诱导对表皮生长因子受体的免疫 应答的抗独特型抗体 本发明涉及抗独特型抗体，它对带有表皮生长因子受体(EGFR)作为抗原的肿瘤能诱导免疫应答。首先，本发明涉及的抗独特型抗体具有这种抗原的内部影象并能模拟人EGFR的外部结构域。作为本发明的优选方案，提到的抗体都来自于鼠mAb425或来自它的人源化及嵌合形式。本发明的抗体可用于肿瘤免疫治疗和免疫预防。
本发明说明书中涉及的几个缩略语和其限定的技术含意如下：
“FR”(framework regions骨架区)：指的是轻或重链可变区的4个亚区，这里支撑着3个CDR。
“CDR”(complementarity determining regions，互补决定区)：指的是轻或重链可变区的3个亚区、这里有高变序列并形成在使其与抗原直接接触中起主要作用的环状结构。
“EGF”和“EGFR”：指的是表皮生长因子和它的受体。
“PCR”：指的是聚合酶链反应。
“scFv”：指的是单链Fv，它是一种抗体片段。
“VL”：指的是轻链可变区。
“VK”：指的是Kappa轻链可变区。
“VH”：指的是重链可变区。
“嵌合”或部分人源化抗体指地是含有来自人源的恒定区和非人源的(如小鼠的)可变区(包括CDR)的抗体。
人源化或完全人源化抗体指的是含有来自人源的恒定区和FR，而CDR来自非人源。
“Ab1”：指的是一抗或初始抗体，通过免疫接种可诱导一连串的连续抗体。
“Ab2”：指的是典型的抗独特型抗体(＝“抗-id”)它是针对Ab1的独特型的。
“Ab3”：指的是针对Ab2独特型的抗独特型抗体，因而它与Ab1可比。
PBS指磷酸盐缓冲液。
FCS指胎牛血清。
HBSS指Hanks平衡盐水缓冲液。
FITC指异硫氰酸荧光素。
MTC指混合细胞培养。
KLH指Keyhole Limpet Hemocyanine，即匙孔血蓝蛋白。
CFA指福氏完全佐剂。
HRPO指人重组过氧化物酶。
抗独特型抗体(抗独特型或抗-id)是针对位于抗原结合区上或另一抗体分子可变区上的表位(称独特型)的抗体。独特型(Ab1)和抗独特型(Ab2)之间的相互作用在保持体内免疫平衡上起重要作用。解决免疫调节作用要求助于独特型和抗独特型网络(学说)(Jerne，F.G.，1974，Ann.Immunol.125C：373)。“内部影像”指抗独特型抗体模拟可被Ab1识别的抗原的三维结构。免疫接种Ab2可诱导产生针对起始抗原的Ab3。已在几种传染疾病和癌症治疗中成功应用了独特型疫苗(如Uytdehaag.F.G和C.M.H.Osterhaus，1986，J.Immanol.134：1225；Kennedy.R.C.等，1986，Science 232：220；Hiernaux，J，R，1988；56：1407；Stein，K.E.和T.Soderstrom，1984，J.Exp.Med，160：1001)。在肿瘤免疫方面，已在体内、体外试验中用过独特型免疫接种来调节肿瘤生长(Smorodinsky，N.I.等，1988；Eur，J.Immunol.18：1713，Viale，G；等，1987，J.Immunol.139：4250)。Herlyn等报道了在晚期结肠直肠癌病人上所作的临床试验的可喜结果。在仅用抗独特型抗体治疗的病人中观察到肿瘤不再转移并伴有部分临床症状减轻。有关抗独特型抗体及其在肿瘤治疗中的应用还可从诸如US4,918,164和EP0141783中了解到。
表皮生长因子(EGF)是一种多肽激素，它对表皮和上皮细胞是一种有效分裂素。当EGF与敏感细胞相互作用时，它就结合到膜受体(EGFR)上。EGFR是一种分子量约为170K的跨膜糖蛋白，是c-erb-B原癌基因的一种基因产物。
MAb425是针对已知的人A431癌细胞系(ATCCCRL1555)的鼠单克隆抗体，能结合到人EGFR的外部结构域的多肽表位上并抑制EGF的结合。人们发现MAb425(ATCC HB9629)在体外参与调解肿瘤细胞毒性并抑制表皮样瘤细胞生长和结肠直肠癌衍化细胞系的生长。(Rodeck等；Cancer Res.1987.47：3692)。人源化和嵌合形式的MAb425公布在WO92/15683中。
EGF同受体结合激活几个导致DNA复制和细胞分裂的生化过程(Carpenter，G.1987，Annu，Rev.BioChem.56：881)。最近发现在细胞致癌转化当中涉及到EGFR系统(DiFiore P.P.等，1987，Cell，51：1063.10)。
对几种表达EGFR和分泌EGF或TGFα的肿瘤，有人提出自泌性刺激细胞繁殖(Ennis，B.W等，1989，Mol.Endo，3：1830)，在多种组织器管肿瘤的细胞表面上检测到EGFR有较高水平表达，如乳房、膀胱、癌、黑色素瘤、非神经性脑瘤(Neal.D.E.等1985，Lancet，1：366.Libermann，T.A.等；1984，CancerRes.44：753，Herlyn，M.等，1982，J.Clin.Immunol.2：135)。EGFR是一个治疗的靶标，因为在几种肿瘤细胞的繁殖中都直接涉及到它。人们已证明。它过分表达则预后不好，与损害扩大的可能相关联(Sainsbury，J.R，等，1985，Lancet 1：364)。
在癌症病人中针对EGFR的主动或被动免疫接种，可得到起EGF和TGFα拮抗物作用的特异性循环抗体，封闭EGF和TGFα接近其受体并抑制肿瘤生长。EGFR是独特型疫苗的一个好候选物，因为它可从肿瘤细胞中纯化出来，但用于治疗难以得到足够数量。
