豆薯抗肿瘤蛋白.pdf

豆薯抗肿瘤蛋白，本发明涉及一种具有抑制肿瘤的活性的新型蛋白的制备和应用。从豆薯种子中经过特定的方法纯化分离出一种新的豆薯抗肿瘤蛋白。本发明提供的豆薯抗肿瘤蛋白具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。

1、  豆薯抗肿瘤蛋白，其特征在于：该蛋白是一种等电点小于pH6的酸性蛋白质，分子量为15.5kDa；该蛋白由以下7个步骤分离得到的：
(1)豆薯种子经粉碎后，加生理盐水抽提、匀浆两次，置4℃过夜；
(2)用盐酸或醋酸调pH5，静置多于2小时，低温超速离心得上清液；
(3)进一步加固体硫酸铵分级沉淀，低温超速离心得30％-95％饱和度的硫酸铵沉淀；
(4)上述硫酸铵沉淀对蒸馏水或对5mMol/L磷酸盐缓冲液或对5mMol/L醋酸盐缓冲液透析超过24小时，低温超速离心得黄色上清液；
(5)上述上清液上样于CM-52纤维素柱，该纤维素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸盐或醋酸盐缓冲液平衡，收集流出液；
(6)上述流出液上样于DEAE-52纤维素柱，该纤维素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl缓冲液平衡，上样完后，用同一缓冲液洗柱，使280nM检测达基线后，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一缓冲液作梯度洗脱，收集第1峰，合并该峰组分；
(7)上述组分对蒸馏水充分透析后，冷冻干燥得冻干粉，就是豆薯抗肿瘤蛋白。

