一种新型乙肝治疗性疫苗及其制备方法 【技术领域】
本发明属生物工程领域，具体涉及一种新型乙肝治疗性疫苗及其制备方法技术背景
乙型肝炎，特别是慢性乙型肝炎的防治是目前尚未解决的世界难题。机体的免疫机制不能有效地清除病毒，是造成肝炎持续的一大原因。以免疫学手段激发、增强、调控机体抗HBV特异性免疫应答，可从根本上清除病毒，是防治HBV持续感染的关键。然而，由于我国乙肝病毒携带者众多，且多为病毒持续感染，机体对该病毒在一定程度上产生了免疫耐受，天然结构的病毒蛋白一般难于诱生特异性免疫应答。因此，很有必要经过分子设计，重新构建，以获得一与原天然病毒蛋白结构类似、但又不同的新的免疫分子，用于乙肝病毒感染的防治。抗原表位(epitope)是抗原分子中诱生不同免疫应答最基本的结构及功能单位。抗原刺激机体产生免疫应答，其本质是抗原分子中不同的抗原表位作用于多种免疫细胞的结果。
抗体化抗原的(Antibodyzed Antigen)的基本思想是利用抗体可变区CDR结构的外显、限构和强免疫原性的特点，将抗原表位克隆表达于抗体分子中，使抗原分子抗体化，实现以抗体为载体、以抗原表位为基础的新型免疫分子的设计。这一新型的免疫分子至少具备以下特点：1)以抗体为载体表达抗原表位多肽，解决了常规方法不能表达抗原表位短肽的缺点；2)CDR限定地空间构象可保证表位正确及稳定的免疫原性，解决了常规多肽交联蛋白构象不稳定的缺点；3)CDR结构上的外显，使得表位的可接近性(Accessibility)好，易被吞噬及提呈，解决了常规交联技术导致的表位内陷而致的空间构型障碍(Stereohindrance)；4)抗体分子因其本身巨大的分子量，是一很好的抗原载体，更增强了抗原表位的抗原性。目前国外尚无有关抗体化抗原制备乙肝治疗性疫苗的应用性开发研究报道。技术内容
本发明的目的是提供一种新型乙肝治疗性疫苗及其制备方法。本发明以抗体化抗原技术，构建一以抗体为载体，以抗原表位为基础的新型乙肝治疗性疫苗，该疫苗具有分子量足够大、免疫原性强且稳定、表位空间构象限定的特点。
本发明采用了裸质粒DNA免疫技术，以抗体分子为载体、以抗原表位为基础，将抗原中激发免疫应答最关键的结构功能单位—抗原表位克隆到抗体分子中，将抗原、抗体集于同一分子中，制成新型乙肝治疗性疫苗。
本发明的技术方案是通过下述步骤实现的：1.选择及克隆表达乙肝病毒B细胞抗原表位
根据以往的工作基础及计算机辅助分析，确定了用于HBV特异性新型治疗性疫苗分子设计的B细胞抗原表位：HBpreSAg 133-145aa，其氨基酸序列为DPRVPGLYFPAGG。以质粒Bluescript II KS(商售)为骨架，以氨苄青霉素抗性基因(Ampr)为筛选标志，自杂交瘤细胞中克隆抗体重链VH基因及其表达调控元件，亚克隆至Bluescript IIKS，并将人工合成引物并退火形成的P133-145编码基因序列插入该质粒Asp718位点，再将其亚克隆于含人IgG完整CH编码基因的真核表达载体γ1Neo中，与人抗体恒定区编码基因连接，获得了可表达该抗原表位的全抗体重链分子的真核表达重组体γB，经酶切分析及DNA测序证实序列和插入方向的正确性。2.γB构象限定性表达乙肝病毒B细胞抗原表位
