VII因子多肽和VIII因子多肽的联合应用 【技术领域】
本发明涉及含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的药物组合物。本发明还涉及用于治疗出血发作的、由多部分组成的试剂盒，其含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品。本发明还涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品用于制备药物的用途。另外，本发明涉及治疗出血、缩短凝血时间、增强止血、减少完成止血所需的凝结因子蛋白质给药次数、减少完成止血所需的凝结因子蛋白质给药量、延长血块裂解时间、增加血块强度和增强血纤蛋白块形成的方法。
背景技术
血液凝结因子VII(FVII)是血浆凝结因子。活化的VII因子(FVIIa)通过与因血管壁受损而暴露在外的组织因子(TF)形成复合物来起始正常的止血过程，随后，将IX和X因子(FIX和FX)激活为其活化形式，即IXa和Xa因子(FIXa和FXa)。在携有组织因子的细胞上，Xa因子将有限量的凝血酶原转变为凝血酶。凝血酶活化血小板，并将V和VIII因子活化为Va和VIIIa因子(FVa和FVIIIa)，在随后的过程中，这两种辅因子导致凝血酶完全裂解。该过程包括由(与VIIIa因子形成复合物的)IXa因子产生Xa因子，且发生于活化的血小板表面。凝血酶最终将血纤蛋白原转变为血纤蛋白，导致形成血纤蛋白块。
VII因子主要作为单链酶原存在于血浆中，由FXa将其裂解为双链的活化形式FVIIa。已将重组的活化VIIa因子(rFVIIa)开发成前止血剂。给因抗体形成而不能用凝结因子产物治疗的出血的血友病受试者施用rFVIIa可提供快速而高效的前-止血反应。FVIIa可成功治疗VII因子缺乏地出血受试者或虽具有正常凝结系统但遭遇过度失血的受试者。在这些研究中，未遇到rFVIIa不利的副作用(特别是血栓栓塞的出现)。
血液凝结因子VIII是在血液中循环的糖蛋白(MW330,000)。它由肝脏和内皮分泌，作为与von Willebrand因子的复合物被分泌至血浆中并在其中循环。VIII因子在凝血过程中作为辅因子起作用，因为在IXa因子、钙和磷脂的存在下，它可加速X因子至Xa因子的转变。尽管它作为单个多肽链被合成，但它在血浆中主要以两-链分子的形式循环。将FVIII活化成有活性的辅因子需要通过凝血酶或其它一些蛋白酶的额外的蛋白酶解。血流中VIII因子的存在量或活性的降低会导致A型血友病。VIII因子活性降低的水平与疾病的严重程度直接成比例。目前的A型血友病疗法就是用得自血浆的或重组的VIII因子重新替换缺失的蛋白质(即所谓的FVIII替代或替换疗法)。
凝结因子缺乏(例如FVIII缺乏)反映了不同类型的基因缺损。当基因损害较严重时，例如存在缺失或移码时，无法产生mRNA，会导致凝结因子(严重)缺乏。由例如非关键位置的点突变引起的较轻的基因损害导致生物活性有所降低的蛋白质的分泌。遗传模式是隐性的和X-连锁的，这意味着只有具有一个X-染色体的男人才会受影响。凝结缺损的严重性可以是轻度或重度。严重性取决于血浆中正常起作用的VIII因子的浓度。替换疗法的目的是将患者的凝血因子活性水平(下文称之为“因子水平”)升高至能恢复止血的水平，并且能维持该水平直至实质上完全愈合。如果有效治疗开始得晚，将有损于伤口愈合，并且需要比平常更多的治疗。治疗的量取决于止血所需凝结因子的血浆浓度，血液的重获和转输物质的半寿期。
在一些基因缺损为杂合型的受试者(例如身为疾病载体的女人)中，VIII因子的水平也可能会或多或少地降低。此类受试者出血的倾向性增加，与病情轻微的血友病患者差不多，因此，也可以对其进行治疗。
一些接受VIII因子替换疗法的患者(患有A型血友病)产生了抗施用的VIII因子的抗体。然而，出生时VIII因子水平正常的人(未患有先天性的VIII因子-缺乏症)在以后的日子里会因不明原因产生抗VIII因子的自身抗体(获得性A型血友病)。在这两种情况下，抗体可以以低、适中或高滴度存在。对于具有低或适中抑制剂-滴度的患者而言，有时可以用VIII因子进行治疗。
血友病以各种各样的严重程度出现。检测不到VIII因子或VIII因子低于1％的患者通常病情严重，微小的创伤会导致血液流入肌肉和关节，有时明显是自发性出血。少量VIII因子能提供相当大的保护作用，通常会使VIII因子为正常水平的1-5％的患者仅在创伤后出血，而且血液流入肌肉和关节的情况也不严重等，通常认为患者病情为中度。VIII因子超过5％的患者通常仅在大的创伤或手术后出血，可以认为患者病情较轻。必须认识到对个别的病例而言，上述分类并不总是正确的。一些VIII因子水平很低的患者很少出血，而另一些VIII因子超过5％的患者却会反复出血，血液流入起初因创伤性关节积血而受损的“靶关节”中，看上去病情较严重。然而，一般说来，因子水平越高，出血症状越不明显，VIII因子水平超过正常水平的35-40％时，一般不会出现异常出血。下文显示了因子水平和A型血友病症状之间的一般性关系。
与VIII因子水平相关的血友病严重程度
严重程度 因子水平(为正常水平的％) 表现类型
重度 0-1 明显自发性出血。严重出血
中度 1-5 出血较少。关节积血主要为创伤性出血
轻度 5-30 创伤后、手术后、拔牙后出血。较少发作
目前的A型血友病疗法就是用得自血浆的或重组的VIII因子替换缺失的蛋白质。使用VIII因子产品进行静脉内输注(用于注射)以紧急治疗急性出血。出血类型分类如下：
1.关节积血(关节中出血)
2.威胁生命和四肢的出血(腹膜后出血、CNS出血、咽后出血、伴有隔间综合征的肌肉出血和大量GI出血)
3与手术(矫形、选择操作、紧急手术)有关的出血预防
经验表明：如果VIII因子水平维持在超过正常水平的30-40％，直至完全愈合的话，通常即可维持正常的止血。然而，其它考虑也是至关重要的。腹部手术后受影响部位(如积血关节)的移动、咳嗽或走动可促进出血。自然疗法或操作法需要相当高的水平，而固定轻微损害能以相对低的因子水平控制出血。在不同情况下欲达到的靶水平大致如下所示：
治疗标准型关节积血(第1类)：
正常的目的是使VIII因子的起始血浆浓度达到正常水平的至少30-40％，接着，使血浆浓度为正常水平的至少10-20％达2至3天。
治疗威胁生命和四肢的出血(第2类)：
正常的目的是使VIII因子的起始血浆浓度达到正常水平的至少50％，接着，使血浆浓度为正常水平的至少20％达1周。
与手术有关的预防出血(第3类)：
正常的目的是使手术当天的VIII因子血浆浓度达到正常水平的至少60-100％，接着，从第2至第7天，使血浆浓度为正常水平的至少30-40％，再将血浆浓度持续保持为正常水平的至少10-20％达1至2周。
根据上述治疗方针，以下可以说是与出血类型有关的VIII因子注射次数。
VIII因子的平均血浆半寿期为10-12小时，在临床实践中，每次出血发作通常使用的VIII因子平均注射次数如下：
关节积血(关节中出血)：家庭治疗，轻微关节积血：1-3次注射；医院治疗，较严重的关节积血：6-14次注射。
威胁生命和四肢的出血：10-20次注射。
与手术有关的出血预防：30-40次注射。
在血友病的临床治疗中，目前使用FVIIa制止具有FVIII或FIX抑制剂(能妨碍替换疗法)的患者出血。然而，由于预期VIIa因子比VIII因子短的半寿期(2.5小时：10-12小时)可能需要更频繁的VIIa因子注射才能维持某一水平的止血能力，因此，临床医生一般不使用FVIIa作为不含抑制剂的血友病患者(分别可以使用FVIII或FIX对其进行治疗)的一线治疗药物。
欧洲专利号225.160(Novo Nordisk)涉及FVIIa组合物以及治疗不是由凝结因子缺乏或凝结因子抑制剂引起的出血紊乱的方法。
欧洲专利号82.182(Baxter Travenol Lab.)涉及可用于对抗受试者的血液凝结因子缺乏或血液凝结因子抑制剂的作用的VIIa因子组合物。
Lusher等，Haemophilia，1998，4，pp.790-798涉及施用重组VIIa因子以治疗含和不含抑制剂的A型和B型血友病患者的关节、肌肉和粘膜出血。
Kjalke等，Thrombosis and Haemostasis，1999(Suppl)，0951涉及施用额外的外源性FVIIa，及其在模拟A型或B型血友病的模型系统中，对活化的血小板表面的凝血酶形成的作用。
美国专利号5891,843(Immuno)涉及与具有FEIB-活性的第二种成分，如活化的凝血酶原复合物或FEIBA制品混合的FVIIa组合物。
目前，治疗血友病所用的很多VIII因子产品含有重组产生的VIII因子。然而，所述产品也可以分离自人或猪血浆。这些纯化的产品经常含有较少量的其它凝结因子或其它的血浆成分。通常，所述其它的血浆成分是不必要的(因为存在病毒感染或其它污染的风险)，据认为，用重组蛋白质(例如VIIa因子)部分替代这种产品可以改善组合物和治疗，并且有利于患者。
目前，一般在止血之前几次注射或输注VIII因子来治疗经受出血发作的、VIII因子水平降低的受试者(例如A型血友病患者)。此外，需要多次注射以维持止血直至导致出血的伤口完全愈合。
一般用大输注量的液体，如静脉内(i.v.)用的液体、注射胶体输注产品、白蛋白、红血细胞浓缩物等来治疗出血过多的创伤受害者。需要大量输血的过量出血可导致产生多器官衰竭，包括肺和肾功能受损。
较快地停止出血对这些受试者而言有着重要的益处。所以要减少停止出血并维持止血所需的注射次数和或减少停止出血并维持止血所用的凝结蛋白质的量。
在本领域中，仍需改善对经受出血发作的受试者，包括因凝结因子VIII的水平降低而导致出血发作的受试者的治疗。本领域仍需要改善的、可靠的和应用广泛的方法，用于增强凝结、增强或确保稳定止血栓形成、提高对所治疗的受试者的便利性、或使受试者，特别是凝血酶产生受损的受试者获得完全或充分止血。仍需要获得完全或充分止血所需的FVIIa的量或FVIII的量有所减少的方法。还需要获得完全或充分止血所需的凝结因子蛋白质的总量有所减少的方法，和停止出血所需的时间缩短的方法。
发明简述
本发明的一个目的是提供组合物，所述组合物可有效用于治疗或预防出血发作和凝结紊乱。
本发明的第二个目的是提供单一剂量形式的组合物，所述组合物可有效用于治疗或预防出血发作或用作前促凝剂。本发明的另一个目的是提供表现出协同作用的组合物、治疗方法或试剂盒。
本发明的另一个目的是提供基本上不表现出副作用，如凝结系统高水平的全身性活化的组合物、治疗方法或试剂盒。
通过阅读本说明书的描述，本发明的其它目的是显而易见的。
第一方面，本发明涉及含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的药物组合物。
第二方面，本发明涉及含有治疗出血发作的药物的、由多部分组成的试剂盒，其含有a)以第一种单位剂量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和药物可接受载体；b)以第二种单位剂量形式存在的、有效量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品和药物可接受载体；和c)含有所述第一和第二种剂量形式的容器装置。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物用于制备治疗受试者出血发作的药物的用途。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物用于制备缩短凝血时间的药物的用途。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物用于制备延长血块裂解时间的药物的用途。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物用于制备增加血块强度的药物的用途。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的出血发作的方法，所述方法包括给需要治疗的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效治疗出血。
另一方面，本发明涉及缩短受试者的凝血时间的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效缩短凝血时间。
另一方面，本发明涉及增强受试者止血能力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强止血。
另一方面，本发明涉及减少使受试者停止出血并维持止血所需凝结因子蛋白质的给药次数的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效停止出血和维持止血。
另一方面，本发明涉及减少使受试者停止出血并维持止血所需凝结因子蛋白质的给药量的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效停止出血和维持止血。
另一方面，本发明涉及使受试者的血块裂解时间延长的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效延长血块裂解时间。
另一方面，本发明涉及增加受试者的血块强度的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增加血块强度。
另一方面，本发明涉及增强受试者的血纤蛋白块形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强血纤蛋白块形成。
