一种内毒素吸附材料及其制备和使用方法 技术领域：
本发明涉及生物医学材料领域，尤其涉及可以吸附去除液体流动相中内毒素分子的亲和吸附材料及其制备和使用方法。
背景技术：
内毒素是一种来自革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，内毒素进入哺乳动物血液，可以导致其发烧，血液中内毒素的量达到一定的限度，可以直接导致死亡。大肠杆菌(一种典型的革兰氏阴性菌)经常出现在这些动物的肠道内，但是经过肝脏的吸附一般毒性就会消失，正常人体血液中不会发现大肠杆菌和内毒素。但是，患者肝脏功能下降，接受抗癌药物治疗，或者受到严重的外伤(烧伤或接受手术治疗)时，就容易患上严重的细菌感染性疾病，接着出现内毒素血症。除此以外，肝脓肿和胆囊炎也会引起内毒素血症。留置的导尿管，人工透析和输液设施也会由于受内毒素污染，导致使用者染上内毒素血症。目前，内毒素血症是各医院手术室死亡率最高的并发症之一。
革兰氏阴性菌体内的内毒素非常稳定，一般的加热或者是高温高压灭菌不能解除其毒性。James P.等发现离子交换树脂可以吸附内毒素【James P.Nolanet al，Proceeding of the Society forExperimental Biology and Medicine 149，766-770(1975)】，但是由于吸附去除的量达不到治疗要求，目前离子交换吸附不能用于内毒素血症的治疗。多粘菌素是应用最广泛的内毒素解毒抗生素。但是，由于多粘菌素对人体神经系统和肾脏有剧烈的毒害作用，因此目前只能口服和局部注射，目前还不能进行静脉注射，因此不能用于治疗内毒素血症。
本利发明的这种内毒素吸材料生产和工作的原理是将多粘菌素固载到稳定，并且有很好血液相容性的基质材料上，制作成吸附柱，以除去流动相中的内毒素。可以去除蛋白质溶液，动物和人体的血液，血浆及血清中地内毒素。
发明内容：
本发明提供一种内毒素吸附材料，以及这种内毒素吸附材料的制备和使用方法。
这种内毒素吸附材料是由多粘菌素固定在琼脂糖凝胶载体或PVA载体上组成。多粘菌素在载体上的固载量大于50毫克/毫升。
实验证明多粘菌素在载体上最佳的固载量为：在琼脂糖凝胶载体上为100-400毫克/毫升；在PVA载体上为100-200毫克/毫升。琼脂糖凝胶载体材料为SepharoseCL-4B或SepharoseCL-6B；PVA载体材料的规格为：直径45-145微米，内孔径为0.05-0.2微米。
本发明提供的这种内毒素吸附材料的制备方法是：先用溴化氰或环氧氯丙烷或磺酰氯将琼脂糖凝胶载体或PVA载体的羟基活化，然后加入多粘菌素溶液固载。
本发明提供的这种内毒素吸附材料的使用方法是：将这种内毒素吸附材料填装成直径3.5-4.5厘米，高度4-10厘米的吸附柱，对含内毒素的液体进行灌流处理。
本发明提到的含内毒素的液体包括蛋白质溶液、动物和人体的血液、血浆和血清。
本发明描述的多粘菌素是一类从多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)中获得的抗生素类物质，多粘菌素对多数革兰氏阴性菌株都有抗菌作用。目前使用的多粘菌素有多粘菌素A，多粘菌素B1，多粘菌素B2，多粘菌素D1，多粘菌素E1，多粘菌素E2，这类多粘菌素都可用于本发明的内毒素吸附材料的制备。
本发明中的琼脂糖凝胶和PVA载体，必须能够在使用中保证物理和化学性能稳定。琼脂糖凝胶直径65～145微米，最好80～100微米，可以直接选用SepharoseCL-4B或SepharoseCL-6B(Amersham Pharmacia)。选用的PVA珠直径45～145微米，内孔径0.05～0.2微米。考虑到内毒素分子的分子量和大小特征，选用的基质材料必须保证表面的多粘菌素能够直接与内毒素接触，但不可以用表面积过大的基质材料，否则会导致液体过柱时前后压力下降过大，而表面积过小又会降低基质的羟基含量，直接导致最后的多粘菌素固载量不足。
本发明描述的基质首先要进行活化处理，目前比较成熟的羟基活化技术包括溴化氰活化、环氧氯丙烷活化和对甲苯磺酰氯活化。Sepharose和PVA分别用1M脱氧胆酸和无菌无热原注射用水进行洗脱，确保在用溴化氰，环氧氯丙烷和磺酰试剂处理前绝对没有污染。
