非抗性筛选DNA疫苗载体及其构建方法 【技术领域】
本发明涉及一种DNA疫苗载体以及构建的方法。
背景技术
DNA疫苗自1990年被发现以来在人类医学和动物医学领域已取得很大的进展，作为第三代疫苗，它可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，具有制备相对简单，运输保存容易，可方便构建多价疫苗和加入多种免疫佐剂分子等优点。但限制其应用的一个主要问题是“安全性问题”。目前商品化的DNA疫苗载体中均含有抗生素抗性基因作为选择性标记，而细菌的抗生素耐药性问题日益严重，已成为全球性共同关注的问题，因此DNA疫苗上抗生素抗性基因成为阻碍DNA疫苗发展和大规模应用的一大障碍。
【发明内容】
本发明目的在于发明一种无选择性的DNA疫苗载体。
本发明具有以下特征：载体全长3114bp，其序列为：
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780
ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080
aagcgaaccg gaattgccag ctggcacatc tctttgcagg aaaaaaacgc tatgaaaaat 1140
gttggtttta tcggctggcg cggaatggtc ggctctgttc tcatgcaacg catggtagag 1200
gagcgcgatt tcgacgctat tcgccctgtt ttcttttcta cctcccagtt tggacaggcg 1260
gcgcccacct tcggcgacac ctccaccggc acgctacagg acgcttttga tctggatgcg 1320
ctaaaagcgc tcgatatcat cgtgacctgc cagggcggcg attataccaa cgaaatttat 1380
ccaaagctgc gcgaaagcgg atggcagggt tactggattg atgcggcttc tacgctgcgc 1440
atgaaagatg atgccattat tattctcgac ccggtcaacc aggacgtgat taccgacggc 1500
ctgaacaatg gcgtgaagac ctttgtgggc ggtaactgta ccgttagcct gatgttgatg 1560
tcgctgggcg gtctctttgc ccataatctc gttgactggg tatccgtcgc gacctatcag 1620
gccgcctccg gcggcggcgc gcgccatatg cgcgagctgt taacccagat gggtcagttg 1680
tatggccatg tcgccgatga actggcgacg ccgtcttccg caattcttga tattgaacgc 1740
aaagttacgg cattgacccg cagcggcgag ctgccggttg ataactttgg cgtaccgctg 1800
gcgggaagcc tgatcccctg gatcgacaaa cagctcgata acggccagag ccgcgaagag 1860
tggaaaggcc aggcggaaac caacaagatt ctcaatactg cctctgtgat tccggttgat 1920
ggtttgtgtg tgcgcgtcgg cgcgctgcgc tgtcacagcc aggcgttcac catcaagctg 1980
aaaaaagagg tatccattcc gacggtggaa gaactgctgg cggcacataa tccgtgggcg 2040
aaagtggtgc cgaacgatcg tgatatcact atgcgcgaat taaccccggc ggcggtgacc 2100
ggcacgttga ctacgccggt tggtcgtctg cgtaagctga acatggggcc agagttcttg 2160
tcggcgttta ccgtaggcga ccagttgtta tggggcgccg ccgagccgct gcgtcgaatg 2220
ctgcgccagt tggcgtagtg gctattgcag cgcttatcgg gcctgcgtgt ggttctgtag 2280
gccggataag gcgcgtcagc gccgccatcc ggcggggaaa tttgtgttaa accaggggtg 2340
catcgtcacc ctttttttgc gtaatacagg agtaaacgca gatgtcatga ccaaaatccc 2400
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2460
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2520
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 2580
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2640
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2700
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 2760
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2820
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2880
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 2940
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3000
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3060
cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tctt
另外，本发明还对具有上述特征的DNA疫苗载体提供构建方法，即将扩增的鼠伤寒沙门氏菌asd用pVUII和PagI双酶切；用pVUII和PagI双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后将asd基因与去除卡那霉素抗性基因的载体进行连接。