另一方面，本发明涉及含有治疗出血发作的药物的、由多部分组成的试剂盒，其含有a)以一个单位剂量形式存在的、有效量的VII因子或VII因子-相关多肽和有效量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品和药物可接受载体；和b)含有所述一个单位剂量形式的容器装置。
在本发明的一系列实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽是VII因子-相关多肽。在另一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽是VII因子多肽。在本发明的一系列实施方案中，所述VII因子-相关多肽是VII因子氨基酸序列变体。在一个实施方案中，当按照本说明书中描述的“体外水解试验”检测时，VII因子-相关多肽的活性与天然人VIIa因子(野生型FVIIa)的活性之间的比率至少约为1.25。
在本发明的一系列实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽是VII因子多肽。在一个实施方案中，VII因子是人VII因子。在一个实施方案中，VII因子是牛、猪、犬、马、鼠或鲑鱼的VII因子。在另一个实施方案中，VII因子多肽是重组VII因子。在另一个实施方案中，VII因子多肽是得自血浆的VII因子。在另一个实施方案中，VII因子多肽是得自血浆的人VII因子。在另一个实施方案中，VII因子多肽是重组人VII因子。在本发明的一系列实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽为其活化形式。在本发明的一个实施方案中，VII因子多肽是重组人VIIa因子。
在本发明的一系列实施方案中，VIII因子或VIII因子-相关多肽是VIII因子-相关多肽。在一个实施方案中，VIII因子-相关多肽是VIII因子氨基酸序列变体。在一个实施方案中，当按照本说明书中描述的“生色试验”检测时，VIII因子-相关多肽的活性与天然人VIII因子(野生型FVIII)的活性之间的比率至少约为1.25。在一个实施方案中，VIII因子或VIII因子-相关多肽是VIII因子多肽。在一个实施方案中，VIII因子是人VIII因子。在一个实施方案中，VIII因子是牛、猪、犬、马、鼠或鲑鱼的VIII因子。在另一个实施方案中，VIII因子多肽是重组的VIII因子。在另一个实施方案中，VIII因子多肽是得自血浆的VIII因子。在另一个实施方案中，VIII因子多肽是得自血浆的人VIII因子。在另一个实施方案中，VIII因子多肽是重组人VIII因子。在本发明的一系列实施方案中，VIII因子或VIII因子-相关多肽为其活化形式。
在一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽以质量比约为100∶1至1∶100VII因子∶VIII因子的比率存在。
在一个实施方案中，VII因子-相关多肽是氨基酸序列变体，与野生型VII因子(即具有美国专利号4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽)相比，所述变体有不超过20个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VIIa因子变体有不超过15个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VII因子变体有不超过10个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VII因子变体有不超过8个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VII因子变体有不超过6个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VII因子变体有不超过5个的氨基酸被取代、缺失或插入；在另一个实施方案中，VII因子变体与野生型VII因子相比，有不超过3个的氨基酸被取代、缺失或插入。在一个实施方案中，VII因子变体选自L305-FVIIa，L305V/M306D/D309S-FVIIa，L305I-FVIIa，L305T-FVIIa，F374P-FVIIa，V158T/M298Q-FVIIa，V158D/E296V/M298Q-FVIIa，K337A-FVIIa，M298Q-FVIIa，V158D/M298Q-FVIIa，L305V/K337A-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII和S336G-FVII。
另一方面，与天然人凝结因子VIIa相比，VII因子或VII因子-相关多肽具有增加的不依赖于组织因子的活性。另一方面，增加的活性并不伴随着底物特异性的改变。在本发明的另一方面，VII因子或VII因子-相关多肽与组织因子的结合应该未受损害，当与组织因子结合时，VII因子或VII因子-相关多肽应该至少具有野生型VIIa因子的活性。
在一个优选的实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽是重组人VIIa因子和重组人VIII因子。
在一个实施方案中，哺乳动物血液的凝血时间缩短。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的止血增强。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的血块裂解时间延长。在另一个实施方案中，哺乳动物血液的血块强度增加。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的血纤蛋白块形成有所增强。在一个实施方案中，哺乳动物血液是人血液。在另一个实施方案中，哺乳动物血液是正常的血液；在另一个实施方案中，哺乳动物血液是具有正常水平的凝结因子蛋白质的血液；在另一个实施方案中，哺乳动物血液是具有正常水平的VIII因子的血液；在另一个实施方案中，血液是正常的人血液；在另一个实施方案中，血液是凝血酶产生受损的受试者的血液。在一个实施方案中，血液是缺乏一种或多种凝结因子的受试者的血液；在另一个实施方案中，血液是含有抗一种或多种凝结因子的抑制剂的受试者的血液。在一个实施方案中，血液是血纤蛋白原浓度有所降低的受试者的血液。在一个实施方案中，血液是VIII因子-缺乏的人血液。
在本发明的一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽是所使用的唯一的止血剂。在另一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽是所使用的唯一有活性的止血剂。在另一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽是所使用的唯一的凝结因子。在本发明的一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽是所使用的唯一有活性的药剂。本文所用的“唯一的”药剂或因子指的是以下情况，其中VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽合起来是药物组合物或试剂盒中所含的、可以使用的仅有的止血剂、有活性的止血剂或凝结因子，或是在特定疗程，如特定出血发作疗程中可用于给患者施用的仅有的止血剂、有活性的止血剂或凝结因子。应理解这些情况还包括：可使用的其它止血剂或凝结因子不以足以显著影响一个或多个凝结参数的量或活性存在的情况。
在另一个实施方案中，将药物组合物配制成供静脉内给药使用。在一个实施方案中，组合物还含有药物可接受的赋形剂。
在本发明的一个实施方案中，组合物是单一剂量形式，其中单一剂量形式含有两种凝结因子。在本发明的一个实施方案中，组合物为由多部分组成的试剂盒形式，其含有VII因子或VII因子-相关多肽制品作为第一种单位剂量形式，含有VIII因子或VIII因子-相关多肽制品作为第二种单位剂量形式，并含有包含所述第一和第二种剂量形式的容器装置。在一个实施方案中，可以使用的组合物或试剂盒还分别含有施用组合物或独立组分的说明。
在本发明的一个实施方案中，以单一剂量形式施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。在本发明的一个实施方案中，以含有VII因子或VII因子-相关多肽制品的第一种单位剂量形式和含有VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的第二种单位剂量形式施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。
在本发明的一个实施方案中，同时施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。在另一个实施方案中，依次施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。在一个实施方案中，以不超过15分钟，优选为10，更优选为5，更优选为2分钟的时间间隔施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。在一个实施方案中，以2小时，优选为1至2小时，更优选为1小时，更优选为30分钟至1小时，更优选为30分钟，更优选为15至30分钟的时间间隔施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。
在一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽的有效量为约0.05mg/天至约500mg/天(70-kg受试者)。在一个实施方案中，VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的有效量为约0.01mg/天至约500mg/天(70-kg受试者)。
在一个实施方案中，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽以质量比约为100∶1至1∶100VII因子∶VIII因子的比率存在。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物为单一剂量形式，它实质上由VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，以及一种或多种选自药物可接受赋形剂或载体，稳定剂，去污剂，中性盐，抗氧化剂，防腐剂和蛋白酶抑制剂组成。
在另一个实施方案中，受试者是人；在另一个实施方案中，受试者的凝血酶产生受损；在一个实施方案中，受试者的血纤蛋白原的血浆浓度有所降低(例如多次输血的受试者)；在一个实施方案中，受试者的VIII因子的血浆浓度有所降低。
在一个实施方案中，药物组合物用于家庭治疗。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗患有VIII因子-反应性综合征的受试者的出血。
另一方面，本发明涉及VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗VIII因子水平有所降低的受试者的出血。
另一方面，本发明涉及与用VIII因子作为唯一的凝结蛋白质来治疗患有VIII因子反应性综合征的受试者时相比，能增强所述受试者的止血能力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强止血。
另一方面，本发明涉及与用VIII因子作为唯一的凝结蛋白质来治疗VIII因子水平有所降低的受试者时相比，能增强所述受试者的止血能力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强止血。
另一方面，本发明涉及增强受试者的凝血酶形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强凝血酶形成。
另一方面，本发明涉及与用VIII因子作为唯一的凝结蛋白质来治疗患有VIII因子反应性综合征的受试者时相比，能增强所述受试者的凝血酶形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强凝血酶形成。
另一方面，本发明涉及与用VIII因子作为唯一的凝结蛋白质来治疗VIII因子水平有所降低的受试者时相比，能增强所述受试者的凝血酶形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效增强凝血酶形成。
另一方面，本发明涉及与以VIII因子作为唯一的凝结蛋白质施用给患有VIII因子反应性综合征的受试者时所需的给药次数相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药次数的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效减少凝结因子蛋白质的给药次数。
另一方面，本发明涉及与以VIII因子作为唯一的凝结蛋白质施用给VIII因子水平有所降低的受试者时所需的给药次数相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药次数的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效减少凝结因子蛋白质的给药次数。