溴化氰活化的过程中，基质用含溴化氰(100mg/mL)的磷酸盐缓冲液(2M，pH9.5～12.0)溶液浸泡，振荡反应2～4小时。活化好的基质分子用无菌无热原水充分冲洗，然后用含0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠，pH8.5～10溶液45℃处理12小时。将以上处理好的基质分子加入多粘菌素溶液(含多粘菌素200mg～500mg/mL，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中，20℃反应过夜。多余的多粘菌素用无菌无热原水冲洗。然后用1M甘氨酸对未固定的活化羟基进行封闭。反应过程如图1。
环氧氯丙烷活化的过程中，基质用环氧氯丙烷(0.1M氢氧化钠溶液)浸泡，40～55℃振荡反应4～6小时，无菌无热原注射用水冲洗至pH7.0。活化好的产物中加入氨水，40～55℃振荡反应4～6小时，然后在上述产物中加入25％戊二醛，40～55℃反应2小时。将以上处理好的基质分子加入多粘菌素溶液(含多粘菌素200mg～500mg/mL，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中，20℃反应过夜。多余的多粘菌素用无菌无热原水冲洗。然后用1M甘氨酸对未固定的活化羟基进行封闭。加入硼氢化钠对不饱和链进行还原。反应过程如图2。
磺酰氯活化的方法可以选择的磺酰氯试剂有对硝基苯磺酰氯，对甲苯磺酰氯，氯化苯磺酰氯，2，4，6-三异丙基苯磺酰氯等。典型活化试剂配方是：12.5g对硝基苯磺酰氯，溶解于100mL啶中。基质分子经过脱氧胆酸和无菌无热原水数次冲洗后，真空抽干，加入磺酰氯试剂，缓慢振荡，室温反应过夜，产物中将啶过滤除去，反复用无菌无热原水冲洗产物，真空抽干。将以上处理好的基质分子加入多粘菌素溶液(含多粘菌素200mg～500mg/mL，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中，20℃反应过夜。多余的多粘菌素用无菌无热原水冲洗。反应过程如图3。
附图说明：
图1：溴化氰活化反应过程。
图2：环氧氯丙烷活化反应过程。
图3：磺酰氯活化反应过程。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明
实施例1：琼脂糖凝胶珠-多粘菌素内毒素吸附剂的制备方法
滤干的Sepharose CL-4B 50mL，3升1M脱氧胆酸冲洗3次，3升无菌无热原水冲洗3次，pH7.0，抽干。分别用以下(1)、(2)两种方法活化、固载：
(1)用200mL环氧氯丙烷(0.1M氢氧化钠溶液)浸泡，45℃振荡反应5小时，3升无菌无热原注射用水冲洗至pH7.0，滤过抽干。加入氨水100mL，45℃振荡反应5小时，加入25％戊二醛5mL，45℃反应2小时，无菌无热原水冲洗，滤过抽干。加入200mL溶液A(350mg/mL多粘菌素，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中，20℃反应过夜。加入10mL1M甘氨酸，2g硼氢化钠，继续反应2小时。滤过抽干，3升无菌无热原水分3次将多余的多粘菌素洗脱。得材料一。
反应液A中多粘菌素的量减除最后洗脱的多粘菌素的量就等于固定在基质上的多粘菌素的总重量。材料一中多粘菌素的量为133mg/mL。
(2)加入100mL对硝基苯磺酰氯溶液(12.5g对硝基苯磺酰氯，溶解于100mL啶中)。温和振荡，室温过夜，过滤，滤去过剩的啶，3升无菌无热原水，5次冲洗，真空抽干。加入200mL溶液A(350mg/mL多粘菌素，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中20℃反应过夜。多余的多粘菌素用无菌无热原水冲洗。得材料二。
反应液A中多粘菌素的量减除最后洗脱的多粘菌素的量就等于固定在基质上的多粘菌素的总重量。材料二中多粘菌素的含量为95mg/mL。
实施例2：PVA-多粘菌素内毒素吸附剂的制备方法
滤干的PVA 50mL，3升1M脱氧胆酸冲洗3次，3升无菌无热原水冲洗3次，pH7.0，抽干。分别用以下(1)、(2)两种方法活化、固载：
