鱼类用的虹彩病毒或链球菌 感染症及其并症的混合灭活菌苗 本发明涉及有效预防已确认的，由鱼类、例如鲈形目、鲀形目、鲽形目等鱼类、如黄鲷、锄齿鲷、条石鲷、斑石鲷、鲈形鱼、鰤鱼、紫鰤鱼、黄条鰤鱼、大甲鲹、鲭鱼、红鳍圆鲀鱼、石斑鱼、比目鱼、草鮨鱼等感染和引发症的由虹彩病毒及链球菌产生的两种感染症、及这些并发症的混合灭活菌苗，及其制造方法。
关于鱼类的虹彩病毒感染症和它的菌苗已在特开平9-176043号中详细论述，而对于鱼类的链球菌感染症的预防在特开平8-231408号中作了论述。对于这些感染症的菌苗市场上已有出售，但对两种感染症有效免疫原性谱广的混合菌苗的完成还仍未知。
近10年来，伴随着养殖业的兴盛和养殖鱼种的多样化，鱼类的感染症，例如，黄鲷、鰤鱼、紫鰤鱼等虹彩病毒(Iridovirus)感染，由Lactococcus garvieae引发的链球菌感染症、由Pasteurella piscicida引发地类结节症，及孤菌属感染症等，及它们的并发症频频发生。结果，越发造成经营危机，常常造成极大的损害，养殖鱼的死亡和因质量不合格引发的病鱼废弃等。这样，在与养殖业相关的产业中，至今形成一个预防鱼类感染症的最重要课题。进而，在这种状况下，使用化学剂疗法又衍生出耐药性菌，难以对感染症形成对策。同时，其肢体的选择也很狭窄，由于提高了养殖费用，所以，鱼类用作预防剂的菌苗越发受到重视。虽说是虹彩病毒感染症和链球菌感染症等菌苗已实际应用，但是，这些的各种菌苗免疫原性还没有涉及到这些的并发症。就宏观上看，这种并发症是降低菌苗预防效果的重要原因。因此，当今迫切的课题是，不仅仅对这些的各种感染症，而且对于并发症，也期望一种有效的免疫原性谱广的菌苗，及其实用化。
该发明为解决上述课题，而提出一种对预防已确认的由鱼类，例如鲈形目、鲀形目、鲽形目等鱼种，如黄鲷、锄齿鲷、条石鲷、斑石鲷、鲈形鱼、鰤鱼、紫鰤鱼、黄条鰤鱼、大甲鲹、鲭鱼、红鳍圆鲀、石斑鱼、比目鱼、草鮨鱼等感染和引发症的由虹彩病毒和链球菌引发的两种感染症以及这些的并发症是有效且安全的、而且对病原体免疫原性是特异的混合灭活菌苗，及其制造方法。即，根据本发明分别提供：
(1)混合灭活菌苗的制造方法，其特征是将来自鱼类虹彩病毒感染症病原体的灭活抗原和来自链球菌感染症病原体的灭活抗原，至少2种进行混合；和
(2)一种混合灭活菌苗，通过将来自鱼类虹彩病毒感染症病原体的灭活抗原和来自链球菌感染症病原体的灭活抗原，至少2种进行混合制备。
该发明可达到快速、省力地预防虹彩病毒感染症、链球菌感染症以及这两种的并发症，而且费用低廉。
(1)来自虹彩病毒感染症病原体的抗原：可以使用从因鱼类虹彩病毒的感染而发病或死亡的鱼类，例如鲈形目、鲀形目、鲽形目等鱼类，如黄鲷、锄齿鲷、条石鲷、斑石鲷、鲈形鱼、鰤鱼、紫鰤鱼、黄条鰤、大甲鲹、鲭鱼、红鳍圆鲀、石斑鱼、比目鱼、草鮨鱼等切割或摘取的器官，例如从脾脏、心脏、肾脏、鳃、肝脏等分离出的虹彩病毒株，例如以黄鲷虹彩病毒Ehime-1株作为病原体。作为来自这种病原体的抗原，可以使用完全病毒粒子的成病毒粒子、不完全病毒粒子、成病毒粒子构成成分和它的翻译后修饰体、成病毒粒子构成成分MCP(majorcapsid protein)，成病毒粒子非构造蛋白和它的翻译后修饰体，防御感染抗原、中和反应的表位等。作为大量生产抗原的虹彩病毒培养宿主可使用公知的细胞殊，例如BF-2(ATCC No.CCL58)，FHM、CHSE-214，JSKG，KRE-3，RTG-2，YTF，GF(ATCC No.CCL91)等。另外，特开平9-176043中详细讲述了对虹彩病毒感染症的菌苗和它的制造方法。