另一方面，本发明涉及与以VIII因子作为唯一的凝结蛋白质施用给患有VIII因子反应性综合征的受试者时所需的给药量相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药量的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效减少凝结因子蛋白质的给药量。
另一方面，本发明涉及与以VIII因子作为唯一的凝结蛋白质施用给VIII因子水平有所降低的受试者时所需的给药量相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药量的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效减少凝结因子蛋白质的给药量。
另一方面，本发明涉及治疗患有VIII因子反应性综合征的受试者的出血的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效治疗出血。
另一方面，本发明涉及治疗VIII因子水平有所降低的受试者的出血的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效治疗出血。
在一个实施方案中，受试者具有水平有所降低的VIII因子。在一个实施方案中，受试者患有VIII因子反应性综合征。在一个实施方案中，VIII因子反应性综合征是A型血友病。
在一个实施方案中，降低的VIII因子水平为正常水平的90％或以下，在另一个实施方案中，VIII因子水平为正常水平的80％或以下，在另一个实施方案中，为50％或以下，在另一个实施方案中，为40％或以下，在另一个实施方案中，为30％或以下，在另一个实施方案中，为20％或以下，在另一个实施方案中，为10％或以下，在另一个实施方案中，为5％或以下，在另一个实施方案中，为2％或以下。适当时，术语可互换使用。在优选的实施方案中，VIII因子水平为正常水平的30％以下。
另一方面，本发明涉及治疗患有VIII因子反应性综合征的受试者的出血的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用第一种量的VII因子或VII因子-相关多肽制品和第二种量的VIII因子或VIII因子-相关多肽制品，其中第一和第二种量合起来能有效治疗出血。
在一个实施方案中，VII因子是人重组VIIa因子(rFVIIa)。在另一个实施方案中，rFVIIa是NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
在一个实施方案中，VIII因子是人重组VIII因子(rFVIII)。在另一个实施方案中，VIII因子产品是ReFacto(AHP/Genetics Institute)，Alphanate(Alpha)，Bioclate(Aventis)，Monoclate-P(Aventis)，Helixate(Aventis)，Recombinate(Baxter)，Hemofil M(Baxter)，Kogenate (Bayer)，Nordiate(HemaSure)，FACTEUR VIII-LFB(Laboratoire Francais duFractionnement et des Biotechnologies(LFB))，Hyate：C(Speywood)和KogenateSF(Bayer)。
在一个实施方案中，将药物组合物配制成静脉内给药。在一个实施方案中，组合物还含有纤溶系统的抑制剂，包括但不限于抑蛋白酶肽、ε-氨基己酸或凝血酸。
【附图说明】
图1：图1显示了当缺乏FVIII的血浆中缺乏和存在FVIII时，rFVIIa缩短凝血时间的效果。
图2：图2显示了当正常人血浆中缺乏和存在FVIII时，rFVIIa缩短凝血时间的效果。
发明详述
与未遭受任何出血的受试者相比，因手术或严重创伤而出血过多因此需要输血的受试者会产生更多的并发症。然而，如果需要施用人血液或血液制品(用于治疗凝结因子缺乏的血小板、白细胞、得自血浆的浓缩物等)，这会有转移人病毒(例如肝炎病毒、HIV、细小病毒或其它迄今为止仍不为人所知的病毒)以及非病毒病原体的风险，因此，中度出血也会导致并发症。需要大量输血的过度出血可导致产生多器官衰竭，包括肺和肾功能受损。一旦受试者产生这些严重的并发症，就会引起与多个细胞因子和炎性反应有关的级联事件，使得任何治疗都变得十分困难，而且不幸地是，所述治疗经常不能成功。因此，手术以及治疗严重组织损伤的主要目的是避免出血或使出血量最少。为了避免或最少化不合乎需要的出血，重要的是确保形成稳定和固体状的止血栓，所述止血栓不易于被纤溶酶溶解。另外，重要的是确保快速而有效地形成止血栓或血块。
患有血小板减少症(血小板的数目减少或活性降低)的受试者凝血酶产生受损，并且血纤蛋白栓的稳定性较差，导致止血栓易于过早溶解。另外，遭受严重创伤或器官损害，因此需频繁输血的受试者的血小板数目降低，血纤蛋白原、VIII因子和其它凝结蛋白的水平也会降低。这些受试者的凝血酶产生受损(或减少)。因此，这些受试者的止血功能有缺陷，或止血效果较差，导致形成易于过早被蛋白酶溶解的血纤蛋白栓，在以深度创伤和器官损害为特征的情况下，所述酶还会大量释放。
遭遇大量失血的患者在临床上不稳定。所述患者有遭受心房纤维性颤动的风险，这会导致心脏活性的致命性停止；肾功能受损；或肺部液体外渗(所谓的“湿肺”或ARDS)。
组织出血也可导致血肿的形成。(特别是头内和脊髓)血肿的大小与神经功能丧失的程度、康复困难、和/或康复后的永久性神经功能损伤的严重性和程度密切相关。当血肿位于脑部时，结果最为严重，甚至会导致患者死亡。所谓的区室综合征是由体内严重出血流至四肢而导致的临床病症。在胳膊和腿中，肌肉和骨的外部受被称为筋膜的几乎无弹性的胶原层束缚。受筋膜束缚的腔隙出血导致该区室的压力增加，继而压迫神经、血管和肌肉组织，如果得不到及时治疗即会导致大面积组织坏死。坏死组织一旦形成，即会在治愈过程中在很大程度上转化至与原先的肌肉组织相比有所收缩的结缔组织。这种挛缩使受试者受影响关节易于遭受运动性损害，又会需要矫正手术。严重血肿还会导致假囊肿形成，假囊肿看上去象良性肿瘤，因为这种肿瘤样囊肿侵蚀受影响的肌肉或骨组织。需要进行手术以除去这种假囊肿。
血肿的形成还增加了受试者被感染的频率。输入血液制品，如红血细胞也是如此。输入红血细胞导致在受试者体内形成抗体的风险。当已形成抗血型抗原的抗体时，就很难给受试者输血，因为寻找合适血型的难度将会不断增加。
因此，治疗出血的主要目的是以最短的时间达到止血，从而使血液的损失最少。
因此，本发明提供了用于给需要治疗的受试者治疗出血发作的有益的组合物、用途和方法。所述组合物、用途和方法与有益的效果有关，例如在止血之前血液损失较小，手术过程中需要的血液较少，能将血压维持在可接受的水平直至止血，血压能较快地稳定下来，经治疗患者的恢复时间较短，经治疗患者的康复时间较短，减少血肿形成或形成较小的血肿，包括脑部血肿，较少形成假囊肿，较少形成肌肉挛缩，较快停止出血，停止出血并维持止血所需的注射次数减少，停止出血并维持止血所用凝结蛋白的量减少。
与单独施用VIIa因子或VIII因子时的凝血时间相比，联合施用VII因子或VII因子-相关多肽，如VIIa因子制品与VIII因子或VIII因子-相关多肽制品提供了较短的凝血时间。
与单独施用VIIa因子或VIII因子时的蛋白质用量相比，联合施用VII因子或VII因子-相关多肽，如VIIa因子制品与VIII因子或VIII因子-相关多肽制品使需要这种治疗的受试者停止出血并维持止血所用凝结因子的总量减少。
与单独施用VIIa因子或VIII因子时的情况相比，联合施用VII因子或VII因子-相关多肽，如VIIa因子制品与VIII因子或VIII因子-相关多肽制品使停止出血所需的时间缩短，并使维持止血所需的注射次数减少。与单独施用VIII因子或VIIa因子时的情况相比，联合施用VII因子或VII因子-相关多肽，如VIIa因子制品与VIII因子或VIII因子-相关多肽制品使确保完全止血所需的注射次数减少。
对于患有A型血友病的患者而言，本发明提供了同时或依次服用VIII因子或VIII因子-相关多肽制品和VII因子或VII因子-相关多肽制品的有益效果。凝结因子VIII代用品和VII因子或VII因子-相关多肽制品都可以在这些患者群体中诱导止血，但它们具有不同的生化作用机制。同时服药可增加止血效果。
本发明提供了药物组合物，其为含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物。该组合物可以是单一组合物的形式，也可以是多-组分试剂盒(由多部分组成的试剂盒)的形式。本发明的组合物可用作哺乳动物，包括灵长类动物如人的治疗和预防性前止血剂。本发明还提供了治疗(包括预防性治疗或预防)受试者，包括人的出血发作的方法。
不论何时，本说明书上下文中提及的第一或第二或第三等单位剂量都不表示给药的优选次序，这样做仅是为方便表述而已。
VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合是有利的产品，它能确保较短的凝血时间和止血栓的快速形成。本发明人将会证明：与单独施用VIIa因子或VIII因子相比，联合施用VIIa因子和VIII因子可更加有效地缩短正常人血浆的凝血时间。因此，通过缩短凝血时间，即可获得更加有效的治疗受试者出血的方法。另外，可以用总量较少的VII因子和VIII因子或VIII因子-相关多肽来治疗患者。
VII因子多肽：
在实施本发明时，可以使用任何能有效预防或治疗出血的VII因子多肽。包括得自血液或血浆的、或通过重组方法产生的VII因子多肽。
本发明包括VII因子多肽，例如具有美国专利号4784950所公开的氨基酸序列的VII因子多肽(野生型人VII因子)。在一些实施方案中，VII因子多肽是公开于例如美国专利号4784950中的人VIIa因子(野生型VII因子)。在一系列实施方案中，VII因子多肽包括表现出至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，最优选至少约70％人VIIa因子特定生物活性的多肽。在一系列实施方案中，VII因子多肽包括表现出至少约90％，优选至少约100％，优选至少约120％，更优选至少约140％，最优选至少约160％人VIIa因子特定生物活性的多肽。在一系列实施方案中，VII因子多肽包括与美国专利号4784950中公开的野生型VII因子序列至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％相同的多肽。
本文所用“VII因子多肽”包括但不限于VII因子以及VII因子-相关多肽。术语“VII因子”欲包括但不限于具有野生型人VII因子(公开于美国专利号4784950)以及得自其它物种的野生型VII因子，如牛、猪、犬、鼠和鲑鱼VII因子的氨基酸序列1-406的多肽，所述VII因子得自血液或血浆，或是通过重组方法产生的。VII因子还包括可能在不同个体中出现和产生的VII因子天然等位基因变异体。糖基化或其它翻译后修饰的水平和位置随着所选择的宿主细胞和宿主细胞环境特性的不同而不同。术语“VII因子”也欲包括未裂解(酶原)形式的VII因子多肽，以及经蛋白酶解加工，产生其各自的生物活性形式(被称为VIIa因子)的VII因子多肽。VII因子一般在残基152和153之间被裂解，产生VIIa因子。
“VII因子-相关多肽”包括但不限于相对于人VII因子而言已被化学修饰和/或相对于人VII因子而言含有一个或多个氨基酸序列改变(即VII因子变体)，和/或相对于人VII因子而言含有截短的氨基酸序列(即VII因子片段)的VII因子多肽。所述VII因子-相关多肽可表现出不同于人VII因子的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。术语“VII因子-相关多肽”欲包括未裂解(酶原)形式的多肽，以及经蛋白酶解加工，产生其各自的生物活性形式(被称为“VIIa因子-相关多肽”或“活化的VII因子-相关多肽”)的多肽。
本文所用“VII因子-相关多肽”包括但不限于相对于野生型人VII因子而言，表现出基本上相同或有所改良的生物活性的多肽，以及相对于野生型人VIIa因子的活性而言，VIIa因子生物活性实质上被修饰或降低的多肽。这些多肽包括但不限于经化学修饰的VII因子或VIIa因子以及导入了特定的氨基酸序列改变的VII因子变体，所述改变可修饰或破坏多肽的生物活性。
所述多肽还包括氨基酸序列略有修饰的多肽，例如具有经修饰的N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽，和/或相对于人VIIa因子而言已被化学修饰的多肽。
VII因子-相关多肽，包括VII因子变体，无论其与野生型VII因子相比，表现出基本上相同或更好的生物活性，还是相对于野生型VII因子而言表现出实质上被修饰或降低的生物活性，都包括但不限于因一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型VII因子序列的氨基酸序列的多肽。
VII因子-相关多肽，包括变体包括那些经上文所述的一个或多个凝血试验、蛋白酶解试验或TF结合试验检测，可表现出至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约110％，至少约120％，或至少约130％在相同细胞类型中产生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。