2、  权利要求1的蛋白的用途，其特征在于：该蛋白作为制备抗肿瘤药物的应用。

豆薯抗肿瘤蛋白
技术领域
豆薯抗肿瘤蛋白，本发明涉及有机化学领域，特别是涉及到生物化学中一种具有抑制肿瘤的活性的豆薯抗肿瘤蛋白，及其制备和应用。
背景技术
豆薯抗肿瘤蛋白，在本文中，抗肿瘤蛋白是寡聚地或是单肽链的蛋白质，并至少具有下列活性：抑制人肿瘤细胞株活性或抑制鼠肿瘤细胞株活性；活性包括一定范围的拮抗效果，例如部分抑制或致死。
豆薯(Pachyrrhizus erosis)，又名白地瓜、沙葛、沙棘。在植物分类学上属于豆科蝶形花亚科豆薯属，其块根可当菜，也可当水果剥皮食用。豆薯种子有毒，民间用来毒鱼和杀虫。郝冰等人(生物化学杂志1996，12：578-582，中国生物化学与分子生物学报1999，15：1006-1008)曾从中提取了Pachyrin I(33kDa，pI4.5)，PachyrinII(28kDa，pI6.5)和PaAFP(14kDa，pI7.5)三种蛋白，蔡建华等人(结构化学2001，20：149-150)从中提取了豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，碱性蛋白)，中国发明专利CN 1315328A公开了从豆薯种子中分离纯化的一种抗植物花叶病毒蛋白PE4，分子量约为9kDa，等电点略偏碱性。而本发明的目的，是从豆薯种子中经过特定的方法纯化分离出一种新的豆薯抗肿瘤蛋白。
发明内容
豆薯抗肿瘤蛋白，本发明则是从豆薯种子中，采用下述七个步骤分离纯化出一种豆薯抗肿瘤蛋白(PeAP)。PeAP显示出广谱的抗肿瘤活性。具体步骤如下；
1.豆薯种子经粉碎后，加生理盐水抽提、匀浆两次，置4℃过夜；
2.用盐酸或醋酸调pH5，静置多于2小时，低温超速离心得上清液；
3.进一步加固体硫酸铵分级沉淀，低温超速离心得30％-95％饱和度的
硫酸铵沉淀；
4.上述硫酸铵沉淀对蒸馏水或对5mMol/L磷酸盐缓冲液或对5mMol/L醋酸盐缓冲液透析超过24小时，低温超速离心得黄色上清液；
5.上述上清液上样于CM-52纤维素柱，该纤维素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸盐或醋酸盐缓冲液平衡，收集流出液；
6.上述流出液上样于DEAE-52纤维素柱，该纤维素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl缓冲液平衡，上样完后，用同一缓冲液洗柱，使280nM检测达基线后，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一缓冲液作梯度洗脱，收集第1峰，合并该峰组分；
7.上述组分对蒸馏水充分透析后，冷冻干燥得冻干粉，就是豆薯抗肿瘤蛋白。
豆薯抗肿瘤蛋白，SDS-PAGE检测结果表明其分子量为15.5kDa，等电点小于pH6(pI＜6)，具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。
本发明是首次从豆薯属植物种子中提取出的具抗肿瘤活性的蛋白质。本发明的豆薯抗肿瘤蛋白分子量为15.5kDa，等电点小于pH6的酸性蛋白(pI＜6)与此前从豆薯中提取的Pachyrin I(33kDa，pI4.5)Pachyrin II(28kDa，pI6.5，SDS-PAGE检测14.5kDa)，PaAFP(14kDa，pI7.5)，豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，碱性蛋白，即pI＞7)，和豆薯抗植物花叶病毒蛋白PE4(分子量约为9kDa，等电点略偏碱性)等5种蛋白，在分子量和等电点(pI)性质方面均不相同，是一种新的蛋白。
附图说明
图1.显示豆薯抗肿瘤蛋白在DEAE-52纤维素柱上的梯度洗脱图：图中的洗脱峰1即为豆薯抗肿瘤蛋白。
图2.显示豆薯抗肿瘤蛋白的SDS-PAGE图，横座标为迁移率，纵座标为蛋白分子量的对数，■为分子量标准对照，▲为豆薯抗肿瘤蛋白。
具体实施方式
实施例1.从豆薯种子中提取豆薯抗肿瘤蛋白(PeAP)：
取200g豆薯种子，经粉碎机粉碎后，加生理盐水匀浆二次，置4℃抽提(大于24小时)其间多次搅拌，然后低温超速离心得粗抽提液，加固体硫酸铵分级沉淀，低温超速离心得30％-95％饱和度的硫酸铵沉淀；沉淀溶于少量磷酸盐缓冲液(5mMol/L，pH6.5)，对同一缓冲液透析超过24小时，其间至少三次更换透析外液，透析后的样品低温超速离心后得淡黄色上清液，加样上CM-52纤维素柱(Watman公司产品，预先用5mMol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡好)，收集流出液，将流出液加样上DEAE-52纤维素柱(Watman公司产品，预先用10mMol/L Tris-HCl，pH7.4平衡好)然后用10mMol/L Tris-HCI，pH7.4，0-0.5Mol/L NaCl梯度洗脱，收集洗脱峰1，即是豆薯抗肿瘤蛋白；见图1。
实施例2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
豆薯抗肿瘤蛋白(即洗脱峰1)，在Bio-Rad公司的微量垂直平板电泳仪上进行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法进行，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为4％，电泳后按郭尧君方法(1991，生物化学与生物物理进展，18：32-37)，用考马斯亮兰染色，以牛血清白蛋白(MW~68kDa)，卵清白蛋白(MW~43kDa)，天花粉蛋白(MW~27kDa)，胰蛋白酶(MW~22.4kDa)和溶菌酶(MW~14kDa)为分子量标准对照，SDS-PAGE结果见附图2。
实施例3.
本发明的豆薯抗肿瘤蛋白(PeAP)，用MTT法测试(Mosmann，T.J.Immunal.Meth.1983，65：55)表明，PeAP具有强烈的抑制人胃癌MGC、人肝癌Bel和鼠黑色素瘤B16细胞株的活性，其半数抑制浓度IC₅₀分别为：3.38×10^-7，2.98×10^-7，2.84×10^-7Mol/L，与天花粉蛋白和八棱丝瓜蛋白l相当，见表1。
表1：三种蛋白对胃癌、肝癌、鼠黑色素瘤细胞株的半数抑制浓度(×10^-7Mol/L)
               胃癌MGC 803  肝癌Bel 7404  鼠黑色素
瘤B16
豆薯抗肿瘤蛋白            3.38               2.98
2.84
天花粉蛋白                2.25               2.61
2.38
八棱丝瓜蛋白1             2.11               4.21
1.78