葡糖胺和葡糖胺/抗炎互联体前药、组合物和方法.pdf

提供了葡糖胺、葡糖胺的衍生物和类似物与抗炎药的互联体前药、其组合物和例如通过给予所述组合物治疗障碍和病症的方法。还提供了葡糖胺和葡糖胺的衍生物和类似物的局部用组合物。

1.  包括与第二种成分共价连接的第一种成分的化合物，所述的化合物具有通式I：

其中：
R¹、R²、R³和R⁴彼此独立地为H或有机基团；
L为任选的连接基；和
X为抗炎药。

2.  权利要求1所述的化合物，其中所述的抗炎药选自非甾体抗炎药和非甾体抗炎药的衍生物。

3.  权利要求2所述的化合物，其中所述的非甾体抗炎药选自二氟尼柳、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、双水杨酯、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、葡美辛、舒林酸、托美丁、非诺洛芬、布洛芬、酮洛芬、萘普生、奥沙普秦、氟比洛芬、甲芬那酸、甲氯芬那酸盐、保泰松、吡罗昔康、美洛昔康、萘丁美酮、吡洛芬、吲哚布芬、噻洛芬酸、对乙酰氨基酚、卡洛芬、依托芬那酯、替诺昔康、水杨酸胆碱镁、水杨酸胆碱、非诺洛芬钙、吲哚洛芬、酮咯酸、酮咯酸氨丁三醇、水杨酸镁、甲氯芬那酸钠、水杨酸钠、氯诺昔康、尼美舒利、remifenzone、氟舒胺、罗非考昔、塞来考昔和伐地考昔。

4.  权利要求1所述的化合物，其中所述的抗炎药选自前列腺素、花生四烯酸和花生四烯酸的代谢物。

5.  前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L如果存在，为有机基团。

6.  前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述的第一种成分选自葡糖胺、葡糖胺五乙酸盐、葡糖胺-1-磷酸、葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰基-β-D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰基-葡糖胺-1-磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖、2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖的乙酰化类似物、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐的乙酰化类似物和N-乙酰基-葡糖胺。

7.  药物组合物，包括治疗有效量的至少一种前述权利要求任一项的化合物和药物上可接受的载体。

8.  权利要求7所述的药物组合物，进一步包括一种或多种额外的成分，它们选自抗微生物剂、胶凝剂、乳化剂、硬化剂、皮肤愈合剂、软化剂、表面活性剂、溶剂、润滑剂、蜡、保湿剂、皮肤渗透增强剂、抗氧化剂及其组合。

9.  权利要求8所述的药物组合物，其中所述的抗微生物剂选自乙醇、对羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸酯的盐、山梨酸、山梨酸钾、丙二醇、甘油及其组合。

10.  权利要求8所述的药物组合物，其中所述的皮肤愈合剂选自维生素E、抗坏血酸、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、芦荟、维生素E-TPGS及其组合。

11.  权利要求8所述的药物组合物，其中所述的乳化剂选自胆固醇、泊洛沙姆、卵磷脂、卡波姆、聚氧乙烯醚类、脂肪酸酯类、硬脂酸酯类及其组合。

12.  权利要求8所述的药物组合物，其中所述的皮肤渗透增强剂选自二甲亚砜、乙醇、聚乙二醇、脲、二甲基乙酰胺、十二烷基硫酸钠、司盘类、吐温类、萜烯类、月桂氮酮、丙酮、油酸及其组合。

13.  权利要求8所述的药物组合物，其中所述的抗氧化剂选自富马酸、苹果酸、棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚、棓酸丙酯、抗坏血酸钠、偏亚硫酸氢钠及其组合。

14.  权利要求7-13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于局部施用。

15.  权利要求14所述的药物组合物，其中载体选自软膏剂、凝胶、霜剂、溶液、洗剂、混悬液、微乳、乳剂、脂质体或透皮贴剂。

16.  权利要求7-13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于皮下、肌内或静脉内给药。

17.  权利要求7-13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服给药。

18.  权利要求7-17中任一项所述的药物组合物，其中第一种成分在所述组合物中的存在量为约1重量％-约75重量％。

19.  药物组合物，其包括治疗有效量的具有通式II的化合物：

其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵彼此独立地为H或有机基团；和
药物上可接受的载体；
其中所述组合物被配制用于局部施用。

20.  权利要求19所述的药物组合物，进一步包括至少一种抗炎药。

21.  权利要求19或20所述的药物组合物，其中载体选自软膏剂、凝胶、霜剂、溶液、洗剂、混悬液、微乳、乳剂、脂质体或透皮贴剂。

22.  治疗或预防哺乳动物障碍或障碍的方法，该方法包括对哺乳动物给予治疗有效量的权利要求7-21中任一项的组合物。

23.  权利要求22所述的方法，其中所述的障碍或障碍选自关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、肌肉扭伤、肌肉劳损、关节扭伤、关节劳损、腱炎、滑囊炎、灼伤、关节痛、关节发炎、皮肤损伤、皮肤触痛、皮肤疼痛、日光损伤的皮肤、风损伤的皮肤、盐损伤的皮肤、瘢痕组织、与年龄相关的皮肤皱纹及其组合。