相对于野生型VIIa因子而言，具有基本上相同或有所改良的生物活性的VII因子-相关多肽，包括变体包括那些经上文所述的一个或多个凝血试验、蛋白酶解试验或TF结合试验检测，可表现出至少约25％，优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约100％，更优选至少约110％，更优选至少约120％，最优选至少约130％在相同细胞类型中产生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。
相对于野生型VIIa因子而言，具有实质上有所降低的生物活性的VII因子-相关多肽，包括变体包括那些经上文所述的一个或多个凝血试验、蛋白酶解试验或TF结合试验检测，可表现出低于约25％，优选低于约10％，更优选低于约5％，最优选低于约1％在相同细胞类型中产生的野生型VIIa因子的比活性的多肽。相对于野生型VII因子而言，具有实质上被修饰的生物活性的VII因子变体包括但不限于表现出不依赖于TF的X因子蛋白酶解活性的VII因子变体，和与TF结合但不裂解X因子的VII因子变体。
在一些实施方案中，VII因子多肽是VII因子-相关多肽，特别是变体，其中，当在“体外水解试验”(参见下文“试验”)中检测时，所述VII因子多肽活性和天然人VIIa因子(野生型FVIIa)活性之间的比率至少约为1.25；在其它实施方案中，该比率至少约为2.0；在其它实施方案中，该比率至少约为4.0。在本发明的一些实施方案中，VII因子多肽是VII因子-相关多肽，特别是变体，其中，当在“体外水解试验”(参见下文“试验”)中检测时，所述VII因子多肽活性和天然人VIIa因子(野生型FVIIa)活性之间的比率至少约为1.25；在其它实施方案中，该比率至少约为2.0；在其它实施方案中，该比率至少约为4.0；在其它实施方案中，该比率至少约为8.0。
在一些实施方案中，VII因子多肽是公开于例如美国专利号4784950中的人VII因子(野生型VII因子)。在一些实施方案中，VII因子多肽是人VIIa因子。在一系列实施方案中，VII因子多肽是表现出至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，最优选至少约70％人VIIa因子特定生物活性的VII因子-相关多肽。在一些实施方案中，VII因子多肽具有因一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而不同于野生型VII因子序列的氨基酸序列。
与野生型VII因子相比，具有基本上相同或有所改良的生物活性的VII因子变体的非限制性例子包括：S52A-FVII，S60A-FVII(Iino等，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；L305-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；美国专利号5580560中公开的表现出增加的蛋白酶解稳定性的FVIIa变体；在残基290和291之间或残基315和316之间被蛋白酶裂解的VIIa因子(Mollerup等，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；和VIIa因子的氧化形式(Kornfelt等，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)。相对于野生型VII因子而言，具有实质上降低或经修饰的生物活性的VII因子变体的非限制性例子包括：R152E-FVIIa(Wildgoose等，Biochem 29：3413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等，J.Biol.Chem.270：66-72，1995)，FFR-FVIIa(Holst等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15：515-520，1998)，和缺乏Gla结构域的VIIa因子(Nicolaisen等，FEBS Letts.3 17：245-249，1993)。经化学修饰的VII因子多肽和序列变体的非限制性例子描述于例如美国专利号5997864。
VIIa因子在凝血中的生物活性源自其(i)结合组织因子(TF)的能力和(ii)催化蛋白酶裂解IX因子或X因子以产生活化的IX因子或X因子(分别为IXa或Xa因子)的能力。
为了本发明的目的，通过按照美国专利号5997864所述，使用缺乏VII因子的血浆和促凝血酶原激酶测定制品促进凝血的能力，可以定量测定VII因子多肽的生物活性(“VII因子生物活性”)。在此试验中，生物活性被表示为相对于对照样品而言，凝血时间的减少，通过与含有1个单位/ml VII因子活性的集中的人血清标准比较，将所述生物活性转化为“VII因子单位”。或者，通过下述方法定量测定VIIa因子的生物活性：
(i)在含有包埋于脂质膜的TF和X因子的系统中，测定VIIa因子或VIIa因子-相关多肽产生活化的X因子(Xa因子)的能力(Persson等，J.Biol.Chem.272：19919-19924，1997)；
(ii)在含水系统中测定X因子水解(参见下文的“体外水解试验”)；
(iii)使用基于表面胞质基因组共振的仪器测定VIIa因子或VIIa因子-相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.413：359-363，1997)；和
(v)测定VIIa因子和/或VIIa因子-相关多肽对合成底物的水解(参见下文的“体外水解试验”)；和
(v)在不依赖于TF的体外系统中测定凝血酶的产生。
术语“VII因子生物活性”或“VII因子活性”欲包括产生凝血酶的能力；该术语还包括在缺乏组织因子时，在活化的血小板表面产生凝血酶的能力。
本发明可以使用的VIIa因子制品是，但不限于NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
VIII因子多肽：
本发明包括VIII因子多肽，例如具有公开于例如Toole等，Nature 1984；312：342-347的氨基酸序列(野生型人VIII因子)的VIII因子多肽。
在实施本发明时，可以使用任何能有效预防或治疗出血的VIII因子多肽。其包括得自血液或血浆，或通过重组方法产生的VIII因子多肽。
本文所用“VIII因子多肽”包括但不限于VIII因子以及VIII因子-相关多肽。术语“VIII因子”欲包括但不限于具有Toole等，Nature 1984(见上文)所述氨基酸序列(野生型人VIII因子)的多肽，以及得自其它物种的野生型VIII因子，例如牛、猪、犬、鼠和鲑鱼VIII因子。还包括可能在不同个体中出现和产生的VIII因子天然等位基因变异体。糖基化或其它翻译后修饰的水平和位置随着所选择的宿主细胞和宿主细胞环境特性的不同而不同。术语“VIII因子”也欲包括未裂解(酶原)形式的VIII因子多肽，以及经蛋白酶解加工，产生其各自的生物活性形式(被称为VIIIa因子)的VIII因子多肽。
“VIII因子-相关多肽”包括但不限于相对于人VIII因子而言已被化学修饰和/或相对于人VIII因子而言含有一个或多个氨基酸序列改变(即VIII因子变体)，和/或相对于人VIII因子而言含有截短的氨基酸序列(即VIII因子片段)的VIII因子多肽。所述VIII因子-相关多肽可表现出不同于人VIII因子的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。术语“VIII因子-相关多肽”欲包括未裂解(酶原)形式的多肽，以及经蛋白酶解加工，产生其各自的生物活性形式(被称为“VIIIa因子-相关多肽”或“活化的VIII因子-相关多肽”)的多肽。
本文所用“VIII因子-相关多肽”包括但不限于相对于野生型人VIII因子而言，表现出基本上相同或有所改良的生物活性的多肽，以及相对于野生型人VIII因子的活性而言，VIII因子生物活性实质上被修饰或降低的多肽。这些多肽包括但不限于经化学修饰的VIII因子或VIIIa因子以及导入了特定的氨基酸序列改变的VIII因子变体，所述改变可修饰或破坏多肽的生物活性。
所述多肽还包括氨基酸序列略有修饰的多肽，例如具有经修饰的N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽，和/或相对于人VIII因子而言已被化学修饰的多肽。
VIII因子-相关多肽，包括VIII因子变体，无论其与野生型VIII因子相比，表现出基本上相同或更好的生物活性，还是相对于野生型VIII因子而言表现出实质上被修饰或降低的生物活性，都包括但不限于因一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型VIII因子序列的氨基酸序列的多肽。
VIII因子-相关多肽，包括变体包括那些经本文说明书所述的VIII因子活性试验检测，可表现出至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约110％，至少约120％，和至少约130％在相同细胞类型中产生的野生型VIII因子的比活性的多肽。
相对于野生型VIII因子而言，具有基本上相同或有所改良的生物活性的VIII因子-相关多肽，包括变体包括那些经上文所述的一个或多个特定的VIII因子活性试验检测，可表现出至少约25％，优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约100％，更优选至少约110％，更优选至少约120％，最优选至少约130％在相同细胞类型中产生的野生型人VIII因子的特定生物活性的多肽。为了本发明的目的，可按照本说明书下文(“试验部分”)所描述的方法定量测定VIII因子生物活性。
相对于野生型VIII因子而言，具有实质上有所降低的生物活性的VIII因子-相关多肽，包括变体包括那些经上文所述的一个或多个特定的VIII因子活性试验检测，可表现出低于约25％，优选低于约10％，更优选低于约5％，最优选低于约1％在相同细胞类型中产生的野生型VIII因子的比活性的多肽。
VIII因子多肽的非限制性例子包括得自血浆的人VIII因子，其描述于例如Fulcher等；Proc.Acad.Nat.Sci.USA 1982；79：1648-1652和Rotblat等；Biochemistry 1985；24：4294-4300，以及得自血浆的猪FVIII，其描述于例如Fass等；Blood 1982；59：594-600和Knutson等；Blood 1982；59：615-624。
在一些实施方案中，VIII因子是VIII因子-相关多肽，其中，当在“生色试验”(参见下文)中检测时，所述VIII因子多肽活性和天然人VIII因子(野生型VIII因子)活性之间的比率至少约为1.25；在其它实施方案中，该比率至少约为2.0；在其它实施方案中，该比率至少约为4.0。
VIII因子序列变体的非限制性例子描述于例如Lollar等；Blood 2000；95(2)：564-568(杂合的猪/人FVIII多肽)和Lollar等；Blood 2001；97(1)：169-174。
可商购的FVIII产品(所谓的替代产品)得自正常的血浆收集物或经基因工程改造的哺乳动物细胞系。通常根据被定义为比活性(每mg蛋白质的凝血因子活性国际单位数，IU/mg)的最终纯度对替代产品进行分类。中间产品具有相对较低的比活性(＜50IU/mg)，因为它们也含有无关紧要的血浆蛋白质，如血纤蛋白原，纤连蛋白和其它非-促凝剂蛋白质。高纯度(＞50IU/mg)和超高纯度(＞3000IU/mg)除了添加有白蛋白作为稳定剂外，只含有很少或实质上不含其它的血浆蛋白质。
本发明可以使用的商购VIII因子产品(浓缩物及制品)的非限制性例子是，但不限于例如AHP/Genetics Institute的ReFacto(B结构域缺失的rFVIII)，Alpha的Alphanate(FVIII)，Aventis的Biocalte(rFVIII)，Aventis的Monoclate-P(VIII因子：C)，Aventis的Helixate(rFVIII)，Baxter的Recombinate(rFVIII)，Baxter的Hemofil M(FVIII)，Bayer的Kogenate(rFVIII)，HemaSure的Nordiate(FVIII)，Laboratoire Francais du Fractionnement et desBiotechnologies(LFB)的FACTEUR VIII-LFB(基于人血浆的FVIII)，Speywood的Hyate：C(猪FVIII)和Bayer的Kogenate SF(用蔗糖配制的rFVIII)。
高和超高活性产品的非限制性例子是Alphanate(Alpha)(低)；ReFacto(AHP/Genetics Institute)，Kogenate SF(Bayer)，Kogenate(Bayer)，Helixate(Aventis)，Recombinate(Baxter)，Monoclate-P(Aventis)，HemofilM(Baxter)(皆为超高纯度)。
定义：
在本发明的上下文中，按照下表1所示以常规方式使用氨基酸的三字母或单字母表示法。除非另有说明，本文所提及的氨基酸是L-氨基酸。例如，应理解K337的第一个字母表示天然存在于野生型VII因子的所示位置的氨基酸，例如，K337A-FVIIa表示FVII-变体，其中由天然存在于所示位置的单字母密码K表示的氨基酸被由单字母密码A表示的氨基酸所取代。