本发明采用染色体-质粒平衡致死系统代替抗生素抗性基因来作为DNA疫苗扩增的选择性标记，构建新型非抗性筛选DNA疫苗载体，与质粒pVAX1相比，缺失其中的卡那霉素抗性基因，取而代之的是长度为1281bp的鼠伤寒沙门氏菌asd基因，从而避免了抗生素抗性基因的潜在性危险问题。
具体实施例
1、鼠伤寒沙门氏菌asd基因的扩增
鼠伤寒沙门氏菌YZ1392(本室分离)用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，浓度为109CFU/mL，100℃加热10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液5μL进行PCR扩增反应，采用引物如下：
正义：5’aaa cag ctg gca cat crc ttt gca gga a 3’
反义：5’gcc tca tga cat ctg cgt tta crc ctg t 3’
正义和反义引物分别含pVU II和Pag I酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系为50μL：
细菌裂解上清：5μL
10×缓冲液：5μL
上游引物(50μmol/L)：0.5μL
下游引物(50μmol/L)：0.5μL
Taq酶(3U/μL)：0.5μL
4种dNTP混合物(2.5mmol/L)：4μL
超纯水：35.5μL
PCR反应条件为：94℃ 40S，57℃ 40S，72℃ 60S，共30个循环，结束后用浓度为0.8％琼脂糖电泳分离，回收长1281bp的asd基因。
2、新DNA疫苗载体地构建
回收的asd基因用pVU II和Pag I双酶切，同时用pVU II和Pag I双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后将asd基因与载体进行连接反应，体系如下：
asd基因(pVU II-Pag I)：3μL
pVAX1(pVU II-Pag I)：1μL
连接缓冲液：1μL
T4 DNA连接酶(1U/μL)：1μL
超纯水：4μL
4℃连接16小时，然后转化asd基因缺失型大肠杆菌X6212，涂布LB平板，37℃培养24小时后，挑取生长菌落LB液体培养，提质粒鉴定。
新质粒先采用酶切鉴定。采用pVU II和Pag I双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约1.3kb的目的条带，然后将新质粒的插入序列进行测序，测序引物分别是：5’aaa cag ctg gca cat ctc ttt gca gga a 3’
5’caggcatgctggggatgog 3’
5’tcgccgatgaactggcgac 3’
测序证实原来质粒中的卡那霉素基因已被删除，长1281bp的asd基因成功连入，形成长3114bp的非抗性筛选DNA疫苗载体(以下简称pYZU)。
应用实验：
1、携带红色荧光蛋白(DsRed)基因的pYZU-DsRed体外转染COS-7细胞结果
从携带红色荧光蛋白基因的质粒pDsRed-Express(BD Biosciences Clontech公司)上切下DsRed基因，装入pYZU和pVAX1的相应位点得pYZU-DsRed和pVAX-DsRed(BamH I-EcoR I)，然后进行体外转染实验，每个质粒转染三个孔的细胞。
转染前一天接种4×105的COS-7细胞至直径35mm的培养皿中，转染当天先用100微升无血清，无抗生素DMEM(由GIBCOBRL公司生产的一种细胞培养用培养基，英文全称为Dulbecco’s Modified)培养基稀释1.5微克的质粒，然后加入10微升PolyFect(由QIAGEN公司生产的一种转染试剂，英文全称为PolyFect®；Transfection)转染试剂，混匀，室温放置5-10分钟，再加入600微升完全DMEM培养基，混匀，直接转至经PBS洗涤过含1.5毫升完全DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养24小时，胰酶消化后进行流式细胞仪检测，发红色荧光细胞占总细胞的比例判为转染效率。
实验结果显示pYZU-DsRed转染COS-7细胞的转染效率为54.1±4.5％，对照组pVAX-DsRed转染效率为52.3±3.2％，两者转染效率类似。
2、携带乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的pYZU-HBsAg肌肉注射途径免疫小鼠实验结果
从质粒pRc/CMV-HBs(S)(Dr.Robert Whalen赠送)上用Kpn I和Not I切下HBsAg基因装入pYZU和pVAX1的相应位点得pYZU-HBsAg和pVAX-HBsAg。8周龄BALB/c小鼠在第0，4周分别在双侧股四头肌注射100微升PBS溶解的100微克的质粒(每侧50微升)。分别于第在首免后的第0，4，8周小鼠眼眶静脉窦采血，分离的血清用间接ELISA法(厦门新创公司试剂盒)测定HBsAb抗体。结果显示以pYZU为载体的DNA疫苗可诱生比pVAX1为载体的DNA疫苗稍强的抗体免疫应答。
附表pYZU-HBsAg质粒免疫小鼠后血清抗体滴度水平
免疫组 编号 零周 第四周 第八周
pYZU-HBsAg 1 ＜1∶5 1∶320 1∶1280
2 ＜1∶5 1∶20 1∶160
3 ＜1∶5 1∶320 1∶640
4 ＜1∶5 1∶80 1∶320
5 ＜1∶5 1∶10 1∶80
6 ＜1∶5 1∶320 1∶1280
7 ＜1∶5 1∶160 1∶640
8 ＜1∶5 1∶80 1∶320
pVAX-HBsAg 1 ＜1∶5 1∶80 1∶640
2 ＜1∶5 1∶20 1∶80
3 ＜1∶5 1∶20 1∶320
4 ＜1∶5 1∶80 1∶320
5 ＜1∶5 1∶10 1∶80
6 ＜1∶5 1∶160 1∶640
7 ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5
8 ＜1∶5 1∶20 1∶160
空载体组
pYZU 1-6 ＜1∶5 ＜1∶5 ＜1∶5
由上述实验得出：
1、DNA疫苗载体中用天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Asd)基因代替了抗生素抗性基因，新型非抗性筛选DNA疫苗载体质粒避免了抗生素抗性基因的潜在性危险。
2、体外和体内实验表明pYZU具有与原载体pVAX1相似或稍强表达外源基因和激发机体免疫应答的能力，为该载体推广使用奠定了坚实的基础。