24.  权利要求22或23所述的方法，其中治疗障碍或障碍包括缓解所述障碍的至少一种症状。

25.  权利要求22-24中任一项所述的方法，其中给予组合物包括局部给药。

26.  权利要求25所述的方法，其中所述组合物被配制用作化妆品。

27.  权利要求22-25中任一项所述的方法，其中给予组合物包括皮下、肌内或静脉内给药。

28.  权利要求22-25中任一项所述的方法，其中给予组合物包括口服给药。

29.  权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述的哺乳动物为人。

30.  药物组合物，其包括治疗有效量的具有通式II的化合物：

其中：
R¹、R²、R³和R⁴各自为H，且
R⁵为乙酰基；和
药物上可接受的载体；
其中所述组合物被配制用于局部施用。

31.  权利要求30所述的药物组合物，进一步包括抗炎药。

32.  药物组合物，其包括治疗有效量的化合物，该化合物包括与第二种成分共价连接的第一种成分，所述的化合物具有通式I：

其中：
R¹、R²、R³和R⁴各自为H；
L为乙酰基；且
X为布洛芬或酮洛芬；和
药物上可接受的载体；
所述组合物被配制用于局部施用。

33.  缓解可用葡糖胺治疗的障碍的方法，其包括给予哺乳动物有效量的化合物，该化合物包括与第二种成分共价连接的第一种成分，所述的化合物具有通式I：

其中：
R¹、R²、R³和R⁴彼此独立地为H或有机基团；
L为任选的连接基；且
X为抗炎药。

34.  缓解可用抗炎药治疗的障碍的方法，其包括给予哺乳动物有效量的化合物，该化合物包括与第二种成分共价连接的第一种成分，所述的化合物具有通式I：

其中：
R¹、R²、R³和R⁴彼此独立为H或有机基团；
L为任选的连接基；且
X为抗炎药。

葡糖胺和葡糖胺/抗炎互联体前药、组合物和方法
本申请要求2004年4月7日提交的美国临时申请US60/560,128的利益，将该文献完整地引入本文作为参考。
政府权利的声明
本发明在政府支持下使用National Institutes of Health授予的Grant GM066321-01进行。政府可以拥有本发明中的某些权利。
发明背景
仅在美国估计有2100万成年人患有骨关节炎，它是最常见的关节炎类型之一。骨关节炎，也称作变性关节病因软骨，即垫在关节内骨末端的结缔组织破坏所致。骨关节炎的特征在于疼痛、关节损伤和关节活动受限。这种障碍一般在患者生命的晚期发生，并且最常见的是影响手和较大的承重关节。另外，年龄、性别(女性)和肥胖是这种障碍的危险因素。
研究人员已经发现在变性软骨中，促炎细胞因子，诸如IL-1β和TNFα与软骨基质降解增加有关(Sandy等 Biochem.J.，335：59-66(1998)；Séguin等J.Cell Physiol.，197：356-369(2003))。这些情况还与体外软骨基质基因表达和合成减少有关(Gouze等FEBS Letters，510：166-170(2002)；Shikhman等J.Immunol.，166：5155-5160(2001))。
在软骨和结缔组织中天然存在的氨基单糖葡糖胺对这些组织的强度、柔韧性和弹性提供维持。葡糖胺为用于形成和修复软骨的糖胺聚糖分子的前体。在体内，葡糖胺一般被转化成N-乙酰葡糖胺。近年来，葡糖胺已经广泛用于治疗人和动物模型中的骨关节炎症状，从而在减轻关节肿胀和疼痛水平方面具有与使用非甾体抗炎药(NSAID)观察到的相差无几的抗炎能力(Lopes，Curr.Med.Res.Opin.，8：145-149(1982)；Muller-Fassbender等，Osteoarthritis Cartilage，2：61-69(1994)；Ruane等，Br.J.Community Nurs.，7：148-152(2002))。有些人还推断葡糖胺可以抵消IL-1β对蛋白多糖合成具有的降解作用(Sandy等，Biochem J.，335：59-66(1998)；Gouze等，FEBS Letters，510：166-170(2002))，因为葡糖胺可以减少IL-1β和TNFα诱导的氧化亚氮产生(Shikhman等，J.Immunol.，166：5155-5160(2001))并且抑制人软骨细胞应答IL-1B的环加氧酶-2(COX-2)的合成(Largo等，Osteoarthritis Cartilage，11：290-298(2003))。因此，葡糖胺还可以用于控制与软骨组织变性相关的障碍，诸如骨关节炎。
在Jason Theodasakis，MD等的The Arthritis Cure一书(St.Martin′s Press.New York，NY.1997)中被描述后，葡糖胺已经得到普遍应用。在1997-2002年间，葡糖胺的年度市场增长率已经超过了36.4％(Chemical Market Reporter，vol.264(1)，2003年7月14日)。目前，并未将葡糖胺及其代谢物分类为药物，而是作为美国食品与药品监督管理局的1994年食品添加剂健康和教育法案(DSHEA)中的营养制品/食品添加剂。N-乙酰基-D-葡糖胺及其盐形式的母体化合物葡糖胺(硫酸盐、盐酸盐等)的口服制剂为商购的营养品并且通常与也是易于得到的营养制品硫酸软骨素一起给予。已经报导了葡糖胺和软骨素可有效地口服治疗骨关节炎，但是尚未进行FDA批准为药物所需的严格研究(Theodasakis等，The Arthritis Cure，1st Edition，St.Martin′s Press.New York，NY.1997；McAlindon等，JAMA，283：469-1475(2000))。The National Institutes of Health(Bethesda，MD，USA)正在进行多中心研究-GAIT(葡糖胺/软骨素关节炎干预试验)，这项研究目前正在评估口服给予的葡糖胺和软骨素口服补充剂的功效(葡糖胺/软骨素关节炎干预试验(GAIT)，NationalCenter for Complementary and Alternative Medicine(NCCAM)；和National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and SkinDiseases(NIAMS)，1999年9月)。
尽管口服给药是最广泛认可的给予葡糖胺的方法，但是还是研究了皮下给予的葡糖胺的有效性。例如，目前存在一种FDA批准的疗法SYNVISC，即用于局部治疗与膝的骨关节炎相关的疼痛(Genzyme Corp.，Naarden，the Netherlands)。该疗法包括在受侵害关节处注射包括透明质酸钠的溶液(糖胺聚糖)。然而，目前仅批准SYNVISC用于治疗膝。
非甾体抗炎药(NSAIDs)可有效降低炎症，并且通常用于治疗骨关节炎的症状。然而，NSAID可能具有不需要的副作用。已经尝试通过产生NSAID″前药″改善NSAID的药物特性，诸如渗透性、溶解性和稳定性。前药为药物前体。术语“前药”已经用于描述由一种活性药物化合物和第二种非活性化合物组成的化合物。前药作为药理学试剂为非活性的，直到它经历对患者给药后的化学转化为止，例如经过代谢过程。一旦转化，前药提供药物活性剂和在转化后一般为惰性的无活性化合物。
前药的概念最初由Albert阐明(Nature，182(4633)：421-423(1958))。前药合成和研发的最初目的在于改善药物稳定性并且使口服和静脉内给予的药物实现靶向药物递送。稳定性对药物活性具有重要意义，并且就对水和酶不稳定药物而言，一般通过防止药物发生给药后的化学水解和酶降解实现稳定性。前药的靶向递送基于提高药物的溶解性和渗透性，并且特别用于与类脂膜相关的给药，以便透入极为疏水性的血脑屏障。
前药的最常见形式使用通过羧酸与醇或酚反应合成形成的酯键以便改变母体药物的体内代谢归宿(fate)。除影响母体药物的代谢外，酯前药还可以具有其它优点，诸如减少的副作用。例如，如果将非甾体抗炎药(NSAID)配制成前药，那么胃不适感可以比单独给予NSAID减轻。与前药应用相关的正面特征包括：例如存在稳定的共价酯键；与母体药物相比降低的内在活性；低毒性；以及在结合位置上更好的释放动力学以确保有效的药物水平。
可以将代表前药变化形式的″互联体前药(Mutual prodrug)″描述为具有不同药理学活性的两种药物的缀合物。这一概念来源于临床上为提高药理活性或防止临床副作用的共同给药实践(US4,278,679)。合成互联体前药是为了改善每种药物的功效、使递送最优化和降低毒性的药理学目的。
在互联体前药中，每种成分药物均起相对于另一种成分的″前″部分的作用。类似于前药，互联体前药在体内通过酶和/或非酶促反应被转化成活性药物成分。例如，可以将互联体前药分类为载体连接的前药、生物-前体的前药或化学活化的前药，这取决于其成分和组成(Albert，Nature，182(4633)：421-423(1958)；Rao，H SuryaPrakash(在互联网上获自ias.ac.in/resonance/Feb2003/pdf/Feb2003p19-27.pdf)，Capping Drugs：Development ofProdrugs.k，2003年2月)。在作用部位上，原始药物的副作用可以得到掩蔽，从而使得药物更有效地起作用(Albert，Nature，182(4633)：421-423(1958))。互联体前药在药物和药理活性方面一般与单一活性剂前药类似，诸如吸收、分布、代谢和排泄。互联体前药的目的在于使两种活性药物均达到其相应的作用部位，以便提供所需的药理作用，同时将不良代谢和/或毒理学后果减少到最低限度。
在术语″前药″和“互联体前药”在研究领域中形成前许多年，就已经将联合药物作为治疗剂给予患者(Singh等，Indian J.Pharm.Sci，56(3)：69-79(1994))，例如与柳氮磺吡啶的产生有关，它代表了抗生素前药的最新进展。主要产生了β-内酰胺类抗生素及其强化活性剂的组合，以便产生例如氨苄西林-美西林和氨苄西林-舒巴坦而形成舒他西林和双重作用头孢菌素类以及其它一般不称作互联体前药的活性剂(Singh等，Indian J.Pharm.Sci，56(3)：69-79(1994))。
互联体前药一个实例为在上世纪七十年代作为表现出某些互联体前药特征的抗肿瘤药开发的雌莫司汀磷酸酯钠(EMCYT，Pharmacia，LaRoche)(Wang等，Biochem.Pharmacol.，55(9)：1427-33(1998)；Sheridan等，Cancer Surv.，11：239-254(1991)；Ohsawa等，Gan ToKagaku Ryoho.，Apr；15(4 Pt 2-1)：1065-71(1998)；Forsgren等，Urol Nephrol Suppl.，107：56-58(1988))。雌莫司汀一般用于治疗前列腺转移癌。雌莫司汀选择性地被雌激素受体阳性细胞吸收且然后如附图1中所示，尿烷键被水解而得到减缓前列腺细胞生长的17-α-雌二醇和nornitrogen mustard作为弱烷化剂。
前药研究已经持续进行，以为降低单一核苷药物递送过程中在起作用时的抗性机制而设计的5-氟尿嘧啶/阿糖胞苷互联体前药的合成为典型(Menger等J.Org.Chem.，62：9083-9088(1997))。研究人员，诸如Bhosale和合作者已经尝试生产布洛芬/对乙酰氨基酚和布洛芬/水杨酰胺的互联体前药。这项工作的目的在于生产NSAIDS的前药以便减少相关的副作用(Bhosale等，Indian J.Pharm.Sci.，66(2)：158-163(2003))。从生产目的在于简化NSAID递送的有关物理化学修饰的互联体前药的观点来看，其手段是独特的，非常类似于目前更多使用的柳氮磺吡啶，其作为由通过偶氮键共价结合的磺胺吡啶和5-氨基水杨酸组成的溃疡性结肠炎治疗剂(Klotz等，Adv.DrugDeliv.Rev.，57(2)：267-279(2005)；Lim等，Rev.Gastroenterol.Disord.，4(3)：104-117(2004)；Baker等，Rev.Gastroenterol.Disord.，4(2)：86-91(2004)；和Diculescu等，Rom.J.Gastroenterol.，12(4)：283-286(2003)。柳氮磺吡啶(附图2A)、5-氟尿嘧啶/阿糖胞苷(附图2B)、布洛芬/对乙酰氨基酚(附图2C)和布洛芬/水杨酰胺(附图2D)的结构在附图2中提供。
发明概述
″互联体前药″的概念在药物化学、药剂学和药物递送领域中是相对新的。互联体前药由例如通过酯键共价结合的两种药物化合物组成(Ueda等，Mem.Inst.Sci Ind.Res.Osaka Univ.，47：43-54(1990)；Imai等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，265：328-333(1994)；Fukuhara等，Chirality，8：494-502(1996)；Fukuhara等，Biol.Pharm.Bull.，18：140-147(1995)；和Otagiri等，J.Con.Release，62：223-229(1999))。当共价结合时，药物成分被赋予无药物活性；然而，该键可以为互联体前药提供一定的有益性，诸如与分别递送每种药物相比改善的共价连接药物的递送。酯键易于被哺乳动物酯酶所降解，由此使每种药物在体内释放。药物成分由此各自被赋予药物活性。因此，在对患者给药后，裂解互联体前药使得通过裂解产生药物活性的各自药物成分产生其相应的指定药理作用。在互联体前药中，每种成分均有利于另一种成分的递送。
本发明在一个方面中提供了作为互联体前药起作用的化合物。该化合物包括两种药物活性物质。本发明特别涉及包括与第二种成分共价结合的第一种成分的化合物，所述的化合物具有通式I：