表1：氨基酸的简称 氨基酸 三字母密码 单字母密码 甘氨酸 Gly G 脯氨酸 Pro P 丙氨酸 Ala A 缬氨酸 Val V 亮氨酸 Leu L 异亮氨酸 Ile I 甲硫氨酸 Met M 半胱氨酸 Cys C 苯丙氨酸 Phe F 酪氨酸 Tyr Y 色氨酸 Trp W 组氨酸 His H 赖氨酸 Lys K 精氨酸 Arg R 谷氨酰胺 Gln Q 天冬酰胺 Asn N 谷氨酸 Glu E 天冬氨酸 Asp D
术语“VII因子”或“FVII”可以互换使用。术语“VIIa因子”或“FVIIa”可以互换使用。术语“VIII因子”或“FVIII”可以互换使用。
在本发明的上下文中，“凝血酶产生受损的受试者”指的是不能在活化的血小板表面产生充足凝血酶的受试者，并包括相对于具有功能完全的正常止血系统，包括具有正常的凝结因子、血小板和血纤蛋白原量和功能的受试者的凝血酶产生而言，产生的凝血酶较少的受试者，包括但不限于缺乏VIII因子的受试者；血小板数目减少或血小板功能有缺陷的受试者(例如血小板减少症或Glanzmann血小板机能不全或出血过多的受试者)；凝血酶原、FX或FVII水平下降的受试者；(例如，因创伤或大手术导致出血过多而使)几种凝结因子水平下降的受试者；和血纤蛋白原的血浆浓度有所降低的受试者(例如多次输血的受试者)。
术语“增强止血系统”指的是增强产生凝血酶的能力。术语“增强止血”欲包括下述情况，即当以相同的凝血酶产生试验进行检测时，相对于分别仅含有VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的对照样品各自的凝血酶产生而言，含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的受试样品的已测定的凝血酶产生有所延长。可以按照本说明书的凝血酶产生试验中的描述(见“试验部分”)检测凝血酶产生。
血块裂解时间、血块强度、血纤蛋白块形成和凝血时间是用于检测患者止血系统状况的临床参数。以适当的时间间隔从患者体内取血样，利用例如Meh等，Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001；12：627-637；Vig等，Hematology，Vol.6(3)pp.205-213(2001)；Vig等，Blood Coagulation &Fibrinolysis，Vol.12(7)pp.555-561(2001)Oct；Glidden等，Clinical and appliedthrombosis/hemostasis，Vol.6(4)pp.226-233(2000)Oct；McKenzie等，Cardiology，Vol.92(4)pp.240-247(1999)Apr；或Davis等，Journal of theAmerican Society of Nephrology，Vol.6(4)pp.1250-1255(1995)所述的凝血弹性描记法检测一个或多个参数。
术语“延长血块裂解时间”欲包括下述情况，即当以相同的血块裂解试验进行检测时，相对于分别仅含有VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的对照样品各自的血块裂解时间而言，含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的受试样品的已测定的血块裂解时间有所延长。可以按上述检测血块裂解时间。
术语“增加血块强度”欲包括下述情况，即当以相同的血块强度试验进行检测时，相对于分别仅含有VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的对照样品各自的血块裂解时间而言，含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的受试样品的已测定的血块强度，例如机械强度有所增加。可以按照例如Carr等，1991.(Carr ME，Zekert SL.Measurement of platelet-mediated fbrce developmentduring plasma clot formation.AM J MED SCI 1991；302：13-8)所述，或按上述通过凝血弹性描记法检测血块强度。
术语“增强血纤蛋白块形成”欲包括下述情况，即当以相同的凝血试验进行检测时，相对于分别仅含有VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的对照样品各自的血纤蛋白块形成的速率或水平而言，含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的受试样品的已测定的血纤蛋白块形成的速率或水平有所提高。可以按上述检测血纤蛋白块形成。
术语“缩短凝血时间”欲包括下述情况，即当以相同的凝血试验进行检测时，相对于分别仅含有VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的对照样品各自的凝血时间而言，含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的受试样品的已测定的凝血块形成时间(凝血时间)有所缩短。可通过本领域技术人员已知的标准PT og aPTT试验检测凝血时间。
本文所用术语“出血紊乱”反映了表现为出血发作的任何先天性、获得性或被诱导的、源于细胞或分子水平的缺陷。出血紊乱的例子包括但不限于：凝血因子缺乏症(例如缺乏凝结因子VIII、IX、XI或VII)，凝血因子抑制剂，血小板机能不全(例如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合征)，血小板减少症，遗传性假血友病，以及例如因出血和/或输血(例如遭遇手术或创伤故需多次输血的受试者)而使凝结蛋白被稀释，血纤蛋白溶解增加，血小板数目减少，从而导致的凝血病。
出血指的是血液从循环系统的任何组成部分中外渗。术语“出血发作”包括与手术，创伤或其它形式的组织损害相关联的不必要的，不受控制的和经常性的过度出血，以及患有出血紊乱的受试者的不必要的出血。出血发作可发生于凝血系统基本正常，但遭遇(暂时性)凝血病的受试者，以及患有先天性或获得性凝血或出血紊乱的受试者。在血小板机能不全的受试者中，出血可被看成是由血友病导致的出血，因为与血友病一样，止血系统缺乏或具有异常的必需凝血“化合物”(例如血小板或von Willebrand因子蛋白)。在遭遇深度组织损害，例如与手术或大创伤有关的损害的受试者中，相对于正常的止血机制而言，对立即止血的需求占据优势，尽管(创伤前或手术前)有基本正常的止血机制，这些受试者仍会过度出血。这些经常需要多次输血的受试者因出血和/或输血(例如因出血和/或输血而使凝结蛋白被稀释，血纤蛋白溶解增加，血小板数目减少)，会发展为(暂时性的)凝血病。出血也可发生在器官，例如脑，内耳区和眼部；这些是外科止血的可能性有限的区域，因此，成功止血成为一个难题。在从多个器官(肝脏、肺、肿瘤组织、胃肠道)取活检样品的过程中，以及在腹腔镜检查手术和根本性耻骨后前列腺切除术中也会产生类似的问题。所有这些情况的共同之处是通过手术技术(缝线、小夹子等)难以达到止血的目的，当出血扩散时(例如出血性胃炎和大量的子宫出血)，情况也是如此。出血也会发生于接受抗促凝剂疗法的受试者，这些受试者所接受的疗法诱导了止血缺陷；这些出血经常是急性的和过多的。给予抗促凝剂疗法经常是为了预防血栓栓塞性疾病。所述疗法可包括肝素，其它形式的蛋白聚糖，丙酮苄羟香豆素或其它形式的维生素K-拮抗剂以及阿斯匹林和其它血小板聚集抑制剂，例如抗体或其它GP IIb/IIIa活性抑制剂。出血发作还意味着包括但不限于与受试者的手术或创伤有关的不受控制的过度出血，所述受试者经历了急性关节积血(关节出血)、慢性嗜血性关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后血肿)、其它组织出血、血尿(肾管出血)、大脑出血、手术(例如肝切除)、拔牙和胃肠出血(例如UGI出血)。出血发作可能与抗VIII因子抑制剂；A型血友病；具有抑制剂的A型血友病；B型血友病；VII因子缺乏；XI因子缺乏；血小板减少；von Willebrand因子缺乏(遗传性假血友病)；严重的组织损害；严重的创伤；手术；腹腔镜检查手术；出血性胃炎；取活检样品；抗促凝剂疗法；上胃肠道出血(UGI)；或干细胞移植有关。出血发作可以是过多的子宫出血；发生于机械止血的可能性有限的器官中的出血；发生于脑部的出血；发生于内耳区的出血；或发生于眼的出血。术语“出血发作”和“出血”在适当时可以互换使用。
在此上下文中，术语“治疗”意味着包括预防可以预见的出血(例如手术中的出血)，以及调节已发生的出血(例如创伤出血)，目的是为了抑制出血或使出血量最少。以上提及的“可以预见的出血”可以是有望发生在特定组织或器官中的出血，或者是不确定的出血。因此，术语“治疗”包括预防性施用VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品。
本文所用术语“受试者”欲指任何动物，尤其是哺乳动物，如人，适当时可以与术语“患者”互换使用。
可以同时或依次施用本说明书中定义的VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽。可以以含有两种凝结因子的单剂量形式，或以含有VII因子或VII因子-相关多肽制品作为第一种单位剂量形式，含有VIII因子或VIII因子-相关多肽制品作为第二种单位剂量形式的由多部分组成的试剂盒的形式提供因子。第二种单位剂量形式可以是高-，中-或低-活性VIII因子产品形式。优选高-活性产品。最优选重组高-活性产品。不论何时，本说明书上下文中提及的第一或第二或第三等单位剂量都不表示给药的优选次序，这样做仅是为方便表述而已。
“同时”施用VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品指的是以单剂量形式施用凝结因子蛋白质，或先施用第一种凝结因子蛋白质，接着在不超过15分钟，优选10，更优选5，更优选2分钟的时间间隔之后施用第二种凝结因子蛋白质。可以先施用任一种因子。
“依次”施用指的是先施用第一种凝结因子蛋白质，接着在2小时，优选1至2小时，更优选1小时，更优选30分钟至1小时，更优选30分钟，更优选15至30分钟的时间间隔之后施用第二种凝结因子蛋白质。可以先施用两种单位剂量形式或凝结因子蛋白质中的任一种。优选通过相同的静脉内进入方式注射这两种产品。
“VIII因子水平”指的是与健康受试者水平相比较的患者VIII凝血因子活性水平。该水平被表示为正常水平的百分比。适当时，该术语可以互换使用。
“VIII因子水平降低”指的是与不具有凝结因子VIII缺陷或凝结因子VIII抑制剂的受试者群体的平均VIII水平相比，血流中VIII因子存在量或活性的降低。根据其从人血浆中的纯化情况看，正常成年人的VIII因子浓度约为100-200ng/毫升血浆(平均值)，相当于约0.1μM；也等于0.60-1.60U/ml。
在正常的健康个体中，VIII因子活性和抗原水平在60至160％于正常的血浆收集物之间变化。临床上，通过促凝剂或免疫学试验即可测定循环的VIII因子水平。通过患者血浆校正VIII因子-缺乏的血浆的凝血时间的能力测定VIII因子前促凝剂活性(例如APTT试验，参见下文；也可参见本说明书的“试验部分”)。
一个单位的VIII因子被定义为1毫升正常(收集的)人血浆中存在的VIII因子的量(相当于100％的VIII因子水平)。
一个单位的VII因子被定义为1毫升正常血浆中存在的VII因子的量，相当于约0.5μg蛋白质。活化后，50个单位相当于约1μg蛋白质。
“缺乏”指的是与正常健康个体相比，血浆中VIII因子的存在量或活性有所降低。适当时，该术语可与“VIII因子水平降低”互换使用。
“APTT”或“aPTT”指的是活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(描述于例如Proctor RR，Rapaport SI：The partial thromboplastin time with kaolin；a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiencies.Am JClin Pathol 36：212，1961)。
“VIII因子-反应性综合征”指的是给需要治疗的受试者施用外源性VIII因子即可预防、治愈或缓解由综合征引起的可预见的或已存在的任何症状、病症或疾病的综合征。包括但不限于由VIII因子水平降低引起的综合征，例如出血紊乱(例如但不限于A型血友病)或者由VIII因子抑制剂引起的综合征。
“VII因子-反应性综合征”指的是给需要治疗的受试者施用外源性VII因子，优选VIIa因子即可预防、治愈或缓解由综合征引起的可预见的或已存在的任何症状、病症或疾病的综合征。包括但不限于因凝血因子VIII，IX，XI或VII水平降低，凝血因子抑制剂，血小板机能不全(例如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合征)，血小板减少，遗传性假血友病和凝血病，例如(遭遇手术或创伤故需多次输血的受试者)因出血和/或输血而使凝结蛋白被稀释，血纤蛋白溶解增加，血小板数目减少所导致的凝血病而引起的综合征。