(1)用200mL环氧氯丙烷(0.1M氢氧化钠溶液)浸泡，55℃振荡反应2小时，3升无菌无热原注射用水冲洗至pH7.0，滤过抽干。加入氨水100mL，55℃振荡反应2小时，加入25％戊二醛5mL，55℃反应2小时，无菌无热原水冲洗，滤过抽干。加入200mL溶液A(350mg/mL多粘菌素，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中35℃反应6小时。加入10mL1M甘氨酸，2g硼氢化钠，继续反应1小时。滤过抽干，3升无菌无热原水分3次将多余的多粘菌素洗脱。得材料三。
反应液A中多粘菌素的量减除最后洗脱的多粘菌素的量就等于固定在基质上的多粘菌素的总重量。材料三中多粘菌素的量为166mg/mL。
(2)用200mL含溴化氰100mg/mL的磷酸钾盐缓冲液(2M，pH11.0)的溶液浸泡，4℃，振荡反应3小时。滤过抽干，接着用无菌无热原水充分冲洗至pH7.0。然后用250mL含0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠，pH9.0溶液45℃处理12小时。滤过抽干，加入200mL溶液A(350mg/mL多粘菌素，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠)中20℃振荡反应过夜。然后用加入10mL1M甘氨酸对未固定的活化羟基进行封闭，静置1小时。滤过抽干，3升无菌无热原水分3次将多余的多粘菌素洗脱。得材料四。
反应液A中多粘菌素的量减除最后洗脱的多粘菌素的量就等于固定在基质上的多粘菌素的总重量。材料四中多粘菌素的量为151mg/mL。
吸附剂的解毒效果评价：(参照Kazuyoshi Hanasawa的方法)(Kazuyoshi Hanasawaet al.，A New treatment for Endotoxemia with Direct Hemoperfusion by Polymyxin Immobilized Fiber，Therapeutic Apheresis 2000，4(2)，142-145.)
取吸附材料一，材料二，材料三，材料四各2mL，分别加入20g含大肠杆菌055：B5脂多糖(三氯乙酸提取，Difco Labo，)0.5m/mL的生理盐水，37℃振荡60分钟。1mL上清夜静脉注射入ICR鼠，48小时后计算死亡率。另外，Sepharose CL-4B，PVA通过同样的方法做试验对照。表一中就是试验的结果。
上清夜中多糖浓度的计算是用苯酚-硫酸法(1mL上清夜+1mL5％苯酚+5mL98％硫酸，485nm)，内毒素含量的测定参照《中华人民共和国药典2000年版第二部》方法。
表一 材料 鼠死亡率 处理后浓度(mg/mL) 毒素含量 多糖含量 材料一 1/20 0.10 0.02 材料二 4/20 0.11 0.06 材料三 2/20 0.06 0.06 材料四 0/20 0.053 0.053 Sepharose CL-4B 17/20 0.41 0.25 PVA 19/20 0.45 0.29
结果显示：
(1)Sepharose CL-4B和PVA能够吸附脂多糖，但是不能有效降低死亡率；
(2)材料一，三和四能够很好的中和和吸附内毒素。
实施例3：内毒素吸附材料的使用方法：
(1)哺乳动物全血灌流：
材料四填装成柱(内径4cm，高度4cm)进行血液灌流。
杂种成年狗(体重7-9kg)通过一个管泵系统将狗的股动脉和股静脉与灌流器连接，血流速度控制在50mL/min，狗处于麻醉状态。灌开始后15分钟，含大肠杆菌0111：B40.01％(0.5mg/kg体重)脂多糖溶液的生理盐水对前脚滴定注射60分钟，灌流试验中肝素的量控制在100单位/kg体重/小时，灌流持续2小时。10头狗中1头24小时后死亡(死亡率10％)，对照实验中Sepharose CL-4B和PVAC处理的狗中各有7头和9头死亡(死亡率70％和90％)。另外5头只注射肝素和脂多糖的狗全部死亡(死亡率100％)。死亡的症状很象内毒素休克，而且随着脂多糖注射开始，血压持续下降。
(2)体外血清内毒素吸附以及安全性检测：
材料四填装成柱(内径4cm，高度4cm)，生理盐水充分预冲，在300mL健康人体血清中加入大肠杆菌0111：B4脂多糖0.05％(w/v)，以流量30mL/min通过吸附柱，循环30min。
检测结果显示，材料四可以吸附去除95％的脂多糖成分，每毫升吸附剂可以吸附总蛋白、白蛋白和球蛋白的量分别为0.090g，0.044g，0.046g，没有发现补体升高的情况，没有检测到多粘菌素的脱落。