的非均一性相当高。此外，似乎在碎片与经HPLC纯化的胞外体间有所分离，此在超速离心的情况中并不存在。
4.4)结论
在两个层析阶段中，第一个涉及胞外体的负选择(蓝琼脂糖凝胶6快速流动阶段)，而第二个涉及正选择以及胞外体的选择性洗脱(Source 15Q阶段)，约可消除培养上清液中约99～99.5％的蛋白质，同时仍可保留胞外体。在电子显微镜观察时，该法保持胞外体的完整性。因此，本方法是专门针对胞外体的纯化。
做为实例，亦可使用其他可保留血清蛋白的柱。此外，亦可使用阳离子型大孔柱代替Source 15Q。
5)由RBL(大鼠嗜碱性细胞白血病)细胞系产生的胞外体的HPLC纯化
胞外体由RBL(大鼠嗜碱性细胞白血病)细胞系产生，该细胞系是经稳定方式转染以在胞外体膜上表达人类MHC II分子(PCT/FR99/02691)。经以离子载体(iomicyne)诱导后，细胞脱粒并将胞外体释放至不含蛋白质的培养基(RPMI)中。利用在600g离心10分钟消除细胞后，回收上清液并以脱氧核糖核酸酶(Sigma)与核糖核酸酶(Sigma)处理。
然后，令经过处理的上清液在37℃于10,000g离心30分钟，然后则是于100,000g离心1小时。
将超速离心沉降物负载入离子交换柱Source 15Q(Pharmacia)(图9)。所用为0.8毫升柱，流速为5毫升/分钟(线性流速1880厘米/小时，接触时间0.1分钟)。
柱以12毫摩尔浓度BTP缓冲液(150毫摩尔浓度NaCl，pH7)平衡。负载样品后，以15～20倍柱体积的相同平衡缓冲液冲洗柱。洗脱是以25倍柱体积通过盐溶液浓度由150毫摩尔浓度改变至1摩尔浓度NaCl而进行，pH则固定(图9)。培养基中蛋白质污染很低，这是由于细胞以PBS洗涤，而胞外体的诱导与释放则仅在RPMI中进行。此可由在Source 15Q的未吸附级分中所观测到的吸收(280与254纳米)得到证实。胞外体的存在则利用针对MHC II分子的Western印迹分析证实(图11)，不过其前需先经NaCl分离各峰(图10)并对每一峰进行超速离心。
可观察到3个峰加上一个未吸附级分：第一个峰于350毫摩尔浓度NaCl洗脱出，第二个峰于700毫摩尔浓度NaCl洗脱出，至于最后的第三个峰则于1.5摩尔浓度NaCl洗脱出。700毫摩尔浓度时的峰则为主要峰。在以人类MHC II分子为目标的Western印迹试验中，在峰1(350毫摩尔浓度NaCl)与峰2(700毫摩尔浓度NaCl)测到一个信号。
应注意峰1所显示的Western印迹信号与峰2的信号相当，而蛋白质信号强度比峰2低7～8倍。此可能意味峰1纯度较高。为证实此结果，将各峰进行超速离心并以电子显微镜观察。
峰1富含用抗人类MHC II的抗体标记的胞外体，而且只有很少或没有背景噪音。胞外体的大小不均一，似乎无法利用胞外体的大小进行胞外体的分离，但可利用洗脱液(NaCl)与胞外体间的特异性竞争机制进行分离。
两个峰间的级分则利用电子显微镜分析。所检测到的胞外体只有很少具有比峰1更高的背景噪音。
峰2与两个峰间的级分非常相似，所检测到的胞外体很少，背景噪音较高。
结论
Source 15Q可以保留胞外体并将其与潜在污染物分离(图9)。绝大部分胞外体于350毫摩尔浓度NaCl以同一峰洗脱出。于电子显微镜观察时，胞外体似乎“正常”，且具有针对人类MHC II分子的特异性标记。胞外体大小的不均一性(峰1)显示该分离是基于离子交换而非筛选。因此，可使用Source 15Q作为RBL胞外体的纯化步骤。