“半寿期”指的是VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆浓度从一个特定的值降低至该值的一半所需的时间。
“初级止血”指的是起初由FXa和TF：VIIa因子产生凝血酶，随后激活血小板，形成最初的由活化的粘附血小板构成的松散血栓，所述血栓尚未被血纤蛋白(最终被交联的血纤蛋白)稳定化。如果未被止血过程的第二个步骤(维持止血)所形成的血纤蛋白稳定化，血栓容易被纤溶系统溶解。
“次级止血”或“维持止血”指的是发生于活化的血小板表面、并由VIIIa因子和VIIIa因子催化的次级、完全和较多的凝血酶突增或产生，随后形成血纤蛋白，最初的血小板栓被稳定化。血纤蛋白对血栓的稳定化导致完全止血。
“完全止血”指的是在受伤部位形成稳定的固体血纤蛋白块或栓，它们能有效止血，并且不易被纤溶系统溶解。在本发明的上下文中，使用术语止血表示上述的完全止血。
本文所用凝结因子，如VIII因子的“制品”是VIII因子占绝对优势的制品。在一个实施方案中，凝结因子以占蛋白质总量20％(w/w)以上，更优选30％，更优选40％，更优选50％，更优选60％，更优选70％，更优选80％，更优选90％，更优选95％，更优选98％，更优选99％的量存在于制品中。
在优选的实施方案中，凝结因子以占凝结因子蛋白质总量50％(w/w)以上，更优选80％，更优选90％，更优选95％，更优选98％，更优选99％的量存在。
通过公知方法，例如通过测定光密度即可测定所述制品中蛋白质的总量。通过公知方法，例如标准的ELISA免疫测定法即可测定VIII因子凝结蛋白的量。一般说来，通过下述方法可进行这种试验，即：使含有VIII因子蛋白质的制品溶液与固定于ELISA板上的抗-FVIII抗体接触，随后使固定化的抗体-VIII因子复合物与携有标记的第二抗-FVIII抗体接触，第三步，可测定标记的量。可以使用适当的抗体，以类似的方法测定每种凝结因子的量。通过将每一种凝结因子蛋白质的量加在一起，即可测定制品中存在的凝结因子蛋白质的总量。在一个实施方案中，制品含有分离的凝结因子。在另一个实施方案中，制品不含凝结因子II和凝结因子IIa。
本文所用术语“分离的”指的是已从合成凝结因子的细胞，或凝结因子天然存在的介质(例如血浆或血液)中分离出来的凝结因子，例如VIII因子或VIII因子-相关多肽。可通过本领域已知的任何方法，从其来源细胞中分离多肽，所述方法包括但不限于：从贴壁细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以除去未-贴壁的细胞等。可通过本领域已知的任何方法，从其天然存在的介质中分离多肽，所述方法包括但不限于：亲和层析，如分别在抗-VII因子或抗-VIII因子抗体柱上进行的亲和层析；疏水作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳方法(例如制备性等电聚焦(IEF))，差别溶解性(例如硫酸铵沉淀)，或提取等。
缩写：
TF 组织因子
FVII 单链，未活化形式的VII因子
FVIIa 活化形式的VII因子
rFVIIa 活化形式的重组VII因子
VIII因子 酶原，未活化形式的VIII因子
VIIIa因子 活化形式的VIII因子
rFVIII 重组VIII因子
rFVIIIa 重组VIIIa因子
化合物的制备：
优选通过DNA重组技术，例如描述于Hagen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2412-2416，1986或欧洲专利号200,421(ZymoGenetics，Inc.)中的技术制备适用于本发明的纯化的人VIIa因子。
也可通过Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)：1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841，1983所述的方法制备VII因子。这些方法生产出VII因子，其中不含可测量的其它凝结因子。通过包括额外的凝胶过滤作为最终的纯化步骤，甚至可以获得进一步纯化的VII因子制品。然后通过已知方法，例如通过几种不同的血浆蛋白质，如XIIa、IXa或Xa因子，将VII因子转变为活化的VIIa因子。或者，按Bjoern等(ResearchDisclosure，269 September 1986，pp.564-565)所述，通过使VII因子流经离子交换层析柱，如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等而使其被活化。
通过修饰野生型VII因子或通过重组技术，可以生产VII因子-相关多肽。通过例如位点特异性诱变改变编码天然VII因子的核酸中的氨基酸密码子或除去其中的一些氨基酸密码子，即可修饰编码野生型VII因子的核酸序列，从而产生与野生型VII因子相比，氨基酸序列有所改变的VII因子-相关多肽。
本领域技术人员清楚地知道可在对VIIa因子或VIII因子-分子的功能无关紧要的区域进行取代，仍然会得到有活性的多肽。可根据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(参见例如Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)，鉴定出对VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子相关多肽的活性至关重要，因此优选不对其进行取代的氨基酸残基。在后一技术中，在分子中的每一个带正电的残基处导入突变，检测所得突变分子各自交联的促凝剂活性，以鉴定出对分子的活性至关重要的氨基酸残基。通过分析按照如核磁共振分析，晶体学或光亲和性标记(参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal ofMolecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)之类的技术测定的三维结构，也可以测定底物-酶相互作用的位点。
通过使用本领域已知的任何方法进行定点诱变，可以在核酸序列中导入突变以用一个核苷酸交换另一个核苷酸。特别有用的方法利用了含有所需插入物的超螺旋双链DNA载体和两个含有所需突变的合成引物。在温度循环过程中，各与载体的相反链互补的寡核苷酸引物利用pfu DNA聚合酶延伸。引物掺入之后，即可产生含有交错切口的突变质粒。温度循环之后，用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理产物，以消化亲代DNA模板并选择出含有突变的合成DNA。也可以使用本领域已知的其它产生、鉴定和分离变体的方法，例如基因改组或噬菌体展示技术。
可通过本领域已知的任何方法从其来源细胞中分离多肽，所述方法包括但不限于：从贴壁细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以除去未-贴壁的细胞等。
任选进一步纯化VII因子或VII因子-相关多肽。可以使用本领域已知的任何方法进行纯化，所述方法包括但不限于：亲和层析，如在抗-VII因子抗体柱上进行的亲和层析(参见例如Wakabayashi等，J.Biol.Chem.261：11097，1986；和Thim等，Biochem.27：7785，1988)；疏水作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳方法(例如制备性等电聚焦(IEF))，差别溶解性(例如硫酸铵沉淀)，或提取等。一般可参见Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；和Protein Purification，J.C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989。纯化后，优选制品含有低于约10％重量，更优选低于约5％，最优选低于约1％重量的得自宿主细胞的非-VII因子或VII因子相关多肽。
通过使用XIIa因子或其它具有胰蛋白酶样特异性的蛋白酶，例如IXa因子、激肽释放酶、Xa因子和凝血酶进行蛋白酶裂解，可以活化VII因子或VII因子-相关多肽。参见例如Osterud等，Biochem.11：2853(1972)；Thomas，美国专利号4,456,591；和Hedner等，J.Clin.Invest.71：1836(1983)。或者，通过使VII因子或VII因子-相关多肽流经离子交换层析柱，如MonoQ(Pharmacia)等而使其被活化。然后可按下文所述配制所得的活化VII因子或VII因子-相关多肽并给药。
可根据已知方法，从血浆中分离本发明中使用的VIII因子，所述方法公开于例如Fulcher等；Proc.Acad.Nat.Sci.USA 1982；79：1648-1652和Rotblat等；Biochemistry 1985；24：4294-4300。然而，优选使用重组VIII因子以避免使用存在传播疾病之风险的源自血液或组织的产品。优选通过DNA重组技术制备适用于本发明的纯化的人VIII因子，所述技术描述于例如美国专利号4757006和4965199。
通过修饰野生型VIII因子或通过重组技术，可以生产VIII因子-相关多肽。通过已知方法，例如上文详细描述的位点特异性诱变改变编码天然VIII因子的核酸中的氨基酸密码子或除去其中的一些氨基酸密码子，即可修饰编码野生型VIII因子的核酸序列，从而产生与野生型VIII因子相比，氨基酸序列有所改变的VIII因子-相关多肽。可通过本领域已知的任何方法从其来源细胞中分离多肽，所述方法包括但不限于：从贴壁细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以除去未-贴壁的细胞等。任选进一步纯化VIII因子或VIII因子-相关多肽。可以使用本领域已知的任何方法进行纯化，所述方法包括但不限于上文详细描述的亲和层析，如在抗-VIII因子抗体柱上进行的亲和层析；疏水作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳方法(例如制备性等电聚焦(IEF))，差别溶解性(例如硫酸铵沉淀)，或提取等。纯化后，优选制品含有低于约10％重量，更优选低于约5％，最优选低于约1％重量的得自宿主细胞的非-VIII因子或VIII因子相关多肽。然后可按下文所述配制所得的活化VIII因子或VIII因子-相关多肽并给药。
本领域技术人员懂得：优选使用与受试者同源的VIII因子多肽和VII因子多肽，以降低诱导免疫应答的风险。非人VIII因子的制备和鉴定描述于例如Fass等，Blood 1982，59：594-600。本发明还包括在兽医方法中使用所述VIII因子多肽和VII因子多肽。
药物组合物和使用方法
可以使用本发明的制品治疗任何VIII因子反应性综合征，例如出血紊乱，包括但不限于因缺乏凝血因子(如A型血友病)或由(低或中等滴度的)VIII因子抑制剂所导致的疾病。
可以使用本发明的制品治疗任何VII因子反应性综合征，例如出血紊乱，包括但不限于因凝血因子VIII，IX，XI或VII水平降低，凝血因子抑制剂，血小板机能不全(例如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合征)，血小板减少，遗传性假血友病和凝血病，例如(遭遇手术或创伤故需多次输血的受试者)因出血和/或输血而使凝结蛋白被稀释，血纤蛋白溶解增加，血小板数目减少所导致的凝血病而引起的综合征。
主要打算将含有本发明的VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的药物组合物供非肠道给药使用，以进行预防和/或治疗性治疗。优选非肠道施用药物组合物，即静脉内、皮下或肌内给药；最优选静脉内给药。也可以通过连续或脉冲式灌注给药。
本发明的药物组合物或制剂含有混合于，优选溶解于药物可接受载体，优选为含水载体或稀释剂中的VII因子或VII因子-相关多肽制品的制品，或VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的制品，或VII因子或VII因子-相关多肽制品的制品与VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的制品的组合物。可以使用多种含水载体，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可以使用不含水的载体，例如凝胶形式或脂质体制品形式配制本发明的制品，以传递或靶向至受伤部位。脂质体制品一般描述于例如美国专利号4837028，4501728和4975282。可通过常规的众所周知的灭菌技术对组合物进行灭菌。将所得的水溶液包装待用或在无菌条件下过滤并冻干，给药前将冻干制品与无菌水溶液混合。
组合物可含有药物可接受的辅助物质或佐剂，包括但不限于pH调节和缓冲剂和/或张力调节剂，例如醋酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙等。
制剂可进一步包括一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲液、赋形剂等，可以以液体、粉末、乳剂、控释等方式提供制剂。本领域技术人员可以按照公认的常规作法，例如描述于Remington’s PharmaceuticalSciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990的方法，以适当的方式配制本发明的组合物。因此，可以制备静脉内灌注所用的典型药物组合物，使其含有250ml无菌的Ringer’s溶液和10mg制品。