其中R¹、R²，R³和R⁴彼此独立地为H或有机基团；L为任选的连接基；且X为抗炎药。在优选的实施方案中，R¹、R²、R³和R⁴各自为H；L为乙酰基；且X为布洛芬或酮洛芬。
由通过连接基L与抗炎药X连接的取代环结构表示的第一种成分优选为葡糖胺或葡糖胺的衍生物或类似物。第二种成分X为抗炎药，优选为非甾体抗炎药(NSAID)。在具有通式I的化合物中，连接基L可以存在或不存在。如果连接基L存在，那么认为第一种成分与第二种成分间接连接。如果连接基L不存在，那么认为第一种成分与第二种成分直接连接。第一种成分与第二种成分之间的键，无论是直接的还是间接的，均为共价键。
第一种与第二种成分之间的键为可裂解的键。例如，该键可以为可水解的和/或可以通过酶裂解的。优选该键可在生理条件诸如那些存在于哺乳动物体、特别是人体内的生理条件下裂解。当使用连接基L时，第一种成分与L之间的键可裂解，和/或L与第二种成分X之间的键可裂解。
除有利于递送活性成分外，所述成分的连接可以给予互联体前药保护作用，由此减少或防止不需要的通常由胃酸导致的降解和/或互联体前药体内裂解前药物中任一种或它们两者的副作用。鉴于对这些药物常见的副作用，如果NSAID为药物之一，那么这种由互联体前药提供的保护作用特别需要。本发明的互联体前药还可以表现出不同于每种药物各自的水溶性/脂溶性，这可以进一步有助于药物配制和/或递送的改进。
本发明进一步提供了包括具有通式I的化合物的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，提供了包括具有如上所述的通式I的化合物和药物上可接受的载体的组合物。优选配制可局部施用的该组合物。
本发明在另一个方面中提供了包括治疗有效量的具有通式II的化合物和药物上可接受的载体的药物组合物：

其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵彼此独立为H或有机基团；其中配制可局部施用的该组合物。在优选的实施方案中，R¹、R²、R³和R⁴各自为H且R⁵为乙酰基。通式II的化合物优选为葡糖胺或葡糖胺的衍生物或类似物。尽管一般通过口服递送例如作为营养制品的葡糖胺及其衍生物，并且较不常见地通过皮下递送，但是本发明有利地提供了葡糖胺和葡糖胺衍生物或其乙酰化类似物的局部递送。
任选地，葡糖胺或其衍生物或类似物的局部和/或透皮施用可以伴随共同给予抗炎药，诸如NSAID。当共同给药时，抗炎药和葡糖胺，包括其衍生物和类似物可以，但不一定共价连接形成互联体前药，正如本文更为详细描的。
本发明在另一个方面中提供了用于治疗和/或预防哺乳动物障碍或病症的方法，包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量的本发明组合物。该方法可以包括治疗剂、预防剂和/或化妆品的应用。本发明在一个实施方案中涉及缓解可用葡糖胺治疗的障碍的方法，该方法包括对哺乳动物、优选人给予有效量的具有如本文所述的通式I或II的化合物。本发明在另一个实施方案中涉及缓解可用抗炎药治疗的障碍的方法，该方法包括对哺乳动物、优选人给予有效量的具有如本文所述的通式I或II的化合物。