有几个小组(如Tsjisaki，M.等，1983，J.Immunol.150：508，Raychaudhuri，S.等，1990，J.Immunol.145：760；Bruck，C.等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6578)研究并讨论了抗独特型抗体(总体)，并比较了它们的结构与抗原的结构及内部影像。
本发明首先提供对表皮生长因子受体能诱导免疫应答的新抗独特型抗体(抗-id)。特别是本发明至少提供两种模拟人表皮生长因子受体表面上抗原位点的这样的抗独特型抗体(叫做5A6和3B6)。本发明的抗体，特别是那些能模拟EGFR的抗体可用来诱导和增强对所有表面表达EGFR的人类肿瘤的免疫应答，包括黑色素瘤，神经胶质瘤，癌。还可用所述抗体对所述肿瘤在体内或体外进行定位和估测诊断。
本发明的一个目的是提供一种对EGFR能诱导免疫应答的新的单克隆抗独特型抗体(Ab2)。
详细说，本发明涉及一种模拟可被相应的鼠的、人源化的或嵌合的单克隆独特型抗体(Ab1)所识别的EGFR抗原内部影像的单克隆抗独特型抗体。这种Ab1抗体可能是非人类的，特别是象上述限定的那样是由鼠的、人源化或嵌合型的单克隆抗体。因为可想象到本身就有几种针对EGFR表位的Ab1抗体，本发明也涉及能识别这组Ab1抗EGFR抗体的抗独特型抗体。
而且，本发明涉及能从相应的Ab1抗EGFR抗体通过如免疫接种而获得的单克隆抗独特型抗EGFR抗体。
因此，提供一种能通过用相应的鼠的、人源化的或嵌合的独特型(Ab1)抗体免疫接种动物而得到的单克隆抗独特型抗体是本发明的一个目的。
本发明的抗独特型抗体优选是通过用单克隆抗EGFR抗体425或它的人源化和嵌合形式免疫接种而得到的。MAb425是由以ATCC HB9629保藏的已知的细胞系制备出来的。
提供一种其特征在于独特型(Ab1)抗体是mAb425(ATCCHB9629)或它的衍生物的单克隆是本发明的一个目的，衍生物是通过例如WO92/15683中介绍的已知方法人源化或嵌合化得到的。
本发明还涉及在这些抗体的高变区(CDR)和可变区(FR)上有明确氨基酸序列的特异性抗独特型抗体，该序列均表示在图5A-F中。
因此，提供一种抗独特型单克隆抗体，其中所述抗体的CDR区和FR区含有图5A-F中的氨基酸序列，是本发明另一个目的。而且作为优选实施方案提供一种含有图5A-F中氨基酸或核苷酸序列的抗独特型抗体也是本发明的一个目的。
根据本发明所公布的序列还包括由于自发的或因理化因素诱导引起的突变、缺失、插入和单个氨基酸或核苷酸残基的取代而不同于图5中明确表述的特异序列的变异及变化的序列，只要最终抗体的生物学活性和特性方面没有根本的改变。
抗独特型抗体一词还包括这种抗体的部分或片段，如本领域内技术人员所熟悉的单链Fv分子或F(ab)’2及Fab’分子(Skerra和Pluckthun.Science，1988，240：1038；Better等，Science1988，240：1041)。还介绍过单链Fv(其中VL和VH链是连在一起的)(如Bird等.，Science 1988.242：423；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988.85：5879)。
另外，本发明涉及制备象本说明书中限定的抗独特型抗体的方法，其特征在于用相应的通过其CDR区直接与抗原结合的独特型抗体(Ab1)免疫动物，用常规方法分离和纯化合成的与Ab1抗体的独特型结合的抗独特型抗体(Ab2)。
而且，提供一种含有说明书中限定的抗独特型单克隆抗体和选择性地含药学上可接受的载体的药物组合物是本发明的一个目的。
最后，本发明涉及所述抗独特型抗体在生产针对抗肿瘤的药物中的用途。
本发明介绍三种能识别与mAb425抗原结合位点(互补位)重叠的独特型的单克隆抗独特型抗体(5A6、3B6和15H8)的获得。血清学和免疫学研究表明：5A6和3B6都带有可被mAb425识别、在同系鼠(Balb/c小鼠)和同种异体(B6D2F1小鼠)鼠系统中引起体液反应的表位的内部影像。真实的内部影像抗独特型抗体在不同种动物当中应起抗原代用品的作用，但是这些抗独特型抗体在兔子和大鼠中却不能产生象Ab1样的反应。它们的V区克隆和测序结果表明：它们的轻、重链CDR都与一些位于配体结合结构域中的EGFR残基有氨基酸同源性，这提示一种抗原模拟物。同源区这种抗原性的研究对在异种系统中缺乏生物学效应提出一种可能的解释，并支持在对人类治疗中的潜在有效性。
图1：5A6、3B6、15H8或无关mAB对425与sEGFR结合的抑制。抑制百分比是按材料与方法中介绍的用ELISA测定的OD值计算的。
图2：5A6(●)，3B6(○)，15H8()和鼠IgG1(Sigma)()对鼠的(A)和人源化的(B)425与表达EGFR的A431细胞结合的抑制曲线。结果以双份样本的OD平均值表示。横座标为竞争物含量(μg/ml)，纵座标为OD值。
图3：Ab3-Ab2结合的竞争性酶联法(ELISA)检测结果。检测一系列稀释的大鼠Ab3血清同Ab2或无关mAb15包被的、先与5A6(●)，3B6(■)和15H8(▲)保温的固相结合情况。用mAb15()和正常小鼠血清(◆)作对照。A：大鼠Ab3血清抗5A6；B2大鼠Ab3血清抗3B6；C：大鼠Ab3血清抗15H8；D：大鼠对照血清抗mAb15；纵轴为OD值、横轴为血清稀释度×10-3。