(2)来自链球菌感染症病原体的抗原：作为鱼类链球菌感染症的病原体，现在利用DNA-DNA杂交，已知有至少以下5种，Streptococcus iniae(与S.Shiloi意义相同)，Streptococcus difficile，Lactoccus garvieae(与Enterococcus Selioricida意义相同，α溶血性链球菌感染症的病原体)，Lactococcus Piscium，及Vagococus Salmoninarum(Development ofBiological Standardozation，Vol，90，pp.153-160，1997)。在本发明中，这些病原体，例如可使用NCDO 2155(ATCC No.43921)，YT-3(ATCC No.49156)，S-1477(ATCC No.49157)，α溶血性链球菌No.43株等。作为来自这些病原体的抗原，可使用各种表现型的全菌体，防御感染抗原、中和反应的表位等。关于表现型，例如已知Lactococus garvieae中，KG-(非凝集性，有荚膜)及KG+(凝集性，没有荚膜)的2种表现型，作为免疫原是有用的(Diseases of AquaticOrganism，Vol.37，pp.121-126，1999)，在本发明中可将这些表现型的菌体用作抗原。将来，来自从链球菌感染症的鱼类分离出的病原体的抗原，也可和上述一样使用。作为大量生产这种抗原的病原菌体培养基，可以使用培养细菌用的公知固体培养基和液体培养基，例如，琼脂培养基、肉汤培养基等。
(3)灭活抗原的调制：在本发明中，对于来自上述病原体的抗原，以灭活形抗原使用。调制灭活抗原，例如，用灭活剂对成病毒粒子和菌体等作用，使这些的感染能力失去活性。为了使抗原固定化，使其立体结构稳定化，也使用这种灭活工序。作为灭活剂，例如，将甲醛、戊二醛、β-丙内酯等，在菌苗原液的调制前或调制后添加混合后使用。使用甲醛时，其添加量约为0.0004-0.7％(V/V)，灭活温度约为2-37℃，灭活时间约为5-180天。但是，在由灭活损害了抗原性或免疫原性时，需要想办法缓和灭活条件。例如，通过减少灭活剂的量，添加混合中性氨基酸或碱性氨基酸等，降低灭活温度等，达到这种缓和。在灭活工序中残留的游离甲醛，并不需要，可以添加等量的亚硫酸氢钠，将其中和，或利用透析将其去除。
(4)混合灭活菌苗的调制：关于灭活抗原的量，例如，病原体为虹彩病毒时，用盐类溶液或培养基等，例如，Dulbecco的PBS(phosphate-bufferedSaline)，BME(Basal Medium Eagle)等，将菌苗进行稀释，使灭活前的感染病毒量TCID50(Median Tissue Culture Infective Dose)换算成对数值log(TCID50/ml)约为4-8。病原体为Lactococcus garvieae时，将菌苗原液和上述一样进行稀释，使灭活前的感染菌体量CFU(Colony Forming Unit)换算成对数值log(CFU/ml)约为4-9。即，通过这种稀释，将灭活抗原的量调整成诱导免疫所需要的量。接着，将这样得到的灭活抗原，即，来自虹彩病毒感染症病原体至少1种的灭活抗原和来自链球菌感染症病原体至少1种的灭活抗原进行混合，调制成混合灭活菌苗。
在混合2种以上灭活抗原时，特别注意的是由这种混合引起菌苗副作用的增强或增幅，及抗原相互的干涉，例如，在混合前各种抗原中特异的抗原性和免疫原性的降低或消失，这些诸现象任何一个必须确认在混合后完全没有。在不能确认时，其混合或组合是不适合的。在将来自虹彩感染症和链球菌感染症各种病原体的灭活抗原混合中，确保了上述的抗原性和免疫原性，而且没有见到副作用，这样的2种混合适于作菌苗，根据这样的见解才完成了本发明。
进而，在菌苗调制中，也可添加混合用于增强其耐热性的稳定化剂，和作为提高免疫原性的辅助剂的佐剂。例如，作为稳定化剂，可用糖类或氨基酸类，作为佐剂，可使用矿物油、植物油、硫酸铝钾、磷酸铝、膨润土、硅石、氨基缩二氨酸衍生物、胸腺素、中间白氨酸等。接着分别注入到适当容积，例如10-500ml的小玻璃瓶内，用塞子塞住或密封后，供作菌苗使用。这种菌苗，不仅以液状使用，也可分注后进行冷冻干燥，作为干燥制剂使用。干燥制剂，在使用前，用添加灭菌液将干燥物质完全溶解后再用。
调制的菌苗制剂，在使用或向市场出售之前，为保证其质量，必须进行安全性和有效性的检定。有关检定的各种试验，可按照药事法(昭和35年法律第145号)「动物用生物学的制剂基准」中规定的「黄鲷虹彩病毒感染症灭活菌苗」，「鰤鱼α溶血性链球菌症灭活经口菌苗」等「动物用生物学的制剂检定基准」进行检定。