附图简述
附图1为雌莫司汀磷酸酯钠(EMCYT)及其前部分的结构的示意图。
附图2A-2D表示某些前药模型的结构。附图2A表示前药柳氮磺吡啶结构的示意图；附图2B表示提出的互联体前药模型5-氟尿嘧啶/阿糖胞苷的结构的示意图；附图2C表示提出的互联体前药模型布洛芬/对乙酰氨基酚的结构的示意图；且附图2D表示提出的互联体前药模型布洛芬/水杨酰胺的结构的示意图。
附图3A和3B分别表示吲哚美辛和葡美辛(glucamethacin)的结构。
附图4表示合成本发明间隔基连接的互联体前药的典型方案。
附图5表示合成本发明直接连接的互联体前药的方案。
附图6表示合成包括糖胺聚糖和NSAID的间隔基连接的互联体前药的方案。
附图7表示合成包括糖胺聚糖和NSAID的直接连接的互联体前药的方案。
附图8表示按照附图4方案合成的互联体前药的差示扫描量热(DSC)温度记录图(化合物6)。
附图9表示按照附图4方案合成的互联体前药的膨胀DSC温度记录图(化合物6)。
附图10表示按照附图5方案合成的互联体前药的DSC温度记录图(化合物9)。
附图11表示按照附图5方案合成的互联体前药的DSC温度记录图(化合物9)，它表示该化合物的升华、相变和降解现象。
附图12表示用于(a)葡糖胺HCl、(b)N-乙酰葡糖胺和(c)五乙酰基葡糖胺组合物扩散研究的时间对作为浓度函数的峰面积的示意图。
附图13为DMSO对于N-乙酰葡糖胺通过脱落的蛇皮的蓄积渗透的作用的示意图。
附图14为表示N-乙酰葡糖胺从磷酸盐缓冲液(pH 5.5)中通过脱落蛇皮的蓄积的棒形图，所述的磷酸盐缓冲液包括占水相体积百分比为2％、5％、10％、25％和50％的乙醇且乙醇中含有NAG。
附图15为表示乙醇浓度对N-乙酰葡糖胺在37.5℃下通过脱落蛇皮的蓄积渗透的作用的示意图，所述的乙醇浓度为占水相的体积百分比为2％、5％、10％、25％和50％的乙醇且乙醇中含有NAG。
附图16为表示大豆卵磷脂-维生素E对N-乙酰葡糖胺跨过脱落蛇皮的渗透的作用的示意图。
附图17为表示获自在普卢兰尼克凝胶-有机相载体中的N-乙酰葡糖胺通过脱落蛇皮的渗透的物理化学数据的示意图。
说明性实施方案的详细描述
哺乳动物、包括人和动物通常患有某些与软骨和关节结缔组织退化相关的障碍，诸如骨关节炎，它们可以引起受影响关节的疼痛、肿胀、强直和运动受限。一般通过使用抗炎药，诸如NSAID对这些症状进行控制。充分记录了抗炎药在治疗与诸如骨关节炎这类障碍相关的疼痛和炎症中的药理学、毒理学和生物制药学特性。
然而，给予NSAID可能在某些患者中产生一些有害的副作用。例如，NSAID可以产生胃不适、胃溃疡和/或肠出血。此外，患有某些障碍诸如甲状腺障碍、糖尿病、心脏病、高血压和变态反应的人以及将要做手术(包括牙科手术)的人和孕妇可能因给予NSAID而经历严重的副作用。此外，抗炎药并不治疗障碍的根本原因，例如软骨和结缔组织退化。
目前研究葡糖胺作为用于特征在于例如软骨和结缔组织变性的障碍的可能疗法。存在如下证据：使用葡糖胺治疗不仅可以减轻例如骨关节炎的疼痛，而且还可以治疗障碍本身，因为已经证实它可以减缓变性发展并且使软骨组织再生长。由此预计葡糖胺可有效治疗骨关节炎，尽管目前在美国尚未将其定为活性药物组分(API)。
一般通过口服给予葡糖胺；然而，认为它作为口服给予的营养制品具有极差的生物利用度。认为仅有较小百分比的活性组分(例如12-13％)在口服给予后对受影响的组织有效。
还研究了葡糖胺的皮下注射。例如，购自Genzyme Corp.(Naarden，the Netherlands)的用于给予透明质酸衍生物的装置SYNVISC为FDA唯一批准用于与膝的骨关节炎相关的疼痛的局部治疗的疗法。通常将SYNVASC以“标记外(off-label)”给予患者，即将其给予其它(例如非认可的)关节，由此提供葡糖胺作为治疗骨关节炎有效的无对照证据。然而，药物注射带有其自身潜在的问题，例如注射部位感染、患者对注射产生厌恶情绪、给药困难等。因此，需要改进的剂型，以便提供葡糖胺、其衍生物和类似物的更高的生物利用度及其递送至患者受影响区域的更为有效的方法。
本发明提供了将葡糖胺、包括其衍生物和类似物，任选地将其以与抗炎药的互联体前药的形式有效性递送至受与软骨和结缔组织退化相关的疾病影响的关节。
除非另有说明，将本文所用的术语“葡糖胺”理解为指葡糖胺、葡糖胺的衍生物、葡糖胺的类似物和葡糖胺的代谢物。
将本文所用的术语“有机基团”理解为指分类为脂族基团、环状基团或脂族和环状基团组合(例如烷芳基和芳烷基)的烃基(带有非碳和氢的任选元素，诸如氧、氮、硫和硅)。
术语“脂族基团”指的是饱和或不饱和直链或支链烃基。例如，该术语用于包括烷基、链烯基和炔基。术语“烷基”指的是饱和直链或支链烃基，包括：例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。术语“链烯基”指的是带有一个或多个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃基，诸如乙烯基。术语“炔基”指的是带有一个或多个碳-碳三键的不饱和直链或支链烃基。术语“环状基团”指的是分类为脂族基团、芳族基团或杂环基的闭环烃基。术语“脂环族基团”指的是具有与那些脂族基团相似的特性的环状烃基。术语“芳族基团”或“芳基”指的是单-或多核芳族烃基。术语“杂环基”指的是环上原子中的一个或多个为非碳的元素(例如氮、氧、硫等)的闭环烃。可以与另一基团相同或不同的基团有时称作″独立地″。
本发明提供了合并第一种成分葡糖胺或葡糖胺的衍生物或类似物和第二种成分抗炎药的互联体前药的新化合物。本发明进一步提供了包括有利于活性剂递送的互联体前药化合物的药物组合物。一旦通过该组合物递送互联体前药并且在体内裂解，则第一种成分和第二种成分被赋予活性并且相互提供NSAID和葡糖胺及其类似物和衍生物、诸如糖胺聚糖的治疗有益性。例如，通过作为互联体前药的成分递送的非甾体抗炎药的COX-1/COX-2抑制机制控制疼痛，因为通过局部递送的抗炎药的附加有益作用基本上减轻或消除了所有可能的副作用，特别是胃肠副作用。通过调节细胞性活动和/或生理过程，诸如细胞-细胞和细胞-基质相互作用和细胞增殖/分化，维持和/或修复组织可以由例如作为互联体前药的另一种成分的糖胺聚糖或糖胺聚糖的酯来控制。
另外，尽管不希望受到任何特定理论的约束，但是互联体前药中的抗炎成分可以有助于葡糖胺的经皮递送，由此在互联体前药体内裂解时提高葡糖胺的生物利用度。另外，抗炎药自身也可以对受影响区域提供治疗作用。
本发明的互联体前药化合物由通式I表示：