图4：固相酶联法(ELISA)：抗独特型抗体对用5A6和3B6免疫小鼠(Balb/c和B6D2F1)得到的Ab3与纯化的EGFR结合的抑制。
图5：小鼠单克隆抗体15H8、5A6和3B6轻链、重链可变区的全部序列(包括前导序列)。核苷酸序列和氨基酸序列都显示出来了。前导序列以黑体表示、CDR序列以斜体字表示，用于扩增可变区的引物序列下面划线表示。15H8、5A6和3B6的重链都有IIID组特征性结构。15H8和5A6的轻链具有KappaV组特征性结构、3B6具有KappaIII组结构，均是根据Kabat分类。
A：15H8重链，B：15H8轻链
C：3B6重链，D：3B6轻链
E：5A6重链、F：5A6轻链
图6：Ab2和EGFR外部结构域中CDR2H、CDR3H和CDR2L序列的比较。实线区内表示的是相同的氨基酸、虚线区内代表类似氨基酸、影线部分表示可能有抗原性的区域。
表I：5A6，3B6和15H8对425的亲和常数。解离常数是按材料与方法中介绍的酶联法(ELISA)检测的OD值描绘的Ab2与425结合图来计算的。
表II：Ab3对Ab1和Ab2结合的抑制作用及对Ab2上起交叉反应独特型(位点)的检测。试验了用抗独特型抗体或无关mAb免疫的小鼠(A)、兔子(B)和大鼠(C)的2倍稀释的Ab3血清，对其免疫Ab2、其他抗独特型抗体和小鼠同种型及同种异型匹配的mAb结合的抑制作用。给出显示100％抑制作用的血清效价。
表III：用间接免疫荧光法检测未固定的EGFR阳性(A431)或阴性(C33A)细胞的Balb/c小鼠抗-EGFR的反应，用酶联法检测全细胞的或纯化的外部结构域的反应。
a)用FITC标记的兔抗鼠IgM＋IgG检测。
b)用FITC标记的兔抗鼠IgG检测，
c)阳性动物/免疫过的动物。
生物学材料和一般方法：
微生物、细胞系、质粒、噬菌粒、启动子、抗性标志、复制区或在本申请中提到的其他载体片段都是市售的或由其他公众渠道得到的。如果本申请中没有提供其他信息，则这些材料和方法仅用作举例、对本发明来说不是重要的，可分别以其他适宜的材料和方法代替。
对本发明是关键的技术在说明书中作了详细介绍。没有详细介绍的其他技术都是本领域内技术人员熟知的标准方法，或在所引用的文献中及专利申请中和常规文献中有更详细的介绍(如Harlow.E.，和D.Lane.1988.Antibodies，a laboratory manual.ColdSpring Haybor laboratory，N.Y.)。
体内试验使用了Balb/c小鼠(IFFA CREDO)、来自C57BL/6J和DBA/2J小鼠(IFFA CREDO)的杂交品种B6D2F1、Wistar大鼠(Interfauna Ibérica)和新西兰大白兔(Biocentle)。
A431是表达EGFR的表皮样癌细胞(ATCC CRL1555)。C33A(ATCC HTRB31)(一种子宫颈癌细胞)是受体阴性细胞。为获得杂交瘤细胞，用HL1-Friendly骨髓瘤细胞-653(Ventrex，Bioventures组)作融合的配体。所有细胞系都培养在补有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养液里。
根据Rodeck等(1.c)方法制备抗-EGFR mAb425(Ab1)。在不同的试验中，用几种不相关特异性的小鼠mAb作对照，包括mAb15(IgG1，k)；小细胞肺癌抗gp85/45抗体；R24(IgG3，k)；抗GD3；14F9(IgG3，k)；抗GD3和Me361(IgG2a)；抗GD2；对这些抗体以前已有介绍(Kamma，H.等，1989 Cancer Res.49(8).5118；Dippold.N.G.等，1980。Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77：6114；Massó.O等。1991，Immunologia 10：36；Thurin.J.等，1987，Cancer Res.47：1229)。
F111(IgG1，k)单克隆抗体是按下面介绍的方法用PEG诱导的RNase免疫接种的Balb/c小鼠脾细胞和Friendly-骨髓瘤细胞融合所得到的。
抗-425独特型mAb的获得：
用经mAb425免疫的Balb/c小鼠脾细胞和653-Friendly骨髓瘤细胞融合来制备鼠杂交瘤细胞。用夹心酶联法检测上清液抗mAb425活性。从两批融合率分别是2.8％和10.5％的试验中得到5A6、3B6、15H8阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法克隆三次后，发现它们分泌的都是IgG1.k抗体。
5A6，3B6和15H8的鉴定：
用粗制上清液或蛋白A纯化的样品来鉴定Ab2的特性。用具有不同抗原特异性的无关mAb的系列标准测试时(F111，361和14F9)，5A6，3B6和15H8只同mAb425特异性结合，从而证实了其抗独特型的性质。
为明确抗独特型抗体所识别的425独特型表位的定位，用酶联法检测了它们对sEGFR的425-EGFR结合抑制作用。它们完全抑制了这种反应(图1)。这说明：识别的独特型表位是在抗原结合位点内。
