多卤取代二苯醚类衍生物的制备和医药用途 技术领域：本发明从西太平洋帕劳(Palau)群岛海域采集的海绵(Phyllospongia dendyi)中分离得到多个多卤取代二苯醚类化合物。这些化合物在体外可以显著抑制海星卵母细胞的成熟分裂，用于防治沿海一带因海星大量繁殖对鱼苗养殖业等造成的损害，还可能用作与之相关的细胞周期分裂机制的生化试剂。体外研究结果表明这些化合物还是一类新的微管蛋白聚集抑制剂，不仅可用作体外研究微管蛋白聚集的生化试剂，并可能发展成为重要的抗癌药物。
背景技术及文献：恶性肿瘤是威胁人类健康，危及人类生命的严重疾病。多数恶性肿瘤患者的生存率比较低，生活质量差，医疗费用昂贵。在人们日益追求高质量生活的今天，寻找高效、低毒、廉价的抗癌药物，已经成为世界范围内医药工作者的研究热点。在人们寻找抗癌药物的过程中，天然产物以它高度的化学多样性为我们提供了大量的先导化合物和候选化合物[1]。
人体的细胞每时每刻都在不断的衰老，死亡，更新。因此，细胞周期的异常与很多疾病的发生发展都有着密切的关系，正常情况下哺乳动物体内地大部分细胞处于休止期(G0期)，只有在一定条件下(如生长因子刺激)才进入G1期。分裂后的细胞大都重新进入G0期或是分化形成成熟的不分裂细胞，少数进入G1期进行下一次分裂。细胞有丝分裂的周期性和顺序性说明细胞周期是一个受到严格调控的过程，一旦某个环节出现缺陷，就可能导致细胞增殖失控，进而产生肿瘤。大规模筛选细胞周期抑制剂，一般采用流式细胞术方法(FlowCytometry，FCM)，但这种方法需要昂贵的仪器，操作复杂。海星卵母细胞因其具有的下列特征，如：細胞周期调控机制与真核细胞的细胞周期调控机制相似；且细胞周期自发地同步于G2/M期；未成熟卵细胞与成熟卵细胞在显微镜下很容易鉴别，作为一种简易方便的细胞周期抑制剂筛选方法已经得到了有效地应用[2，3]。申请者采用该活性筛选方法，从西太平洋帕劳(Palau)群岛海域采集的海绵(Phyllospongia dendyi)中成功地分离得到多个具有海星卵母细胞细胞周期抑制活性的多卤取代二苯醚类化合物。
微管蛋白是由管蛋白和微管相关蛋白构成的蛋白质多聚体。微管也是癌症化疗的靶点之一。在细胞体外，微管蛋白在一定的物理条件(如温度)和化学条件(如pH)下能够发生微管蛋白的聚合和解聚。抗癌药物，如秋水仙碱、紫杉醇等，可以干预这一过程[4-6]。申请者得到的上述多种多卤取代二苯醚类化合物对微管蛋白的聚集过程也显示明显的抑制活性。
参考文献：
[1]Rocha A.B.，Lopes R.M.，Schwantsmann G，Natural products in anticancer therapy，Current Opinion inPharmacology，2002，1，364-369
[2]Morinaga，C.，Izumi，K.，Sawada，H.，Sawada，M.T.，Activation of maturation promoting factor and 26Sproteasome a ssembly a ccelerated by a high concentration of 1-methyladenine in starfish oocytes.，Biosci.Biotechnol.Biochem，2000，64，268-274.
[3]Toraya，T.；Maoka，T.；Tsuji，H.；Kobayashi，M.Purification and structural determination of an inhibitor ofstarfish oocyte maturation from a Bacilus speciese.，Applied and Environ.Micro.，1995，61，1799-1804
[4]Ngales，E.；Wolf，S.G，Downing H.K.，Structure of the αβ tubulin dimer by electroncrystallography.Nature 1998，391.199～203.
[5]Jordan，M.A.，Wilson，L.，Microtubules and actin filaments：dynamic targets for cancerchemotherapy.Curr.Opin.Cell Biol.1998，10，123～130.
[6]Andersen，S.S.L.，Balanced regulation of microtubule dynamics during the cell cycle：acontemporary view.BioEssays，1999，21，53～60.