其中R¹、R²、R³和R⁴彼此独立地为H或如上述所定义的有机基团，X为抗炎药，且L为任选的连接基。如果没有连接基L存在，那么抗炎药X直接与第一种成分连接。连接基具有任意的类型，以便第一种成分(通式I中连接基L的左侧)共价连接至第二种成分X(通式I中连接基L的右侧)，且其中连接基为可裂解的，可以是在N(H)-L键、L-X键之间和/或在连接基L内部，在体内按照这类方式以便赋予第一种成分和第二种成分活性。一般来说，连接基为如上述定义的有机基团。优选的连接基包括酰氧基酯和α羟基酯。
互联体前药化合物的第一种成分提供了互联体前药的葡糖胺部分。尽管上述结构的任意葡糖胺均适用于本发明的互联体前药化合物，但是某些葡糖胺可以提供优选的实施方案。这类葡糖胺包括，但不限于：例如葡糖胺、葡糖胺五乙酸盐、葡糖胺-1-磷酸、葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰基-β-D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰基-葡糖胺-1-磷酸、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖、2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖的乙酰化类似物、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐的乙酰化类似物和N-乙酰基-葡糖胺(NAG)。本发明互联体前药的特别优选的实施方案包括氨基-2-脱氧-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐和N-乙酰基-葡糖胺(NAG)。
如上所述，本发明的互联体前药包括作为与葡糖胺成分共价连接的抗炎药作为第二种成分，正如下文更具体描述的。
互联体前药的成分一般保持无活性，直到通过破坏成分之间的共价键将它们转化成其活性形式为止。抗炎药可以与葡糖胺直接结合(例如取代氨基氢之一)，其中在体内裂解时，仅提供了互联体前药的两个活性成分种类(抗炎药和葡糖胺)。或者，抗炎药可以通过连接基或间隔基L，例如酯基与葡糖胺(glucoamine)共价结合。在该实施方案中递送互联体前药时，第一种成分和/或第二种成分与连接基之间的键例如被体内的酯酶裂解，使得互联体前药提供两个活性成分种类(抗炎药和葡糖胺)。如果连接基存在，那么优选对它们进行选择，使得整个连接基从葡糖胺和抗炎药上裂解，由此释放连接基并且任选地被降解乃至代谢。
如上所述能够与葡糖胺共价结合并且为患者提供所需作用的任意类型的抗炎药均适用于本发明的互联体前药。这类抗炎药包括：例如，前列腺素、花生四烯酸、花生四烯酸代谢物、非甾体抗炎药和非甾体抗炎药衍生物。
非甾体抗炎药(NSAID)从其广泛的有效性、其作为抗炎药的有效性且对某些NSAIDs而言的相对低成本的观点来看特别有用。用于本发明互联体前药化合物的优选NSAID包括但不限于例如水杨酸(例如乙酰水杨酸(阿司匹林)、三水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、双水杨酯、水杨酸镁、水杨酸胆碱、水杨酸胆碱镁、水杨酸钠)、丙酸类(例如非诺洛芬、非诺洛芬钙、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、吲哚布芬、吲哚洛芬、噻洛芬酸)、乙酸类(例如双氯芬酸、吲哚美辛、葡美辛、舒林酸、托美丁、卡洛芬)、烯醇酸类(例如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康、氯诺昔康)、灭酸类(例如甲氯芬那酸盐、甲氯灭酸钠、甲芬那酸、依托芬那酯)、萘基烷酮类(例如萘丁美酮)、吡喃并羧酸类(例如依托度酸)、吡咯类(例如酮咯酸、酮洛酸氨丁三醇、保泰松、remifenzone)、对-氨基苯酚类(例如对乙酰氨基酚)和环加氧酶-2(COX-2)抑制剂(例如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔、氟舒胺、尼美舒利)。吲哚美辛和葡美辛(glucametacin)的结构分别如附图3A和3B中所示。用于本发明互联体前药的优选NSAID包括布洛芬和酮洛芬。在一个实施方案中，用于本发明互联体前药的NSAID组中不包括化合物吲哚美辛。
本发明还提供了药物组合物。本发明的药物组合物可以包括在药物上可接受载体中的如上所述的通式I的互联体前药化合物，正如下文更具体地描述的。
本发明还提供了包括葡糖胺或葡糖胺衍生物或类似物(例如具有通式II的化合物)的组合物，为局部和/或透皮递送制剂形式。认为这些局部葡糖胺组合物提供了通过皮肤膜的经皮转运/渗透，使得葡糖胺的生物利用度和随后的其有效性与口服葡糖胺制剂的葡糖胺生物利用度相比可以得到改善。
本发明其它的组合物可以包括在药物上可接受的载体中的葡糖胺(例如通式I的化合物)，其中优选配制局部和/或透皮递送的该组合物。这些组合物不包括互联体前药；然而，已经证实本文披露的制剂可提供出人意料的通过皮肤膜的经皮转运，预计这可以提高葡糖胺的生物利用度。
正如本文所用的且除非另有说明，局部给药在功能上与透皮给药相同。尽管不希望受到任何特定理论的约束，但是葡糖胺的局部给药可以提供更高的活性组分生物利用度。然而，迄今为止，已经证实难以实现葡糖胺类跨皮肤膜的渗透。本发明提供了包括具有改善的渗透性的葡糖胺类的药物组合物，由此提供了更高的活性剂生物利用度。
本发明的某些有用的组合物包括但不限于：例如糖胺聚糖的酯类，诸如软骨素(chrondroitin)、皮肤素、肝素、肝素、角质素和其它生物上有意义的蛋白聚糖。为结缔组织和软骨成分的某些有用的糖胺聚糖酯类的实例包括：2-氨基-1，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基；2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-1，3，4，6-四乙酸盐；和2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖。
通过例如在药物上可接受的载体中配制或混合葡糖胺(类)提供了包括一种或多种葡糖胺的本发明组合物，例如霜剂、凝胶、溶液、软膏剂、洗剂、混悬液、乳剂、微乳、脂质体、透皮贴剂等。这类霜剂、凝胶、溶液、软膏剂、洗剂、混悬液、乳剂、微乳、脂质体或透皮贴剂可以包括美国药典(USP)批准用于人体或兽类应用的局部/透皮载体的任意成员或组合，例如，脂肪酯类、醇类、凝胶基质(例如普卢兰尼克凝胶)、卵磷脂、二甲亚砜(DMSO)、水等，以便形成透皮和/或局部用药剂。如果需要皮下或口服制剂，那么药物上可接受的载体可以包括：例如生理盐水、普卢兰尼克F-127溶液或一般公认为安全的(GRAS)递送溶液(皮下、肌内和/或静脉内递送)或片剂、胶囊、粉剂、混悬液、乳剂和/或凝胶(口服递送)。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种适用于该组合物的其它的成分，并且当包括它们时，它们会提供所需的效果(例如提供额外的对皮肤或组织的治疗有益性或例如有助于组合物的稠度和稳定性)。额外的成分可以包括：例如，抗微生物剂、胶凝剂、乳化剂、硬化剂、皮肤愈合剂、软化剂、表面活性剂、溶剂、润滑剂、蜡、皮肤渗透增强剂、抗氧化剂减轻任意的组合。
尽管可以理解用于本发明组合物中的某些成分可以根据例如成分浓度的不同在组合物中提供一种以上的作用(例如可以将泊洛沙姆看作胶凝剂和乳化剂)，但是下面是用于本发明组合物中的典型其它的成分。
抗微生物剂一般存在于组合物中以便有助于对组合物防腐，由此延长其贮存期限。用于本发明的抗微生物剂乙醇、对羟基苯甲酸酯类、对羟基苯甲酸酯类的盐、山梨酸、山梨酸钾、丙二醇、甘油等。还可以使用这些抗微生物剂的组合。
某些额外的成分可以用于增强组合物渗透过皮肤膜。有用的皮肤渗透增强剂包括：例如二甲亚砜、乙醇、聚乙二醇、脲，二甲基乙酰胺、十二烷基硫酸钠、司盘类、吐温类、萜烯类、月桂氮酮，丙酮和油酸。优选的皮肤渗透增强剂，特别是例如用于兽药应用的皮肤渗透促进剂为二甲亚砜(DMSO)。优选的皮肤渗透促进剂、特别是用于人体患者给药的皮肤渗透增强剂为乙醇。
尽管本发明组合物自身除可以提供对诸如骨关节炎这类障碍的治疗作用外还可以提供对诸如皮肤损害、灼伤和与年龄相关的皮肤皱纹这类情况的治疗作用，但是仍需要包括其它的提供皮肤愈合和/或抗氧化的成分以便对皮肤提供额外的治疗有益性。这类皮肤愈合剂包括；例如维生素E、维生素E-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(维生素E-TPGS)、抗坏血酸、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、芦荟(aloe vera)等。在本发明组合物中特别有用的皮肤愈合剂为维生素E。另外，某些有用的抗氧化剂包括富马酸、苹果酸、棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚、棓酸丙酯、抗坏血酸钠、偏亚硫酸氢钠等。
某些其它额外的成分，诸如乳化剂和硬化剂可以用于例如对组合物提供稳定性和所需的稠度。用于本发明的典型乳化剂包括胆固醇、泊洛沙姆、卵磷脂、卡波姆、聚氧乙烯醚类、脂肪酸酯类、硬脂酸酯类等。某些优选的乳化剂包括泊洛沙姆和卵磷脂，特别优选的泊洛沙姆为普卢兰尼克F-127。另外，用于本发明组合物的典型硬化剂包括长链脂肪醇类和长链脂肪醇酯类。
除上述额外成分中的任意之外，上述与本发明互联体前药连接的抗炎药中的一种或多种可以作为游离成分(例如不与葡糖胺共价结合或除包括互联体前药的组合物外)包括在本发明的任意组合物中。此外，当这些抗炎药不与葡糖胺共价连接时，对作为游离活性剂存在的抗炎药的选择并无限定。
为了提供药物上有效的组合物，本发明组合物中的第一种成分(例如葡糖胺、其衍生物和/或其类似物)一般以至少约1％重量且优选至少约10％重量的用量存在于组合物中。此外，葡糖胺成分在组合物中的存在量一般不超过约75％重量，且优选不超过约40％重量。
用于合成本发明互联体前药的两种一般方法如附图4和5中所示。然而，应理解本发明并不限于任何特定的合成方法，并且包括其它合成方法。每种典型方法(附图4和5)均提供了互联体前药，其为与抗炎药，诸如NSAID偶联的葡糖胺或其衍生物、诸如糖胺聚糖或糖胺聚糖的酯，并且典型的互联体前药可被水解乃至被裂解。优选连接键可在体内被水解或被裂解。
方案1(附图4)为描述本发明典型互联体前药的一般合成的示意图，其中葡糖胺通过间隔基(例如连接基或连接基团)与抗炎药连接，诸如亚胺-酯共价结合的烷基链，它通过内部生成的丙二酸酯构型与NSAID共价结合。连接部分一般在体内被裂解以释放葡糖胺和抗炎药以及惰性的连接基团。
或者，可以按照附图5的典型方案合成本发明的互联体前药以便提供葡糖胺或其衍生物与抗炎药之间的直接连接。包括按照附图5的一般方案合成的互联体前药的组合物递送优选在体内裂解的互联体前药以便提供葡糖胺和抗炎药，但不释放惰性成分。
本发明还提供了治疗哺乳动物障碍的方法，包括给予本发明的组合物。
本发明的化合物、组合物和方法适合于治疗哺乳动物的各种障碍或病症(例如人和/或兽的给药)，其中治疗包括缓解障碍的症状(例如关节疼痛和/或肿胀)、缓和障碍的原因(例如修复变坏的软骨和/或结缔组织)和/或改善病情(例如减少面部皱纹的出现)。
障碍可以是障碍的结果(例如骨关节炎)或可以是躯体损伤的结果(例如关节和肌肉扭伤)。此外，本发明的组合物和方法并不一定限于治疗障碍和/或损伤。本发明的组合物可以对受损和起皱皮肤提供治疗和美容作用，例如通过将该组合物施用在面部皱纹和/或皮肤损害的其它区域(例如因接触阳光、盐和/或风导致的皮肤损害)来进行，以便对皮肤提供缓和作用(治疗治疗作用)和至少对皮肤中出现的皱纹提供暂时性的减少(美容作用)。
因此，如本文所述，可以按照本发明方法治疗的障碍和病症包括但不限于关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、肌肉扭伤、肌肉劳损、关节扭伤、关节劳损、腱炎、滑囊炎、灼伤、关节痛、关节发炎、皮肤损伤、皮肤触痛、皮肤疼痛、日光损伤的皮肤、风损伤的皮肤、盐损伤的皮肤、瘢痕组织、与年龄相关的皮肤皱纹及其任意组合。
本发明的治疗方法包括使用没有限定的任意便利的途径对患者给予本发明的药物组合物。在优选的实施方案中，如上文更完整描述的，通过局部施用在皮肤或其它体外或体内膜上对患者经局部和/或透皮给予互联体前药。在其它制剂中，互联体前药或其代谢产物被递送至血流并且经全身循环。
在本发明的另一个实施方案中，通过口服给予互联体前药，诸如以片剂、粉剂、胶囊、混悬液、乳剂、凝胶等的形式。在另一个实施方案中，正如上文更完整描述的，通过皮下、肌内和静脉内注射治疗障碍。
尽管可以理解可以对患者给予本发明的组合物以治疗许多障碍和/或病症，包括但不限于治疗障碍和/或美容应用，但是还关注可以包括许多不同的额外成分以便提供在所关注的障碍或病症方面适合于本发明组合物递送的制剂。
例如，包括葡糖胺、其衍生物或其类似物的本发明组合物(例如不包括互联体前药的组合物)可以由额外成分的各种组合制备：例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、糖胺聚糖或糖胺聚糖酯；硬化剂，如长链脂肪醇类、长链脂肪醇酯类；蜡，如鲸蜡；非离子胶凝剂/乳化剂，如泊洛沙姆；水；和USP批准的抗微生物剂，其中对额外的成分进行选择以便为组合物提供所需的特性。此外，这些典型制剂中的某些可以提供糖胺聚糖酯的提高的渗透性，由此提供其改善的生物利用度。
典型制剂包括但不限于下列制剂，其中NSAID可以任选地包括在下列任意制剂中：
1.棕榈酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
2.棕榈酸异丙酯，水，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
3.棕榈酸异丙酯，维生素E，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
4.肉豆蔻酸异丙酯，泊洛沙姆，水，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
5.肉豆蔻酸异丙酯，水，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
6.棕榈酸异丙酯，水，卵磷脂，泊洛沙姆，USP批准的抗微生物剂，糖胺聚糖的酯
7.维生素E，卵磷脂，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖的酯
8.肉豆蔻酸异丙酯，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
9.棕榈酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
10.棕榈酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
11.棕榈酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
12.棕榈酸异丙酯，卵磷脂，USP批准的抗微生物剂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
13.肉豆蔻酸异丙酯，维生素E，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
14.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
15.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
16.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
17.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，糖胺聚糖的酯
18.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
19.肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