为明确5A6，3B6和15H8是作为Ab2的抗独特型抗体，我们决定检测其识别的mAb425上的独特型表位是否与CDR或抗原结合位点重合。为了这样的分析，用A431细胞以间接酶联法绘制了鼠的(图2A)425mAb和人源化的(图2B)425mAb的抑制结合曲线比较图。所有三种抗独特型抗体都能抑制这两种形式的425mAb，每一种Ab2都有相似的抑制曲线，这表明5A6，3B6和15H8所识别的425独特型表位都直接包含在抗原识别区内。15H8对425-A431细胞结合有效抑制率比5A6和3B6高10多倍。计算抗-Id的解离常数(KD)来确定Ab2与425互补位的匹配程度，每种Ab2的解离常数均示于表I中，15H8与425有更高的亲和性，因为它对EGFR-425结合有较高的抑制率。这些结果还提示：抗-Id至少能识别mAb425上两种不同的独特型表位。 表I Ab2 KD 5A6 1.002 10-9M 3B6 1.25 10-9M 15H8 0.3 10-10M
同种(Balb/c)、同种异体(B6D2F1)和异种的(大鼠、兔子)的Ab3的诱导
通过分析它们的免疫原性来评价这些Ab2作为Id疫苗的有用性。真正的内部影像Ab2应能诱导带有Ab1样特异性的垮越种间屏障的Ab3。按上述介绍的方法免疫接种后，在小鼠、大鼠和兔子中均能产生Ab3。首次接种后2周就可检测到抗-抗-Id抗体，6-8周达到最高水平。对免疫用的Ab2的特异性应答，在大鼠和兔子中可维持长达12个月，而在小鼠中，后几个月Ab3效价有暂时性下降。兔子产生的都是抗鼠Ig；针对免疫用的Ab2产生的Ab3血清效价都比针对同种型和同种异体型产生的Ab3相匹配的Ig效价高出5-10倍，这表明针对Ab2恒定区的免疫应答不干扰针对可变区的免疫应答。
为确定针对那性使得与mAb425互补位接触(这里应有模拟抗原的独特型表位)的Ab2决定簇的有效免疫，进行了抑制结合试验，其中在有一系列稀释的用Ab2或无关鼠mAb免疫的动物Ab3血清存在下，测定了5A6、3B6和或15H8同mAb425的结合。表II中列出了能100％押制Ab2-Ab1结合的Ab3血清稀释度，(A)是来自Balb/c小鼠的、(B)是来自兔子的，(C)是来自大鼠的。正象表A、B、C中所显示的那样，三种动物中产生的抗-5A6 Ab3血清都以同样效率抑制了5A6和3B6与mAb425的结合，抗-3B6血清也显示类似的抑制效果。这提示，这两种抗-Id可能具有共同的独特型表位。而且，发现有些大鼠和小鼠抗-15H8血清能抑制5A6、3B6与425结合，提示有部分独特型一致性。在抗15H8兔血清中没有发现有这种反应性，提示兔子中Ab3免疫应答可能主要是针对其他一些免疫结构域独特型表位的，兔子的Ab3血清抑制效价高于大鼠和小鼠的抑制效价这一结果也支持这种可能性。
在竞争酶联试验中研究了5A6和3B6两者之间的抗原一致性。试验了兔子和大鼠的Ab3一系列稀释血清(10-3到10-5)在有等体积(1mg/ml)Ab2或对照mAb情况下结合Ab2的效价。图3中显示了与大鼠Ab3血清相应的结合抑制曲线。在大鼠和兔子中5A6和3B6得到一致的Ab3。即抗5A6血清与包被在酶联板上的5A6或3B6 Ab2产生一致的反应，并被这两种Ab2同等抑制。兔子Ab2血清的抑制方式与图3显示的大鼠血清抑制曲线相似。
表IIA Balb/c Ab3 对Ab2-mAB425结合的抑制 5A6 3B6 15H8 5A6 3B6 15H8 F111 KLH 免疫前血清 1/600 1/1200 1/300 1/4800 1/4800 1/6400 1/2400 1/4800 1/800 1/4800 - - - - 1/2400 - - - - - - 1/600 1/1200 1/300 1/2400 1/4800 1/6400 1/2400 1/4800 1/800 1/4800 - - - - 1/2400 - - - - - - - 1/150 - 1/755 1/150 - - - - - 1/9600 1/9600 1/9600 1/9600 1/9600 - - - - - -
表IIB 兔Ab3 对Ab2-mAB425结合的抑制 5A6 3B6 15H8 5A6 3B6 15H8 mAb15 F111 mAb425 KLH 免疫前血清 1/3200 1/12800 1/6400 1/12800 1/12800 1/6400 1/3200 1/12800 1/12800 1/1280 - - - - - - - - - - - - - - 1/3200 1/12800 1/12800 1/6400 1/12800 1/6400 1/6400 1/12800 1/12800 1/12800 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1/12800 1/12800 1/1600 1/3200 N.D- - - - - - - - - -
表IIC 大鼠Ab3 对Ab2-mAB425结合的抑制 5A6 3B6 15H8 5A6 3B6 15H8 F111 MAB15 KLH 免疫前 血清 1/2400 1/2400 1/2560 1/1280 1/160 - - - - - - - - - - - 1/4800 1/2400 1/2560 1/2560 1/320 - - - - - - - - - - - - - - - 1/2560 1/1280 - - - - - - - - - -