(5)混合灭活菌苗的用法：可用具有感染危险性的任意年龄的鱼类。但是，从养鱼保方的角度考虑，最好使用小鱼或鱼菌。作为使用方法，例如可采用腹腔内，筋肉内、或皮下接种，浸渍法，经口服用等，在利用接种免疫中，每1个剂量的菌苗，最好使用0.05-1.0ml，在利用浸渍免疫中，可用饲育水或低注饲育水将菌苗稀释10-10000倍后再用，该菌苗在冷冻或冷温下，约2-8℃的冷暗处保存。
本发明的混合灭活菌苗对于同时免疫鱼类的虹彩病毒感染症和链球菌感染症二者或预防它们的并发症极为有效。
以下利用参考例和实施例具体地说明本发明的形态及构成和效果。但是，本发明不限于这些例证。
参考例1
虹彩病毒的大量生产：将黄鲷虹彩病毒Ehime-1/GF14株用作种子，大量生产虹彩病毒(菌苗用抗原)。
将BME(Basal Medium Eagle)用作培养基，对在5个1升容积瓶内培养的GF细胞单片上接种上述种子病毒(感染多重度MOI＝0.01)，25℃下静置培养14天，从开始培养第3天进行更换新培养基。但是，培养到第10-14天期间不再更换培养基。在第14天，CPE(Cytopathogenic effect)细胞单片约达80％，采取培养液。低速离心(3000rpm，20分钟)后，回收上清液得到500ml病毒浮游液。
虹彩病毒量的测定：对GF细胞接种培养稀释10倍(以及10倍的倍数)的病毒浮游液。判定各稀释点有无CPE，测定病毒感染值，log(TCID50/ml)，结果，病毒量(抗原量)为6.0。
灭活虹彩病毒抗原和菌苗原液的调制：在300ml病毒浮游液中添加混合甲醛，使最终浓度为0.03％(V/V)，6℃下，进行25天灭活。灭活结束后，作为灭活菌苗原液保存在4℃的冷暗室中。
灭活菌苗原液的检测：分取100ml灭活菌苗原液，按照药事法(昭和35年法律第145号)「动物用生物学的制剂基准」规定的「黄鲷虹彩病毒感染症灭活菌苗」检测基准，进行灭活试验、染色试验、甲醛含量试验、无菌试验等。结果可以确认这种菌苗原液适合于作为灭活菌苗原液。
参考例2
链球菌的大量生产：使用α溶血性链球菌No.43株作菌种，大量生产链球菌(菌苗用抗原)。
在2升容积的培养容器中，500ml的肉汤培养基(在1升中分别含有17.0g胰化胨、3.0g大豆胨，2.5g葡萄糖，2.5g磷酸氢二钾和5.0g氯化钠)中，植入0.5ml上述种菌后，30℃下培养24小时。
上述培养结束后，分取培养液，用Dulbecco的PBS稀释10倍(或10倍的倍数)，将其接种到内径6cm的琼脂板上后，30℃下培养24小时，对生成的α溶血性菌落进行计数，并计算菌数。结果，感染菌体数(抗原量)log(CFU/ml)为8。7。对于琼脂板，使用血液琼脂培养基(在1升中分别含有14.5g胨，5.0g大豆胨，5.0g氯化钠、1.5g成长因子、14.og琼脂和50ml绵羊脱纤维血液)。
灭活链球菌抗原和菌苗原液的调制：在300ml上述链球菌培养液中添加混合甲醛，使最终浓度为0.1％(V/V)，30℃下进行5天灭活。灭活结束后，作为灭活菌苗原液，保存在4℃的暗室中。
灭活菌苗原液的检测：取100ml灭活菌苗原液，按照药事法(昭和35年法律第145号)「动物用生物学的制剂基准」中规定的「鰤鱼α溶血性链球菌感染症灭活经口菌苗」的检测基准，进行灭活试验、染色试验、甲醛含量试验、无菌试验等。结果可以确认这种菌苗原液，作为灭活菌苗原液是适合的。
实施例1
混合灭活菌苗的调制：分别取50ml参考例1和参考例2中得到的两种菌苗原液，将两者混合，调制成混合灭活菌苗，将其命名为虹彩·链混合灭活菌苗(以下称作「2混」)。
在上述各菌苗原液50ml中分别添加混合50ml PBS，调制成虹彩灭活菌苗(以下称作「虹彩」)，和链灭活菌苗(以下称作「链」)。
将这些菌苗向每个20ml容积玻璃瓶内注入10ml用塞子堵住，密封后，提供给实施例2中记载的安全性和有效性试验，实施例3和实施例4中记载的试验。
实施例2