20.肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
21.肉豆蔻酸异丙酯，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
22.肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
23.肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
24.肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
25.棕榈酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
26.棕榈酸异丙酯，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
27.棕榈酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
28.棕榈酸异丙酯，DMSO，乙醇，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
29.棕榈酸异丙酯，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
30.棕榈酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
31.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
32.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
33.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
34.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
35.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
36.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
37.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
38.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
39.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
40.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，维生素E，糖胺聚糖的酯
41.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
42.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
43.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，糖胺聚糖的酯
44.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
45.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
46.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
47.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，泊洛沙姆，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
48.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
49.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，维生素E，卵磷脂，泊洛沙姆，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
50.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
51.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
52.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，泊洛沙姆，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
53.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
54.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
55.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，糖胺聚糖的酯
56.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
57.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
58.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
59.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，维生素E，糖胺聚糖的酯
60.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
61.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
62.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，维生素E，糖胺聚糖的酯
63.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
64.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
65.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
66.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，卵磷脂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
67.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，乙醇，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
68.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
69.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，乙醇，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
70.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
71.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
72.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
73.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
74.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
75.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，糖胺聚糖的酯
76.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，糖胺聚糖的酯
77.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
78.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
79.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
80.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
81.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
82.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
83.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，卵磷脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
84.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
85.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，USP批准的抗微生物剂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
86.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，水，USP批准的抗微生物剂，泊洛沙姆，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
87.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
88.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
89.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
90.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
91.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，维生素E，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
92.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，DMSO，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
93.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，乙醇，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
94.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
95.肉豆蔻酸异丙酯，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
96.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，乙醇，DMSO，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
97.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，DMSO，维生素E，卵磷脂，含水或无水羊毛脂，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
98.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，乙醇，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
99.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，含水或无水羊毛脂，糖胺聚糖的酯
100.肉豆蔻酸异丙酯，油酸，乙醇，维生素E，泊洛沙姆，糖胺聚糖的酯
101.脂肪酯类，糖胺聚糖的酯
102.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡醇，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
103.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡醇，抗微生物剂
104.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，十八烷醇，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
105.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，十八烷醇，抗微生物剂
106.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，十六醇十八醇混合物(cetostearyl alcohol)，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
107.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，十六醇十八醇混合物，抗微生物剂
108.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡(或鲸蜡替代物)，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
109.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡(或鲸蜡替代物)，抗微生物剂
110.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡基酯类，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
111.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，鲸蜡基酯类，抗微生物剂
112.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，乳化蜡，泊洛沙姆，水，抗微生物剂
113.棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，糖胺聚糖或糖胺聚糖酯，乳化蜡，抗微生物剂
本发明上述制剂中的某些可以天然良好地适合于某些目的。例如，一种促进组合物在关节、诸如膝部经皮吸收的制剂可能不同于目的在于使因接触阳光和天气而导致的眼周围阳光损害的皮肤和/或眼周围皱纹愈合/恢复的制剂。后者的应用得益于包括促进皮肤愈合的维生素E。然而，即使维生素E不会干扰皮肤渗透过程，维生素E不会对目的在于皮肤渗透和透入关节的制剂提供任何附加的有益性。
因此，例如，化妆品制剂以制剂目录号1-101为典型，而适用于治疗关节炎和/或关节发炎的制剂例如以制剂目录号102-113为典型。应理解，无论组合物的指定应用如何，本发明的组合物和方法并不限于对所列制剂1-113中成分的选择。