抗-EGFR Ab3抗体的鉴定
用直接免疫荧光技术对Ab3血清进行抗A431和C33A细胞的抗受体抗体的检测，结果见表III
表III Ab3c 免疫荧光法 A431 C33A* ELISA A431 sEGFrb 抗-5A6 充-3B6 充-15H8 抗-mAb15 抗-R24 KLH 免疫前 7/14 10/13 4/12 0/2 0/3 0/5 0/20 0/14 0/13 0/12 0/2 0/3 0/5 0/20 6/14 6/13 0/12 0/2 0/3 0/5 0/20 5/15 5/16 0/11 0/4 0/3 0/4 NT
在小鼠系统中作抗-Id免疫接种可诱导产生抗-EGFR抗体，但在大鼠和兔子的Ab3中测不到抗-EGFR抗体。
B6D2F1小鼠中产生抗-EGFR抗体证实Ab2免疫接种遗传上不局限于Blb/c小鼠。以酶联法检测抗sEGFR的特异性抗体时，其效价可达1/50-1/1600。
5A6、3B6和15H8对Ab3-EGFR结合的抑制作用
进行这些实验是为检测抗-Id是否模拟EGFR的三维结构。将Balb/c和B6D2F1小鼠的不同稀释度的抗-EGFR Ab3血清与抗-Id混合。室温下反应4小时，然后用sEGFR包被的平板来检测它们抗-受体抗体活性，并将由OD值计算出来的抑制百分比表示在图4中。5A6和3B6得出的100％抑制率表示它们具有原始抗原的三维结构。15H8对抗EGFR Ab3的抑制率只有5A6或3B6的15-35％。
据说真正的内部影像抗-Id能代替抗原的免疫原性并在不同种动物中诱导产生特异性应答。5A6和3B6不是这种情况，在大鼠和兔子中没能诱导产生抗-EGFR。但是，所作的血清学检测启示，小鼠中测到的抗受体抗体都是由5A6和3B6类似EGFR的独特型决定簇诱导出来的。
Ab2的一级结构和氨基酸序列与EGFR的比较：
对DNA进行测序以便分析其免疫原性的结构基础。5A6、3B6和15H8的VH和VL的序列都显示在图5中。根据Kabat分类方法VH区的氨基酸序列被分为IIID亚组。5A6和15H8的VL区属于KV组，3B6的VL区属于KIII组。CDR序列与人EGFR氨基酸序列(GQHUE，来自SPIRS数据库)作了比较，图6中实线区中表示的是相同的残基，虚线区中表示类似的残基。最大的同源性见于CDR2H的77-84残基之间、CDR3H的125-129残基之间、5A6的70-76残基之间和CDR2L的74-80残基之间，EGFR最高的同源区CDR3 H的437-452和492-502氨基酸都是位于A.Ullrich等人所介绍的受体蛋白假设的配体结合结构域内(30)。15H8具有相同的CDR2H序列，而CDR3H和CDR2L序列有所不同。为了分析每种同源CDR在形成EGFR内部影像中所起的作用，我们比较了5A6和3B6与Kabat所收集的已知的VH和VL区的序列。发现本发明某些VH链与5A6和3B6有高度同源性，它们都表现出类似的CDR1H和CDR2H，这提示CDR3H序列在425互补位识别上和EGFR的模拟上起重要作用。发现有63种Ig(主要是人或鼠源抗体)CDR3H区和5A6及3B6的CDR3H有部分同源性(50-87％)。同源性氨基酸显然都堆积在100H-102残基中，而沿着GYVG片段发现同源性很差，但此处与EGFR有最大同源性。没有发现小鼠或人源抗体在100D位置上有V残基，这对5A6，3B6是唯一的。5A6和3B6VL显出与鼠Kappa链有同源性，完全不同的VL链序列具有相同的特异性。CDR2L的作用看来不与氨基酸严格一致性关联。5A6和3B6有不同的序列却构成了一致的EGFR内部影像结构。然而，与EGFR所具有的氨基酸同源性显然都堆积在这一区域内。
为了评价它作为Id疫苗的免疫学效果，我们分析了CDR2H，CDR3H，CDR2L区的易接近性和抗原性。用ANTIGENIC程序来计算抗原性指数(对抗原可能性的度量)，用DSSP程序来确定其二极结构以便确定所发现同源性序列的易接近性。
二级和一级结构分析表明：这些同源性残基都是易接近的，和抗原指数阳性区域也是重合的，因此在内部影像应答中可能直接涉及到它们。VL5A6和VL3B6链显示7个非一致性的抗原区和两个分别为11024及11603埃的可接近的表面蛋白，能构成抗原独特型表位，但这两种抗体都能在小鼠、兔子和大鼠中产生一致性的Ab3反应。这些结果提示：在该系统中发现的抗-抗-Id应答是专门针对5A6和3B6VH链所限定的Id的。
由于5A6和3B6抗-Id的免疫学和结构分析显示它们都是EGFR外部结构域的内部影像，我们分析了为什么在其他种动物中不能诱导免疫应答。对带有EGFR相当于GYVGY片段的阳性抗原性GYVGYAIDY CDR3H区与小鼠、大鼠和兔子抗体的CDR3H区序列进行了比较。一大群小鼠抗体都有YAIDY序列，因此，认为预计的CDR3H上的抗原区中GYVG残基是限定小鼠一个独有的独特型表位免疫原。在兔子Ig中没有发现有独有的YAIDY序列，可能是兔子抗-抗-Id应答是针对其他由较大抗原区所确定的独特型表位，而损害了抗-内部影像应答。
总之，本发明揭示了以下信息：