发明内容：本发明涉及多卤取代二苯醚类衍生物的制备及该类化合物作为海星繁殖抑制剂及微管蛋白聚集抑制剂的应用，以及与之相关的细胞周期抑制剂及肿瘤抑制积德应用。
具体实施方式 实施例1：制备方法：
本发明所用原料海绵(Strongyphora strongylata)采自西太平洋Palau群岛，冻存于-20°的冰箱中。用时在室温下解冻，切碎，用3倍重量的无水乙醇提取3次，合并提取液，减压干燥，残留物分散于等体积的水中，等倍量乙酸乙酯萃取两次，合并提取液，真空减压干燥。乙酸乙酯提取物通过硅胶柱层析，以氯仿，氯仿-甲醇梯度洗脱。氯仿-甲醇(100∶1)洗脱部分经反相高效液相分离(87％甲醇-水)得到3个多溴取代二苯醚化合物。
化合物结构及数据：
化合物1：2-(3′，4′，6′-tribromo-2′-hydroxyphenoxy)-4，6-dibromophenol白色粉末，mp.182-184°，分子式C12H5O3Br5，UV 220(ε19361)，293(ε3080)，ESI-MS m/z：590∶592∶594∶596∶598∶600(1∶4∶8∶8∶4∶1)。1H NMR(CDCl3，300Hz)：6.60(1H，d，2.0Hz)，7.40(1H，d，2.0Hz)，7.75(1H，s)。13C-NMR(CDCl3，300Hz)：δ111.1，112.2，115.4，117.1，117.3，123.5，128.1，130.1，140.8，145.4，147.1，151.7。
化合物2：2-(4′，5′，6′-tribromo-2′-hydroxyphenoxy)-3，5-dibromo phenol白色粉末，mp.130-132°，分子式C12H5O3Br5，UV 231(ε19574)，296(ε1836)，ESI-MS m/z：590∶592∶594∶596∶598∶600(1∶4∶8∶8∶4∶1)。1H NMR(CDCl3，300Hz)：7.00(1H，d，2.0Hz)，7.46(1H，d，2.0Hz)，7.22(1H，s)。
化合物3：2-(3′，4′，5′，6′-tetrabromo-2′-hydroxyphenoxy)-4，6-dibromphenol白色粉末，mp.188-190°，分子式C12H4O3Br6，UV 232(ε24588)，292(ε5528)，ESI-MS m/z：668∶670∶672∶674∶676∶678∶680(1∶2∶4∶8∶4∶2∶1)。1H NMR(CDCl3，300Hz)：6.45(1H，d，2.1Hz)，7.34(1H，d，2.1Hz)。13C NMR谱(CDCl3，300Hz)：δ111.2，112.3，116.3，117.0，118.9，121.4，126.8，130.3，141.4，145.5，146.8，150.5。
实施例2 海星卵母细胞周期抑制活性的测试方法：
海星卵母细胞在成熟期之前自发同步于第一次减数分裂的前期，即G2/M期，在这个阶段，可以观察到完整的细胞核。在成熟诱导激素(1-methyladenines)的作用下卵细胞成熟进入M期，细胞核破裂，进行减数分裂。
雌性海星(Asterina pectinifera)个体采自日本沿岸，每年的4-5月份和8-10月份采集，养殖于人工海水(ASW，10mM EPPS-NaOH(pH8.2)含有0.46M NaCl，10mM KCl，35.9mMMgCl2，1.75mM MgSO4，and 9.18mM CaCl2)中。取雌性海星Asterina pectinifera一个，沿各个触手中心剪开，取出红色的卵巢，放入不含钙离子的人工海水中洗涤2-3次，悬浮于30mL的脱钙人工海水中。将卵巢剪碎，除去浮着的卵泡细胞，三层纱布过滤。然后低速离心，将得到的沉淀悬浮于200mL人工海水中，显微计数，将细胞数调至100个/mL，即得所需的海星未成熟卵细胞。
实验样品溶于DMSO，浓度为2mg/ml，作为供试液。取1ml的海星未成熟卵细胞加入24孔板中，同时加入不同浓度的供试液10ul，冰浴上培养10分钟后，加入1.25uM1-methyladenines 100ul，作用50分钟后，在倒置显微镜下观察细胞核的形态，如果与阴性空白对照相比，细胞核保持完整即示对海星卵细胞成熟过程有抑制活性。海星卵细胞成熟抑制率按如下公式计算。
活性测试结果见表1
表1.化合物1-3对海星卵母细胞成熟期的抑制活性 Compounds IC50(μM) 1 2 3 4.2 4.2 3.6
实施例3 微管蛋白聚集抑制活性测试方法：
微管蛋白的制备参照文献(李占荣，微管蛋白的分离鉴定及其在抗癌药物筛选中的应用，药学学报，1986，21：651)。取新鲜猪脑匀浆后，经聚合-解聚-再聚合-再解聚两个循环制得。按照Coomassie Protein Assay Reagnet方法测定蛋白含量(1.6299，1.6mg/ml)。精密吸取5、4、3、2ul待测样品(5mg/ml)与微管蛋白溶液在冰浴上混合后，放入37度恒温的水浴中，用日立U-3000分光光度计在不同时间测定溶液在400nm处的吸光度值，并绘制时间-吸光度曲线。待吸光度恒定后，按如下公式计算抑制率，并绘制出量效曲线，求出IC50。
I37：样品组在37℃ 400nm处的吸光度值
C37：空白对照组在37℃ 400nm处的吸光度值
活性测试结果见表2
表2.化合物1-3对微管蛋白聚集的抑制活性 Compounds IC50(μM) 1 2 3 33.5 20.9 29.6