实施例
通过下列实施例解释本发明，这些实施例涉及如上所述的互联体前药和葡糖胺、包括其衍生物和酯类的局部和/或透皮施用。应理解下文所述的特定的实施例、物质、用量和操作步骤广泛用于解释本文所述的本发明的范围和实质。此外，提供这些实施例是为了清楚地理解，但本发明并不限于所示和所述的详细描述；许多变型对本领域技术人员而言显而易见。
实施例1  -NSAID-葡糖酰胺互联体前药的研发和合成
将NSAID和葡糖胺合并成单一互联体前药能够将这些药物以靶向障碍、诸如骨关节炎的形式提供口服或透皮给药同时递送。透皮递送是有利的，因为它避免了与NSAID口服递送相关的副作用，诸如通常在对患者口服给予NSAID时经历的不良药物反应和/或不良胃肠作用(Shi等，Acta Pharmacol.Sin.，25(3)，357-365(2004)；Benini等，Pediatr.Nephrol.，19(2)：232-234(2004)；Wiholm，Curr.Med.Res.Opin.，17(3)：210-216(2001)；Kromann-Andersen等，Dan.Med.Bul1.，35(2)：187-192(1988)；Pietzsch等，Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.，40(3)：111-115(2002)；Karch等，JAMA，22，234(12)：1236-1241(1975))以及通常使用葡糖胺给药观察到的代谢/排泄情况(Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，36(4)：729-735(1986)；Aghazadeh-Habashi等，Journal ofPharmacy&Pharmaceutical Sci.，5(2)：181-184(2000)；Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，43(10)：1109-13(1993)；和Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，51(9)：699-725(2001))。
实验
本研究的目的在于合成直接连接和链连接的NSAID-葡糖酰胺互联体前药模型。
材料和方法
所用的所有试剂和溶剂均购自Fisher Scientific。使用AnaltechCo.UNIPLATES进行TLC和制备型TLC色谱。使用Fisher-Johns仪测定熔点且未校准。在Varian INOVA 500MHz光谱仪上记录核磁共振光谱¹H NMR和¹³C NMR，其中将四甲基硅烷作为内标。以百万分之份数(ppm)记录化学位移(δ)并且将信号记录为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、m(多重峰)或br(宽单峰)。将Beckman DU-650和Thermo ElectronCorp.AQUAMATE用于记录UV光谱。工作人员(Staff)在University ofGeorgia’s Chemical和Biological Sciences Mass SpectrometryFacility完成了ESI(电喷射离子化)质谱。使用＞440目的硅胶进行柱色谱。使用Perkin-Elmer DSC 7与利用PYRIS热分析系统软件的TAC7/DX(Rev.E/March 2002)进行差示扫描量热法(DSC)。
合成
成功地完成了互联体前药模型的合成而产生了化合物产物6(方案I，附图6)和9(方案II，附图7)。研究了保存碳水化合物的β-构型，保护羟基(OH)以使胺(NH₂)进行选择性加成而产生伯中间体4的方法(方案I，附图6)和7(方案II，附图7)。由采用如下文献中的操作步骤合成化合物1-3(方案I，附图6)：Bergman等Chem.Ber.，1932，975；Silva等，J.Org.Chem.，64：5926-5929(1999)(补充材料)；和Charviere等，J.Med.Chem.，46：427-220(2003)作为化合物6的原料。
方案I(附图6)
1，3，4，6-四-0-乙酰基-2-脱氧-2-{[{[2-(4-异丁基苯基)丙酰基]氧基}(苯基)乙酰基]氨基}-β-D-吡喃葡萄糖(化合物6)的制备
用三乙胺滴定2-脱氧-2-氨基-1，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基(4)化合物3(100g，0.26mol)而得到白色沉淀。过滤该沉淀并且用CH₂Cl₂(2×150毫升(ml))洗涤。在真空中将滤液干燥24小时。用盐水(2×100)洗涤有机层并且用Mg₂SO₄干燥。通过减压旋转蒸发除去溶剂并且在真空中将产物干燥24小时而得到化合物4，其为白色固体(87.9克(g)，产率97％)。¹H NMR(d-丙酮)9.21s，1H)，6.15(d，1H)，5.38(t，1H)，5.08(t，1H)，4.31(dd，1H)，4.11-4.03(m，2H)，3.56(t，1H)，3.03-2.05(dd，6H)，2.25(d，3H)，2.10-2.09(m，3H).¹³C NMR(d-丙酮)205.7，170.1，169.87，169.39，169.0，95.20，74.85，72.28，68.61，61.90，55.46，19.98，19.85，19.82，19.77。C₁₄H₂₁NO₉的ES1：FW 347测定值m/z 348[M+H+]。Mp 134℃
2-脱氧-2-(2-氯-2-苯基)乙酰氨基-1，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基(5)
在-10°至室温下将α-氯苯基乙酰氯(20g，0.105mol)滴加到化合物4(29.88g，0.105mol)、三乙胺(12.4ml，0.90ml)在50ml CH₂Cl₂中的搅拌溶液中24小时。用HCl(1.5N，2×7ml)、H₂O(1×100ml)和盐水(1×100ml)洗涤该反应混合物。用Mg₂SO₄干燥有机相并且通过减压旋转蒸发除去溶剂。使用冰冷的乙腈使所得浆状物结晶并且在真空中干燥24小时而得到化合物5(27.4g，93.5％)，其为白色固体。¹H NMR(d-丙酮)7.80(s，1H)，7.37(s，2H)，7.25(s，2H)，5.79(s，1H)，5.33(d，2H)，4.90(s，1H)，4.09(d，2H)，3.95(s，1H)，3.84(s，1H)，3.17(s，1H)1.87-1.64(m，12H)。¹³C NMR(d-丙酮)205.55，16.88，169.69，169.18，168.51，167.69，128.85，128.61(2C)，127.81(2C)91.03，68.54，61.70，60.60 53.13，19.73，19.70(2C)，19.62。C₁₄H₂₁NO₉的ES1：FW[M+H+]499测定值m/z 500 440[M+H+]。Mp＞200(238)℃。
1，3，4，6-四-0-乙酰基-2-脱氧-2-{[{[2-(4-异丁基苯基)丙酰基]氧基}(苯基)乙酰基]氨基}-β-D-吡喃葡萄糖(6)
将在无水10ml CH₂C_l2中的化合物5(653毫克(mg)，1.45mmol)和α-甲基-4-[异丁基]苯乙酸-Na盐在室温下搅拌16小时。用盐水(2×10ml)洗涤该溶液并且通过旋转蒸发使其减少而得到化合物6(763mg，93.5％)，为白色粉末。¹H NMR(d-丙酮)7.73(s，1H)，7.41-7.13(m，9H)，5.81(d，2H)，5.38(m，1H)，5.04(m，1H)，4.26(s，2H)，4.10(s，1H)，3.96(s，2H)，2.48(s，2H)，2.01(s，6H)，1.84(s，6H)，1.65(s，1H)，1.53(s，3H)，0.90(s，6H)。¹³C NMR(d-丙酮)205.69，173.37，169.61，168.73，168.70，140.38，138.43，138.03，129.25，128.36，127.31，126.84，91.96，75.91，72.54，71.66，68.31，52.07，44.61，21.72.19.61，17.96：Uv 203λnm。C₃₅H₄₃NO₁₂的ES1，FW 669测定值m/z 522[M+H+]w/缺失了(C₁₁H₁₅)。
方案II(附图7)
2-脱氧-2-[2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸]氨基-β-D-吡喃葡糖基(化合物9)的制备
2-脱氧-2-氨基-1，3，4，6-四-0-三乙基甲硅烷基-β-D-吡喃葡糖基(7)
葡糖胺HCl(7.32g，33.95mmol)和催化量的二甲氨基吡啶(DMAP，催化剂)在室温下和100ml无水吡啶中搅拌3小时。滴加氯三乙基硅烷(20.47g，136.27毫摩尔(mmol))，同时将该溶液在-5℃的冰浴上搅拌至室温下16小时并且在40-45℃下搅拌2小时。除去吡啶并且用250ml乙酸乙酯洗涤所得油状物且随后用250ml 1∶1乙酸乙酯和盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥最终的有机层并且通过旋转蒸发除去溶剂而得到无色油状物，将其在真空中干燥过夜而得到化合物7(21.82g；97％)，为白色泡沫。¹H NMR(CD₃OD)：5.39(d，1H)，483-4.80(m，2H)，3.89-3.47(m，3H)，3.09-3.01(dd，1H)，1.04-0.53(m，60H)。C₃₀H₆₉NO₅Si₄的ES1：FW636测定值m/z 636[M+]和522[M+H+]w/缺失了(C₆H₁₅)。
在冰浴上搅拌在10ml乙腈中的2-脱氧-2-[2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸]氨基-β-D-吡喃葡糖基(9)化合物7(28g，43.5mmol)和DMAP(催化剂)。在单独的容器中，将在10ml乙腈中的(2S)-2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸(11g，43.55mmol)在冰浴上与BuNMe₂(8.75ml，120mmol)、Me₂NSO₂Cl(9.67ml，90mmol)一起搅拌至溶液变澄清为止。混合两溶液并且在0℃至室温下搅拌12小时以上。通过旋转蒸发除去乙腈。用2×150水/乙酸乙酯(1∶1)洗涤所得浆状物并且用2×100ml盐水洗涤有机层。通过旋转蒸发除去有机层并且在真空中将所得浆状物干燥12小时，得到2-脱氧-2-(2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸)氨基-1，3，4，6-四-0-三乙基甲硅烷基-β-D-吡喃葡糖基(化合物8)(43g)，定量：C₄₆H₈₁NO₇Si₄的ES1：FW872测定值m/z 857[M+H+]w/缺失了(CH₃)，为黄色浆状物。使用氟化叔丁基铵/MeOH直接使化合物8脱保护而得到白色沉淀，过滤，用甲醇洗涤并且从热乙醇中重结晶而得到化合物9(17.3g，85％)，为不透明固体。¹H NMR(DMSO-d₆)7.63-7.24(m，9H)，6.17(s，1H)，4.65(s，1H)，4.56(s，1H)，4.44(s，1H)，4.21(s，1H)，3.61(s，1H)，3.45-2.10(m，4H)，2.83(d，2H)，2.25(d，3H)，1.1(s，3H)。¹³C NMR(DMSO-d₆)197.13，176.39，141.67，137.64，137.34，132.54，131.73，129.69(2C)，128.79，128.47，128.41(2C)，128.19，95.20，74.85，72.28，68.61，61.90，55.46，45.09，18.12。C₂₂H₂₅NO₇的ES1：FW416测定值m/z 416[M+H+]。Mp164℃。
结果
将化合物6和9设为互联体前药以便通过递送NSAID和葡糖胺(或其酯或其衍生物)治疗障碍，诸如骨关节炎。
化合物6为通过连接基与葡糖胺的酰胺共价结合的布洛芬，且化合物9为直接与葡糖胺连接的酮洛芬分子，它们各自均为模型MP。预计生理、酶和水解反应均分别影响每种互联体前药的酯和酰氨基-酯键，由此使得它们成为通过口服或透皮给药用于靶向相关疼痛和可能的诸如骨关节炎这类障碍的根本原因的理想互联体前药。
尽管目前在美国并不将葡糖胺看作药物，但是研究已经证实口服给予的葡糖胺可以促进糖胺聚糖合成和组成润滑流体和支持关节组织(即软骨)的蛋白聚糖产生，由此导致例如治疗骨关节炎的根本原因(McClain等，Diabetes，45：1003-1009(1996)；Singh等，Diabetes，50：2355-2362(2001))。葡萄糖和葡糖胺为葡萄糖激酶的底物(Singh等，Diabetes，50：2355-2362(2001))。磷酸化葡糖胺，即葡糖胺-6-磷酸抑制葡萄糖激酶并且改变葡萄糖和随后的葡糖胺代谢(VanSchaftigen等，Biochem.J.，308：23-29(1995)；Virkamaki等，Diabetes，48：1101-1107(1999))。Miwa等报导了葡萄糖激酶对NAG具有低亲和性。因此，NAG激酶介导NAG的磷酸化而产生不影响葡萄糖激酶活性的NAG-6-磷酸(Miwa等，Enzyme Protein，48：135-142(1994))。推断NAG-6-磷酸不影响葡萄糖激酶活性，由此使得葡萄糖和葡糖胺进行无限制性的代谢。从这一观点来看，使用NAG或某些其它限速葡糖胺类似物而非通过母体葡糖胺可以更好地促进糖胺聚糖类的生物合成(Gouze等，FEBS Lett.，510：166-170(2002))。Anastassiades等报导了葡糖胺及其类似物，诸如NAG以及带有可变N-连接-链的葡糖胺已经通过在体外的基质基质基因表达显示出人软骨细胞培养物生长的程度(Poustie等，Pharmacol.Exp.Ther.，311(2)：610-616(2004))。从每一综述中的药剂学观点来看并且考虑到Anastassiades的专利和专利申请(美国专利申请US20040152665(2003)和20020045597(2001)；国际专利申请公开号WO 2002017890 A2)；我们做出如下推定，即通过保护葡糖胺的酰胺，影响其活性的葡糖胺分子的半衰期得到增加。已经在大量文献研究中证实了链键作用，诸如聚合物通过酯键与分子偶联以增加其半衰期作为改变化学实体溶出特性和/或生物药物特性的方法(D’Souza等Journal of Pharmaceutical Sciences，93(8)：1962-1979(2004))。
尽管某些研究似乎表明在轻度至中度骨关节炎病例中有一定的有效功效，但对葡糖胺作为治疗某些障碍的有用性的阻碍在于其生物利用度，一般可接受的是约为12-13％(Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，36(4)：729-35(1986)；Biopharmaceutics&Drug Disposition，25(3)：109-116(2004)；Du等，Biopharmaceutics&Drug Disposition，25(3)：109-116(2004))。尽管不受任何特定理论的约束，但是我们认为这两种合成的互联体前药在体内发生水解而得到母体化合物。然后，每种母体化合物可以提供其治疗上公认的作用。研究并未完成测定新的互联体前药的溶出特性是否快于其水解或酶降解速率常数。尽管这一结果是预计的，但是预计速率是可变的，因为键取决于共价键的化学性质、化合物的结构和体内/体外的环境条件。
作为三联本体(tripartiteentity)的化合物6可以比双联化合物9更易于发生水解。化合物6的布洛芬分子因连接基而具有发生水解的潜能。连接基的苄基部分随后可能发生分子内反应和/或释放葡糖胺分子的酶反应。预计作为双联化合物的化合物9水解成母体化合物酮洛芬和葡糖胺。
然而，已经基于“硅中(in silico)”计算的化合物6和9的pKa值进行了这些预测(分别为附图6和7)。使用ACD/I-Lab在线服务(可利用互联网的acdlabs.com)获得化合物6的硅中的pKa和log P计算值作为ACD/pKa v8.02的结果且如下：