在癌症的主动免疫治疗中可使用不同的方法。已在癌症患者中应用起模拟肿瘤标志物的免疫学效应的抗独特型抗体，以产生能通过Id-抗-Id反应调节的特异性抗肿瘤应答。
已得到针对mAb425的抗-Id mAb，用以发展EGFR特异性疫苗。筛选出3种能识别mAb425上与结合位点相关的独特型表位的抗体(5A6、3B6和15H8)，这里识别能力都是由它们的CDR序列所决定的，通过人源化的425mAb与EGFR结合受到抑制而证实。
免疫学和血清学试验显示，5A6和3B6在小鼠中起着诱导特异性体免疫应答的内部影像作用。来自Ab3血清的Ab1样抗体能与A431细胞上的膜结合式EGFR结合，并与sEGFR起反应。这种反应可被5A6和3B6Ab2完全抑制(独立于用于免疫接种的抗-Id)，这提示5A6和3B6带有相同的EGFR内部影像。免疫学资料提示5A6和3B6的内部影像独特型和来自15H8的425互补位相关的Id享有部分独特性，血清学试验显示抗-5A6和抗-3B6的鼠Ab3在有15H8存在下与Ab2或EGFR的结合受到部分抑制。免疫学研究表明缺乏生物学效应：诱导出了IgM抗体(与A431细胞有反应。但不能识别sEGFR)，但它们都不被15H8所抑制。这些结果提示：在免疫接种过程中激起了非特异性克隆。
对Id和抗原之间的结构关系进行了研究，以便了解在产生抗EGFR应答中都涉及哪些结构。
对5A6、3B6和15H8测序后，比较了它们与EGFR的氨基酸同源性，我们发现在CDR2H、CDR3H和CDR2L的抗原性和可接近区中有一组同源性氨基酸和相当的氨基酸。这些结果与证明在VL和VH链的CDR(或邻近区域)中有同源序列的几个报告是一致的，这些序列参与形成具有独特型的内部影像的结构(31-33)。在5A6和3B6中不同序列都构成了具有相同免疫学效应的两种抗体，这一发现促使我们去分析CDR和骨架区在诱导Ab3应答及构成EGFR内部影像中所起的作用。
在构成内部影像中都可能涉及到5A6和3B6的CDR2L、CDR2H和CDR3H，因为在这些区域里都发现与EGFR外部结构域有最大的同源性及相当的氨基酸。看来，根据下述结果可推测三维模拟物起重要作用：
a)5A6和3B6的CDR2L不同，但可诱导出一致的抗-EGFR应答。
b)在无关抗体中发现了CDR2H同源性氨基酸残基，因此在内部影像形成中并不依赖于唯一的线性结构的一致性。
c)CDR和EGFR的148-154残基，437-452残基以及492-502残基之间的亲和性主要取决于相当的氨基酸。
d)相当的氨基酸堆积在那些CDR中而不是在其他区域中。
对由Davie等(34)人汇编的几个家族的抗体的独特型分析(抗-PC、抗-葡聚糖、抗-半乳聚糖、抗-NIP抗体)显示：在一个抗原驱动的系统中，Id表达涉及CDR2H、CDR3H很小一部分氨基酸、和与特异性L链的配对。我们的免疫学试验和测序结果表明：我们制备出了限于由425-互补位和Ab2互补位所限定的一组有限独特型区域的一种Ab1-Ab2-Ab3Id级联(cascade)。最重要的特性是获得两种来自相同VH链(与不同VL链配对)的显出相同免疫学特性(即独特型决定簇)的Ab2，5A6和3B6。
抗-Id抗体的生物学效应与它们在受体种群中与独特型成分的亲和性相关。对在形成5A6和3B6内部影像结构中涉及到的氨基酸残基的分析显示：它们包含在同其他小鼠抗体(来自NBRF蛋白数据库)有同源性的一个较大的抗原区内(H链100F-101残基)，但在兔子中不是这样。内部影像结构决定一个可被小鼠免疫系统“看到”的独特型，但在兔子中接种时，都隐蔽在较大的独特型区里。这种假设还得到免疫学结果的支持：抗-5A6和抗3B6互补位相关的Ab3血清效价，兔子中高于小鼠中。还发现，同源性100F-101残基在人类抗体中也有(来自NBRF数据库)，这为在人类体系中内部影像5A6和3B6的有效性提供了理论基础。
在多种动物模型中及临床试验中证实了内部影像抗独特型抗体作为疫苗是有效的。最近Suarez(Suarez.E等。1993，Immunologia 12：122)报道了能识别抗-EGF抗体的抗-Id的获得，他得到4种非内部影像mAb。
5A6和3B6是最早报道的模拟人EGFR外部结构域的内部影像抗-IdmAb。mAb425的生物学特征说明5A6和3B6模拟EGFR的配体结合位点。血清学研究、在动物模型中的生物学效应以及结构分析均提示它们在人类免疫接种中具有潜在的价值。
治疗和诊断方面的应用
本发明的抗体可用于治疗人类疾病。因此，提供一种至少含有上述限定的一种抗体或抗体片段作为活性成分的药物制剂是本发明的一个目的，这种制剂带有一种或几种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明抗体一般经静脉或非肠道注射。一般来说，所给的抗体片段的剂量范围要大到足以使目标肿瘤受到抑制或使肿瘤发生裂解效应。剂量应根据患者年令、状况、性别和病程而定，每剂量可从每公斤体重给0.1mg到200mg不等。优选每剂量是每公斤体重给0.1 mg到100mg，每天一剂或多剂，给药一天或数天。
非肠道给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、油酸乙酯类的可注射用的有机酯以的及其他本领域已知适宜这些目的的溶剂。在含有生理上可接受的载体的组合物中可用本发明的抗体。这种适宜载体的举例为生理盐水、PBS、Ringer’s液、或乳酸化Ringer’s液。防腐剂和其他诸如抗生素、抗氧化剂及螯合剂等添加剂也可存在于药物制剂中。