可以施用含有本发明制品的组合物以进行预防和/或治疗性治疗。在治疗应用中，可按上文所述，以足以治愈、缓解或部分终止疾病及其并发症的临床表现的量给已患病的受试者施用组合物。将足以达到此目的的量定义为“治疗有效量”。针对每个目的的有效量取决于疾病或创伤的严重程度，以及受试者的体重和一般状况。应懂得通过构建数值矩阵并检测矩阵中的不同点，使用常规实验即可测定适当的剂量。
例如，利用喷雾、灌注、双球囊导管、掺入血管移植物的一个或多个斯滕特氏印模、用于包被球囊导管的水凝胶，或其它已成熟建立的方法可以进行本发明制品的局部传递，例如局部应用。在任何事件中，药物组合物应该提供足以有效治疗疾病的大量制品。
在这些配制品中，VII因子或VII因子-相关多肽，VIII因子或VIII因子-相关多肽，或VII因子或VII因子-相关多肽与VIII因子或VIII因子-相关多肽的组合物的浓度可以有很大的不同，即从低于约0.5％重量，通常为或至少约为1％重量至高达15或20％重量，主要根据所选择的特定给药模式，液体的体积，粘度等选择所述浓度。优选通过注射或灌注，特别是注射进行给药。因此，以适于静脉内给药的方式制备VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽，例如制备成含有VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽的单剂量形式的可溶解冻干粉末或液体制剂制品，或制备成含有VII因子或VII因子-相关多肽的单剂量形式的可溶解冻干粉末或液体制剂制品，以及含有VIII因子或VIII因子-相关多肽的另一剂量形式的可溶解冻干粉末或液体制剂制品。
应理解VII因子或VII因子-相关多肽的量和VIII因子或VIII因子-相关多肽的量合起来含有可用于治疗出血发作的集合有效量。
必须记住本发明的物质一般用于严重的疾病或创伤，即威胁生命或对生命有潜在威胁的状况。在这种情况下，考虑到外来物质的最少化以及人一般缺乏VIIa因子和VIII因子的免疫原性，可以，并且治疗医生也认为需要施用实质上过量的这些组合物。
在预防性的应用中，给容易患病或要不然有患病或受伤风险的受试者施用含有VII因子或VII因子-相关多肽制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的组合物，以增强受试者自身的凝血能力。所述量被定义为“预防有效剂量”。应理解VII因子或VII因子-相关多肽的量和VIII因子或VIII因子-相关多肽的量合起来含有可用于预防出血发作的集合有效量。
可根据治疗医生选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次给药。每天或每周可以单次或多次施用组合物。所述药物组合物的有效量是能提供抗出血发作的显著临床效果的量。所述量部分取决于受试者欲治疗的特定病症、年龄、体重和一般健康状况以及本领域技术人员熟知的其它因素。
一般在预期的出血之前或在开始出血时以单剂量施用本发明的组合物。然而，也可以重复(以多剂量)给药，优选的时间间隔为2-4-6-12小时，这取决于给药剂量和受试者的病情。
为了进行与审慎的干预相关联的治疗，一般在进行干预之前的约24小时内施用VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽，随后持续给药多达7天或更长时间。可通过本文描述的多种途径施用促凝剂。
组合物可以是单个制品的形式(单-剂量形式)，其含有适当浓度的VII因子或VII因子-相关多肽制品的制品和VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的制品。组合物也可以是由多部分组成的试剂盒的形式，所述试剂盒由第一种单位剂量形式和第二种单位剂量形式组成，前者含有VII因子或VII因子-相关多肽制品的制品，后者含有VIII因子或VIII因子-相关多肽制品的制品。在此情况下，VII因子或VII因子-相关多肽和VIII因子或VIII因子-相关多肽应该依次给药，优选彼此间隔约15分钟，例如彼此间隔10分钟，或优选间隔5分钟，或更优选彼此间隔2分钟。可以先施用两种单位剂量形式中的任一种。
试剂盒包括至少两种独立的药物组合物。试剂盒包括盛装独立组合物的容器，例如分开的瓶子或分开的小包装袋。试剂盒一般包括施用独立成分的说明书。当优选以不同的剂量形式施用独立的组分，以不同的剂量间隔施用独立的组分时，或当开处方的医生需要滴定组合物中的各个组分时，试剂盒形式特别有利。
根据本发明施用的VII因子或VII因子-相关多肽的量和VIII因子或VIII因子-相关多肽的量的比例在约1∶100至约100∶1(w/w)之间变化。因此，VII因子与VIII因子的比例是例如约1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1，或在约1∶90至约1∶1之间，或在约1∶80至约1∶2之间，或在约1∶70至约1∶5之间，或在约1∶60至约1∶10之间，或在约1∶50至约1∶25之间，或在约1∶40至约1∶30之间，或在约90∶1至约1∶1之间，或在约80∶1至约2∶1之间，或在约70∶1至约5∶1之间，或在约60∶1至约10∶1之间，或在约50∶1至约25∶1之间，或在约40∶1至约30∶1之间。
就70-kg受试者的荷载和维持剂量而言，VII因子或VII因子-相关多肽的剂量范围对应于约0.05mg至约500mg/天的野生型VII因子，例如约1mg至约200mg/天，或例如约5mg至约175mg/天，具体剂量取决于受试者的体重、病症和病症的严重程度。
就70-kg受试者的荷载和维持剂量而言，VIII因子或VIII因子-相关多肽的剂量范围对应于约0.01mg至约500mg/天的野生型VIII因子，例如约1mg至约200mg/天，或例如约5mg至约175mg/天，具体剂量取决于受试者的体重、病症和病症的严重程度。
当治疗VIII因子水平降低的受试者时，优选以下剂量：
当所给剂量使VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆活性水平达正常VIII因子活性的10％时：
优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：15-300微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：30-250微克/kg体重
最优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：60-180微克/kg体重
当所给剂量使VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆活性水平达正常VIII因子活性的30％时：
优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：15-300微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：30-250微克/kg体重
最优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：60-180微克/kg体重
当所给剂量使VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆活性水平达正常VIII因子活性的50％时：
优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：15-300微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：30-250微克/kg体重
最优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：60-180微克/kg体重
当所给剂量使VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆活性水平达正常VIII因子活性的80％时：
优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：5-300微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：10-180微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：30-120微克/kg体重
最优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：60-120微克/kg体重
当所给剂量使VIII因子或VIII因子-相关多肽的血浆活性水平达正常VIII因子活性的100％时：
优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：5-300微克/kg体重
更优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：10-180微克/kg体重
最优选VII因子或VII因子-相关多肽水平：60-120微克/kg体重
通过假定每kg体重1个单位的FVIII替代使血浆活性提高约0.02U/ml(2％)，即可计算出剂量。通过以适当的间隔取出血液样品并分析VIII因子活性，可以监测患者的VIII因子水平(见上文说明书)。
检测法：
VIIa因子活性试验：
可以以简单的初步体外试验进行检测VIIa因子活性从而选择出适当的VIIa因子变体的适当检测法：
体外水解试验
可以检测天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子变体(下文皆称为“VIIa因子”)的比活性。也可以平行地进行检测以直接比较它们的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行试验。将终浓度为1mM的生色底物D-Ile-Pro-Arg-p-硝基酰苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到含VIIa因子(终浓度为100nM)，0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的5 0mM Hepes，pH7.4中。在SpectraMaxTM340平板读数仪(Molecular Devices，USA)中连续测定405nm下的光吸收值。用20分钟保温过程中产生的光吸收值减去不含酶的空白孔中的光吸收值，得数用于计算变体和野生型VIIa因子活性之间的比率：
比率＝(A405nmVIIa因子变体)/(A405nmVIIa因子野生型)
基于此，可以鉴定出活性约等于或高于天然VIIa因子的VIIa因子变体，例如变体活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之间的比率约等于对大于1.0的变体。
也可以使用适当浓度为100-1000nM的生理底物，如X因子测定VIIa因子或VIIa因子变体的活性，其中在加入适当的生色底物(如S-2765)之后测定所产生的Xa因子。另外，在生理温度下进行活性试验。
体外蛋白酶解试验
可以平行检测天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子变体(下文皆称为“VIIa因子”)以直接比较它们的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行试验。将100μl含有VIIa因子(10nM)和X因子(0.8μM)，0.1M NaCl，5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4保温15分钟。然后加入50μl含有0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHepes，pH7.4以终止X因子裂解。通过加入终浓度为0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基酰苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)，测定所产生的Xa因子的量。在SpectraMaxTM340平板读数仪(Molecular Devices，USA)中连续测定405nm下的光吸收值。用10分钟内产生的光吸收值减去不含FVIIa的空白孔中的光吸收值，得数用于计算变体和野生型VIIa因子蛋白酶解活性之间的比率：
比率＝(A405nm VIIa因子变体)/(A405nm VIIa因子野生型)
基于此，可以鉴定出活性约等于或高于天然VIIa因子的VIIa因子变体，例如变体活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之间的比率约等于对大于1.0的变体。
凝血酶产生试验：
可在含有具有生理浓度的所有相关凝结因子和抑制剂以及活化的血小板的试验中，测定VII因子或VII因子-相关多肽或VIII因子或VIII因子-相关多肽(例如变体)产生凝血酶的能力(如Monroe等(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中的第543页所述，列入本文作为参考)。