2混的安全性和有效性：为了确认实施例1中调制的2混菌苗的安全性和有效性，每次分别使用200条鰤鱼(体重18.65～28.34g，体长12.0-13.3cm)和紫鰤鱼(体重17.83-29.52g，体长10.6-12.5cm)。采用直接攻击法进行试验。即，首先，将上述两种小鱼以每试验区25条随意地分配到8个试验区内后，将接种了2混菌苗的试验区，作为它的对照比较，与接种了实施例1中调制的虹彩和链各菌苗的试验区，及没有接种菌苗的未处理试验区进行比较。接着，在各小鱼的腹腔内接种0.1ml菌苗后，在第11天，向各小鱼的腹腔内接种0.1ml虹彩病毒(106T CID 50/条)或链球菌(106CFU/条)，进行直接攻击，在饲育下观察有无引发症状。饲育是在水温25±1℃的隔离水槽内进行(向容积60升的水槽内装入40升海水，以2升/分钟向其内流入新鲜海水，并以等量排出旧海水，进行连续更换饲育海水)。结果示于表1。
本发明的虹彩·链混合灭活菌苗，既安全又有效，作为其效果的免疫原性是各病原体特异的。
根据下式计算出表中的RPS(relative percent Survival)：
RPS＝[(未处理区死亡率-接种区死亡率)/未处理区死亡率]×100表1
鱼名 试验区/接种菌苗 攻击 累积死亡鱼数 死亡率 RPS
鰤鱼 2混 虹彩 2/25 8 90
2混 链 1/25 4 95
虹彩 虹彩 1/25 4 95
虹彩 链 22/25 88 -
链 虹彩 18/25 72 14
链 链 0/25 0 100
未处理 无 虹彩 21/25 84 -
未处理 无 链 23/25 92 - 紫鰤鱼 2混 虹彩 1/25 4 95
2混 链 0/25 0 100
虹彩 虹彩 2/25 8 90
虹彩 链 19/25 76 5
链 虹彩 21/25 84 -
链 链 0/25 0 100
未处理 无 虹彩 20/25 80 -
未处理 无 链 20/25 80 -
实施例3
2混的接种部位对安全性和有效性的影响：为了确认实施例1调制的2混菌苗不同的接种部位与安全性、有效性的关系，使用350条小鰤鱼(体重17.28-26.54g，体长11.8-13.1cm)，进行直接攻击试验。将这些小鱼以每试验区25条随意地分配在14个试验区内后，向各小鱼的腹腔内，或筋肉内接种0.1ml菌苗。对接种2混菌苗的试验区设定时照比较，利用直接攻击的试验方法，和实施例2记载的一样进行饲育观察、及计算出RPS。
结果示于表2。本发明的虹彩·链混合灭活菌苗，即使采用腹腔内和筋肉内任何一种接种，都具有安全性有效性。表2 接种 试验区/接种菌苗 攻击 累积死亡鱼数 死亡率 RPS腹控内 2混 虹彩 1/25 4 95
2混 链 0/25 0 100
虹彩 虹彩 2/25 8 91
虹彩 链 24/25 96 4
链 虹彩 19/25 76 14
链 链 0/25 0 100筋肉内 2混 虹彩 0/25 0 100
2混 链 1/25 4 95
虹彩 虹彩 1/25 4 95
虹彩 链 23/25 92 8
链 虹彩 21/25 84 8
链 链 0/25 0 100未处理 无 虹彩 22/25 88 -
无 链 25/25 100 -
实施例4
2混菌苗对虹彩·链混合感染的预防效果：除以下几点外，其他和实施例2记载的一样。将50条小鰤鱼(体重17.13-26.67g，体长11.6-13.2cm)，每区25条随意分配到试验区和对照比较区(未处理区)的合计2个区内后，向试验区中的各小鱼腹腔内接种0.1ml 2混菌苗，未处理区中的小鱼不进行接种菌苗。混合感染的直接攻击是在接种菌苗后的第11天，分别向小鱼腹腔内接种0.1ml的虹彩病毒(106 TCID 50/条)和链球菌(106 CFU/条)。随后，观察结果是死亡率，未处理区为96％·接种菌苗的试验区为4％，RPS为96，从而可以断定本发明的2混对预防虹彩，链的混合感染是有效的。
本发明对于预防虹彩病毒感染症，链球菌感染症，及两者的并发症，从地理，时间观点考虑都达到了迅速，省力的效果，而且劳力，经费等成本都很低廉。因此，在养殖业及其相关产业中，提高了生产率和质量，并大大改善了养殖中的环境卫生，同时也给这些产业带来了福音。