抗体(或任选抗体片段)也可根据已知的方法连接到白介素2这样的细胞因子上以便维持它们的细胞毒性。
本发明的药物制剂适宜治疗各种肿瘤，包括黑色素瘤、神经胶质瘤、癌以及循环系统肿瘤和实质瘤。
用于诊断目的，可把这种抗体连接到诸如不透射线的染料上或被放射性标记。优选的标记方法是碘源标记法。作诊断用的优选抗体是给予F(ab’)2或scFv片段。这样能提供很好的结果以致可不必减去背景。
实施例：
实施例(1)人源化mAb425
mAb425的人源化以前介绍过(Kettleborough.C.A.等，1991，Protein Eng.4：773)。重构的mAb425含有嫁接在保持抗原结合位点结构的人可变区里的小鼠CDR。利用这种抗体可更精确地定位被Ab2识别的425独特型。
实施例(2)抗-EGFR 425mAb的抗-独特型mAb的制备：
用75mg与KLH(Sigma)偶联、用戊二醛聚合并与CFA(Difco)混合的纯化425mAb腹腔注射(i.p)致敏Balb/c小鼠。第7天，14天，21天，28天和38天时，再以用IFA乳化的相同免疫原给小鼠加强接种。最后一次接种后3天进行融合。用1450聚乙二醇(Boehringer Mannheim)，按以前介绍的方法(Carceller，A，1988，Sangre 33(3)：220)，使免疫小鼠的脾细胞与HL1-Friendly Myeloma-653骨髓瘤细胞融合。融合的细胞培养在39％RPMI 1640、39％Hybridoma Medium(Gibco，杂交瘤培养基)、20％胎牛血清和2％HAT中。用有限稀释法对阳性杂交细胞克隆三次。
实施例(3)Ab2活性检测和分析
在用1mg/ml纯化的425mAb包被的聚苯乙烯微孔板(Nunc，Maxisorb)上，以夹心酶联法(Sandwich ELISA)检测抗独特型抗体活性。微孔板用2％BSA-PBS封闭，粗制悬液或用0.2％BSA-PBS配制的稀释血清在4℃培养过夜。用PBS-0.05％Tween20洗涤后，加入按Har-low和Lane(1.c)的方法制备的生物素化mAb425。37℃保温一小时。微孔板洗3次后，加入用2％BSA-PBS 1：1000倍稀释的HRPO-链霉亲和素(Dako)。以3-3-5-5四甲基联苯胺(Sigma)溶液作底物，在450nm波长测定OD值。
实施例(4)、5A6、3B6和15H8 Ab2 mAb的解离常数(KD)
以Friguet的方法(Friguet，B.等人，1985，J.Immunol.Methods 77：305)进行这种检测，其要点是：把系列稀释的mAb425(2×10-8M到2×10-11M)与固定浓度的Ab2一起保温，直至平衡为止。以包被了1mg/ml mAb425的微孔板和HRPO-标记的兔抗鼠IgG1(Zymed)酶标物，用间接酶联法来测定游离Ab2的浓度。
实施例(5)：纯化人EGFR外部结构域(sEGFR)
用A431细胞分泌的EGFR来纯化人EGFR外部结构域和进行免疫亲和层析，以前已有报道(Weber，W.等，1984..J.Biol.Chem.259(23)：14631)。用它来证实间接试验及竞争试验时Ab3的特异性。
实施例(6)425mAb上可识别的独特型定位试验
为了定位被5A6、3B6和15H8限定的425独特型，检测了它们抑制425-EGFR结合的能力。首先用纯化的sEGFR进行这种分析。把粗制悬流和50mg/ml纯化的Ab2与125mg mAb425混合。37℃保温4小时后，用包被了2.5mg/ml sEGFR的微孔板以酶联法来检测425活性。平板用PBS-1％BSA洗涤3次，加入AP兔抗鼠Ig(Dako)。以3，3，5，5四甲基联苯胺作底物，在TitertekMultiscan平板读数仪上记录405nm波长处的OD值。
通过比较鼠425和重构425抑制结合曲线来补充这些分析，包括将100ng/ml小鼠或重构425与等体积、浓度由2×10-2M到2×101M增加的纯化5A6、3B6和15H8 Ab2或无关鼠IgG1抗体混合。通过针对A431细胞的间接CelIELISA法来测定剩余活性，A431细胞预先用0.1％戊二醛固定到微孔板上(5×105/每孔)，37℃保温60分钟后，细胞用PBS-1％BSA-0.05％Tween20洗涤3次。分别用HRPO-羊抗鼠IgG2a(Dianova)和HRPO-羊抗人IgG来检测结合的Ab1，以邻苯二胺(Sigma)作底物。
实施例(7)：在同系鼠(Balb/c小鼠)和同种异体鼠(F6D2F1小鼠)及异种体系(Wistar大鼠和NZW兔子)中Ab3的产生和Ab3的检测：
把纯化的Ab2通过戊二醛(Sigma)连到KLH上(Calbiochem)并用CFA或IFA乳化。当天，第15天，30天和第60天接种动物。在有些实验中，于8-12月还要加强免疫以便研究Ab3应答的稳定性。每次接种剂量小鼠为75mg、大鼠为150mg、兔子为300mg的总Ig，(小鼠)腹腔接种或(大鼠、兔子)皮下多点接种。对照组接种同剂量的无关KLH连接的鼠Ig或单独KLH。在每次加强接种当天和1周后收集血液样品。把PBS-0.15％冻干奶稀释的系列血清样品加到事先用1mg/mlAb2或其他鼠Ig包被的微孔板中。用生物素化Ab2(在鼠Ab3血清中)检测结合的抗-抗-Id，HRPO标记兔抗大鼠Ig(Dako)剥夺了鼠Ig和HRPO标记的猪抗兔Ig(Dako)的交叉反应。在大鼠和兔子中产生的抗同种型和同种异型的抗体，可经4℃过夜培养后，用鼠IgG1充分吸附1∶50到1∶100倍稀释的血清样品而消除。