VIII因子活性试验：
可以以例如Kirkwood TBL，Rizza CR，Snape TJ，Rhymes IL，Austen DEG，Identification of sources of interlaboratory variation in factor VII assay.B JHaematol 1981；37；559-68；或Kessels等，British Journal of Haematology，Vol.76(Suppl.1)pp.16(1990)所述的简单的体外试验进行适当的检测法，用于检测VIII因子活性从而提供选择适当的VIII因子变体以用于本发明的方法。也可以通过基于所产生的FXa的酰胺裂解活性的两-步生色试验来测定VIII因子活性(Wagenvoord等，1989，Haemostasis，19(4)：196-204)(“生色试验”)。
也可以按照例如Nilsson等，1959(Nilsson IM，Blombaeck M，Thilen A，von Francken I.，Carriers of haemophilia A-A laboratory study，Acta Med Scan1959；165：357)所述，通过测定制品校正缺乏VIII因子的血浆的凝血时间的能力，来定量测定VIII因子的生物活性。在此试验中，生物活性被表示为单位/ml血浆(1个单位相当于正常的血浆收集物中存在的FVIII的量)。
本发明的方面：
一方面，本发明涉及药物组合物，其含有FVII多肽和FVIII多肽作为仅有的有活性的凝结因子。在一个实施方案中，FVII多肽是人重组FVIIa。在一个实施方案中，FVIII多肽是人重组FVIII。在一个实施方案中，FVII多肽和FVIII多肽被混合使用。在一个实施方案中，FVII多肽和FVIII多肽被放置在独立的容器中。在一个实施方案中，组合物供家庭治疗用。
另一方面，本发明涉及用于治疗出血发作的试剂盒，其含有
a)第一种单位剂量形式的有效量的FVII多肽，以及任选还含有药物可接受载体；
b)第二种单位剂量形式的有效量的FVIII多肽，以及任选还含有药物可接受载体；和
c)含有所述第一和第二种剂量形式的容器。
在一个实施方案中，FVII多肽是人重组FVIIa。在一个实施方案中，FVIII多肽是人重组FVIII。在一个实施方案中，试剂盒供家庭治疗用。另一方面，本发明涉及FVII多肽和FVIII多肽用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗患有FVIII反应性综合征的受试者的出血。另一方面，本发明涉及FVII多肽和FVIII多肽用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗FVIII水平降低的受试者的出血。在一个实施方案中，所述药物可治疗A型血友病患者的出血发作。在一个实施方案中，所述药物含有FVII多肽和FVIII多肽的混合物。在一个实施方案中，以含有FVII多肽的第一种剂量形式和含有FVIII多肽的第二种剂量形式制备药物。在一个实施方案中，FVII多肽是人重组FVIIa。在一个实施方案中，FVIII多肽是人重组FVIII。
另一方面，本发明涉及与用FVIII作为唯一的凝结蛋白质来治疗患有FVIII反应性综合征的受试者时相比，能增强所述受试者的止血能力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与用FVIII作为唯一的凝结蛋白质来治疗FVIII水平有所降低的受试者时相比，能增强所述受试者的止血能力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与用FVIII作为唯一的凝结蛋白质来治疗患有FVIII反应性综合征的受试者时相比，能增强所述受试者的凝血酶形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与用FVIII作为唯一的凝结蛋白质来治疗FVIII水平有所降低的受试者时相比，能增强所述受试者的凝血酶形成的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与以FVIII作为唯一的凝结蛋白质施用给患有FVIII反应性综合征的受试者时所需的给药次数相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药次数的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与以FVIII作为唯一的凝结蛋白质施用给FVIII水平有所降低的受试者时所需的给药次数相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药次数的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与以FVIII作为唯一的凝结蛋白质施用给患有FVIII反应性综合征的受试者时所需的给药量相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药量的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及与以FVIII作为唯一的凝结蛋白质施用给FVIII水平有所降低的受试者时所需的给药量相比，能减少所述受试者完成止血所需的凝结因子蛋白质给药量的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和有效量的FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及治疗患有FVIII反应性综合征的受试者的出血的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和FVIII多肽。
另一方面，本发明涉及治疗FVIII水平降低的受试者的出血的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的FVII多肽和FVIII多肽。
在所述方法的一个实施方案中，FVII多肽是人重组FVIIa。在一个实施方案中，FVIII多肽是人重组FVIII。在一个实施方案中，受试者患有A型血友病。
以下将通过实施例进一步阐明本发明，然而，这些实施例并不能限制保护范围。上述描述和下述实施例中公开的特征独立地、和以任何组合形式成为以多种多样的方式了解本发明的素材。
实施例
实施例1：体内治疗颅内出血的血友病患者
当用商购的FVIII产品治疗遭遇颅内出血的不含抑制剂的A型血友病患者时，一般需要10至20次FVIII注射或灌注才能使其止血。FVIII灌注欲使最初的FVIII血浆浓度至少为正常水平的80％，接着使血浆浓度为50％达一周。
用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同时给药的FVIII产品治疗所述患者，或间隔一段时间，如5分钟，依次用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark)和FVIII产品治疗所述患者。通过相同的静脉内入口注射这两种产品。患者止血所需的时间减少，维持止血所需的注射次数减少。该治疗方案导致止血所用的凝结因子蛋白质的总量减少。
实施例2：体内治疗伴有区室综合征出血的血友病患者
该患者是不含-抑制剂的A型血友病患者，因外部创伤而遭遇右上肢区室综合征出血。当用商购的FVIII产品治疗该患者时，一般需要20至40次FVIII注射或灌注才能获得常与急诊手术相关联的止血。FVIII灌注欲使最初的FVIII血浆浓度至少为80至100％，接着使血浆浓度为50％达1至2周。
用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同时给药的FVIII产品治疗所述患者，或间隔一段时间，如5分钟，依次用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FVIII产品治疗所述患者。通过相同的静脉内入口注射这两种产品。患者止血所需的时间减少，维持止血所需的注射次数减少。该治疗方案导致止血所用的凝结因子蛋白质的总量减少。
就在手术之前，再施用重复剂量的FVIIa与FVIII的组合。
实施例3：体内治疗上胃肠道出血的血友病患者
该患者是不含-抑制剂的A型血友病患者，因使用NSAID(非类固醇抗炎症药物)而继发胃肠出血。当用商购的FVIII产品治疗该患者时，一般需要20至40次FVIII注射或灌注才能获得常与急诊胃镜检查相关联的止血。
FVIII灌注欲使最初的FVIII血浆浓度至少为80至100％，接着使血浆浓度为50％达5至10天。
用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同时给药的FVIII产品治疗所述患者，或间隔一段时间，如5分钟，依次用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FVIII产品治疗所述患者。通过相同的静脉内入口注射这两种产品。患者止血所需的时间减少，维持止血所需的注射次数减少。该治疗方案导致止血所用的凝结因子蛋白质的总量减少。
就在胃镜检查之前，再施用重复剂量的FVIIa与FVIII的组合。
实施例4：体内治疗伴有弥散性出血的多次接受输注的受伤患者
该患者因外部创伤而遭遇弥散性出血。在出现弥散性出血病症之前，该患者已接受了大量静脉内注射液体、胶体灌注产品、白蛋白和红血细胞浓缩物的治疗。多次输注的临床状态的特征在于血小板数目低，血纤蛋白原和FVIII的浓度低。
治疗包括输入血小板、新鲜的冷冻血浆和FVIII产品。FVIII灌注欲达到正常水平的至少80％，并持续至已消除弥散性出血。
用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同时给药的FVIII产品治疗所述患者，或间隔一段时间，如5分钟，依次用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FVIII产品治疗所述患者。通过相同的静脉内入口注射这两种产品。患者止住多个出血点的出血所需的时间减少，维持止血所需的注射次数减少。该治疗方案导致止血所用的凝结因子蛋白质的总量减少，并能改善存活。
就在手术或侵害性操作之前，再施用重复剂量的FVIIa与FVIII的组合。
实施例5：检测不含-抑制剂的A型血友病患者的凝血状况
该患者是遭遇出血，例如颅内出血的不含-抑制剂的A型血友病患者。
当用商购的FVIII产品治疗该患者时，一般需要10至20次FVIII注射或灌注才能使其止血。FVIII灌注欲使最初的FVIII血浆浓度至少为正常水平的80％，接着使血浆浓度为50％达一周。体内试验
用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和同时给药的FVIII产品治疗所述患者，或间隔一段时间，如5分钟，依次用1个剂量，即90-180μg/kg体重的NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)和FVIII产品治疗所述患者。通过相同的静脉内入口注射这两种产品。施用两种凝结蛋白质中的后一种之后10分钟，取血样，使用临床上与凝血状况相关的标准化试验，即凝血弹性描记法进行全血凝结分析(参见例如Meh等，BLOOD COAGULATION&FIBRINOLYSIS 2001；12：627-637)。使用读自该试验的标准参数，阐明了增强的血纤蛋白块形成；增加的血块强度和延长的血块裂解时间。连续血样的检测结果阐明了在注射VII因子和VIII因子产品之后，作为时间的函数存在的这些参数的变化。
实施例6：用VIIa因子和VIII因子的组合缩短凝血时间
方法：
凝血试验：按现有的描述(Persson等，J Biol Chem 276：29195-9，2001)，在一-步骤试验中测定缺乏或存在多种浓度的血浆纯化的人VIII因子(FVIII)时，重组人凝结因子VIIa(rFVIIa)的特定凝血活性。简单地说，将包含在50mM Pipes，100mM NaCl，2mM EDTA，1％BSA，pH7.2中的(55μl)rFVIIa等分试样(0.2-3μg/ml，Novo Nordisk贮存物)与等体积的缓冲液混合，所述缓冲液含有50mM CaCl2和磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸载体(总磷脂浓度100μM；80％磷脂酰胆碱/20％磷脂酰丝氨酸)，通过加入55μl添加有多种浓度的FVIII(10，50和80％血浆浓度，Haematologic Technologies)的缺乏FVIII的血浆(Helena Labs Helena Labs#5793)以开始凝血过程。使用标准的APTT方法，在ACL 300 Research凝血检测仪(Instrumentation Laboratory，Milan，Italy)中持续凝血400秒。
结果：
凝血试验：在缺乏FVIII的血浆中分开和组合地添加rFVIIa和FVIII，测定凝血时间。在加入rFVIIa/FVIII之前，两种血浆的凝血时间都长于400秒的监测时间。图1和2分别显示了当缺乏FVIII的和正常的人血浆中缺乏和存在FVIII时，rFVIIa的缩短凝血时间的效果。
结论：
这些结果表明：rFVIIa和FVIII的组合能缩短缺乏FVIII和正常血浆的凝血时间，其效果优于分开添加蛋白质时所观察到的效果。