抗原表位被认为是最理想的新型疫苗的靶抗原成分。然而，表位多肽的小分子量、构象的不稳定性很大程度上限制了抗原表位的实际应用。尽管各类交联载体如脂质体、ISCOMS等及各种构建方法如SMAA、MAP等一定程度上改善了表位多肽的免疫原性，但难以以化学结构明确、结构外显、空间限构的方式同时表达抗原表位。基于这一背景，本发明选择在抗体CDR中表达抗原表位，构建了γB，以γB转染Ig重链缺失的J558L细胞，以G418筛选阳性克隆，获得稳定传代和表达Ig的细胞株。结果证实抗体分子克隆乙肝B细胞抗原表位后，并不改变抗体的分泌功能；重组的重链在体外转染细胞中与内源性轻链结合，装配成H2L2结构，抗原表位能有效表达，并且能与相应抗体结合，提示抗体CDRs表达的表位多肽具有与天然蛋白中抗原表位类似的空间构象。3、γB可诱导乙肝特异性免疫应答
以纯化的重组表达的γB抗原化抗体免疫C57BL雌性小鼠，结果发现免疫后一周左右便可在全部免疫小鼠外周血中检出抗HBV PreS2120-145肽段的IgG抗体，抗体效价在1∶200-1∶400，以后抗体效价逐渐升高至1∶800，并维持一较长的时间，约6周以上。
以γB DNA直接经脾免疫小鼠，结果自接种后的第五天起几乎所有小鼠血清中均可检出人源化抗体，高峰持续约二周。表明γB在体内均可正确转录、翻译；表达的转基因可与内源性的Ig轻链结合，装配成完整Ig分子，自分泌出细胞。
以γB直接免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠，结果发现：单次DNA接种后2周左右便可检出HBV特异性抗体，其效价可高达1∶800；持续至少10周以上；进一步分类检测IgM抗体和IgG，结果发现：特异性IgM自免疫后第2周便可检出，第6周左右达到高峰，滴度为1∶600，持续时间可达10周；特异性IgG抗体水平较低，仅在第6至第8周间略有一过性升高。
以同一抗体化抗原基因(γB)免疫C57BL/6小鼠，在体内亦诱导出持久的、高水平的特异性抗体；其IgM抗体平均滴度与BALB/c中相似，并在免疫后第6周左右有一高峰，滴度为1∶1200；在C57BL/6中IgG抗体应答于第2周达高峰，滴度为1∶800，持续检出达6周左右。表明该疫苗具有较强的免疫原性，可诱生乙肝特异性免疫应答，提示具有治疗慢性乙肝的潜能。4.制备本发明新型乙肝治疗性疫苗
1)选择克隆一HBV特定序列作为乙肝病毒特异性B细胞抗原表位序列；
2)合成该序列的编码基因，克隆于抗体分子的CDRs中；
3)转化原核细胞，大规模抽提该质粒DNA；
4)将纯化的上述DNA溶解于生理盐水中，使其达到2μg/μl浓
度，得本发明疫苗，该溶液可直接接种宿主。本发明新型乙肝治疗性疫苗的特点是：
1)是一种抗体分子；
2)是一种经乙肝病毒B细胞表位抗原化的抗体分子；
3)该抗体化抗原可有效表达乙肝B细胞抗原表位；
4)有效表达的B细胞抗原表位可诱生乙肝特异性免疫应答；
5)该抗体化抗原是有治疗慢性乙肝的作用。附图说明：图1是γ1-HB DNA序列测定结果
图2是γB的SDS-PAGE结果
图3是多能抗原化抗体中B细胞抗原表位的检测
其中A.Anti-HBV PreS2；
B.unspecific Ab1；
C.unspecific Ab2
图4是多能抗原化抗体基因免疫小鼠后转基因产物的体
表达
其中a.BALB/c小鼠；b.C57BL/6小鼠；
图5基因免疫BALB/c小鼠血清中抗HBV特异性抗体的
检测
其中a.特异性总抗体；
b.特异性IgM抗体；
c.特异性IgG抗体
图6是基因免疫C57BL/6小鼠血清中抗HBV特异性抗
体的检测其中a.特异性总抗体；
b.特异性IgM抗体；
c.特异性IgG抗体