实施例(8)Ab3血清对Ab2-Ab1结合的抑制作用。
这种试验是为了测定与那些Ab2位点能起反应的抗体，这些Ab2位点能导致与mAb425互补位接触。试验主要包括：把8-16ng/ml的纯化5A6、3B6和15H8及F111与系列稀释的含Ab3血清混合，4℃过夜培养后，在每ml1mg425包被的聚苯乙烯平板上用直接酶联法来测定剩余Ab2活性。结合的Ab2用PA-兔抗鼠IgG1(Zymed)来检测。
实施例(9)通过对Ab3结合的相互竞争来确定Ab2的独特型一致性
为确定每种抗-Id抗体之间独特型的一致性，检测了Ab2对Ab3血清同Ab2包被平板结合的抑制作用。在预先4℃保温过夜的等体积(1mg/ml)Ab2或对照mAb存在下，检测了系列稀释的大鼠Ab3血清(10-3到10-5)对Ab2的结合。
实施例(10)Ab3应答中抗-EGFR抗体的检测
按前面所介绍的用针对A431细胞的CellELISA法检测小鼠、大鼠和兔子Ab3血清是否有Ab1样活性，或用sEGFR(2.5mg/ml)的直接酶联法来检测。分别用HRPO兔抗小鼠Ig(Dako)、兔抗大鼠Ig(Dako)和猪抗兔Ig(Dako)作为第二抗体。还用未固定的在Terasaki平板上培养的活A431细胞，通过直接免疫荧光法检测了抗-受体抗体。
实施例(11)：5A6、3B6和15H8抗-Id对EGFR-Ab3结合的抑制作用
通过竞争试验检测了受体和抗-Id之间所共有的决定簇。把120mg-240mg/ml的5A6、3B6和15H8或无关的IgG1与1∶25到1∶150倍稀释的Ab3抗-EGFR血清在4℃下保温过夜，通过酶联法、CellELISA和直接免疫荧光法检测它们的抗受体活性。按下式计算抑制百分数：
实施例(12)RNA和cDNA的制备
从5A6、3B6和15H8杂交瘤细胞系中分离总RNA。把用PBS洗过的细胞悬浮在异硫氰酸胍溶液中，按Chirg win的氯化铯梯度超速离心法(Chirg win等。1979.Biochemistry 18，5294)分离RNA。用Pharmacia试剂盒合成第一条cDNA链。用5μgRNA在15μl体积中，37℃1小时来进行合成。不先进行克隆，直接用第一条cDNA链进行扩增。
实施例(13)：PCR扩增
用一套PCR引物扩增小鼠轻、重链可变区基因拷贝。设计5’端引物使其与前导序列杂交。引物是61个针对重链可变区结构域和405个针对Kappa链可变区结构域的寡核苷酸混合物。设计了3’端引物使得与恒定区退火。使用了特异性IgG1和Kappa链小鼠引物。
为了进行扩增，使用热稳定性DNA聚合酶、25μl反应混合液中含有：1μl cDNA-RNA杂交分子、250nM的适宜5’和3’引物混合物、200mM每种dNTP、1mM MgCl2(用于扩增轻链的)、2mM MgCl2(用于扩增重链的)、1单位Taq聚合酶(Cetus)，覆盖上石蜡油，使其从60℃开始降温直到55℃退火温度为止。取1/10 PCR反应物在1％琼脂糖TAE凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色以显现PCR扩增结果。
实施例(14)：分子克隆和测序
每一种PCR产物1μl连接到TA载体上(Invitrogen，SanDiego)。把DNA连接反应物(每种Ab2的VH和VL链区)用热激(Heat-Shock)法转化到感受态TG1大肠杆菌细胞内，这样产生6个DNA文库，一个来自每种mAb的轻链可变区，其他来自每种mAb的重链可变区。在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB平板上挑选菌落，剔出一些作进一步分析。用PCR筛选法或用Gussow介绍的质粒酶切法(Gissow，D.，ClacksonT.，1989T；Nucleic Acids Res.，17：4000)检测阳性菌落。为了对转化子进行测序，制备了双链质粒DNA(Wizard pres.，Promega Corp)。用Taq聚合酶，按Sanger等的方法(Sanger.F等1977，Proc.Natl.Acad Sci。USA.74：5463)进行双脱氧核苷酸链终止法测序。测序反应中所用的引物在TA载体上退火。
实施例(15)计算机分析和序列比较
用软件DSSP(Sybil)程序计算Ab2的二极结构及它们易接近的残基。用ANTIGENIC程序按Kolaskar和Tongaonkar方法(Kolsakar.A.S.等，1990，FEBS-Lett.276(1-2)：172)预测抗原区。用Gencore光盘BESTFIT程序进行符号列表比较来确定Ab2和EGFR的同源性。用于比较的人EGFR序列是以前报导过的序列(Ullrich等1984，原Nature 309：418)。用NationalBiomedical Research Fundation(国家生物医学研究基金会-NBRF)汇编的Protein Identification Resource(蛋白鉴定资源)(PIR)数据库和PROSIS程序将Ab2与其他已知的Ig进行了比较。