离子形式：HL
pKa₁(HL/H+L；9)＝10.79±0.70
pKa₂(H2L/H+HL；9)＝-3.67±0.70
计算的log P：6.45±0.82
使用ACD/I-Lab在线服务获得化合物9的硅中的pKa和log P计算值作为ACD/pKa v8.02的结果且如下：

离子形式：H5L
pKa₁(HL/H+L；9)＝15.53±0.70
pKa₂(H2L/H+HL；11)＝14.69±0.70
pKa₃(H3L/H+L；11)＝14.33±0.70
pKa₄(H4L/H+HL；10)＝13.53±0.70
pKa₅(H5L/H+L；8)＝12.03±0.70
pKa₆(H6L/H+HL；9)＝-2.40±0.70
计算的log P：3.81±0.48
预测的计算结果可以为生物药物特性提供评估。报导的pKa计算值来源于源自己知pKa的或不同化学基团的算法。本文主要集中在酰胺和/或酯键的pKa。化合物6中的酰胺的负pKa提示较大的Ka值，其含义是平衡常数保持正确以便通过水解型裂解分离酰氨基-酯键，使其自身更多地进行酶裂解，这也是化合物6的酰氨基-酯的情况。另一方面，酰胺还具有高pKa值，并且根据其离子化的不同，酰胺-酯键可以被水解。此外，一般预计接近2.5-3.0的pKa是因带负电荷的氧质子化所致。我们的预测表明这一结果可能发生在酰氨基酯的羰基氧上。其它的研究将确定这些互联体前药是否具有底物特异性、亲水性和/或影响母体药物释放速率的其它影响的真正途径。基于其物理化学特性和对其释放机制的理解进行研发是定向于其它互联体前药研发的主要决定性因素。
化合物6和9的‘in silico’log P预测值(分别为附图6和7)分别为6.45±0.82和3.81±0.48。目前使用5的Lipinski′s Rule(Du等，Biopharmaceutics&Drug Disposition，25(3)：109-116(2004))将化合物6和9分别评定为4和2。而这些数值是基于根据例如使用确定“药物相似性”的″5的规则(rule of five)″采集的数据估计的化学化合物集合排列的溶解度。″5的规则″描述了当出现如下情况时，差的吸收或渗透更有可能：
A)存在5个以上H-键供体(表示为OHs和NHs的总和)；
B)MWT超过500；
C)LogP超过5(或MLogP超过4.15)；和
D)存在10个以上H-键受体(表示为Ns和Os的总和)。
吸收性或渗透性差是可能的，因为没有一个化合物满足两个以上的标准。尽管就其基于“5的规则”的水溶性和肠渗透性，化合物9比化合物6显示了更多的药物的相似性。根据这一结果，含有碳水化合物部分的互联体前药，诸如这些可能属于生物转运蛋白底物类的化合物不在所述规则之列。
本研究主要从药物研究开始以便合成和评价两种提出的互联体前药候选物的理化性质。尽管尚未讨论溶出特性，但是我们测定了富有吸引力的差示扫描量热(DSC)数据。为了评价这些互联体前药的溶出特性，必须建立一致的晶形，我们未能实现。我们遇到了通常观察到的碳水化合物相变，诸如玻璃态动力学，随后是Tool-Narayanaswany-Moynihan模型趋向(Areozzi等，Journal ofPhysics：Condensed Matter，15(11)：S1215-S1226(2003))。该模型是解释使用碳水化合物和其它化学实体诸如蔗糖、海藻糖和(聚)乙烯吡咯烷酮观察到的玻璃态转变的尝试。其应用广泛用于制药工业以便研究物理化学稳定性和玻璃化转变与结构驰豫(relaxation)的脆性/活化能之间的定量关系(Pikal等，J.of Pharm.Sci.，93(4)：981-994(2004))。
在附图8中，作为粉末的化合物6的DSC温度记录图(thermographs)显示了看起来为热稳定的多晶型物的三种转变指示，其中相变分别发生在226.93℃、233.09℃和237.52℃。所有的温度记录图均与以不同速率加热下的一致。在打开所有的DSC托盘后，我们发现化合物已经升华并且分解。
化合物9的DSC温度记录图(附图10和11)难以得到。化合物9的未校准的熔点被测定为164℃。化合物6和9有代表性的DSC温度记录图显示了放热活性(附图9和11)和表明升华的许多相变点，这在视觉检查时得以证实。未校准的熔点实际上是DSC温度记录图上的分解点。通过视觉观察，获得了浆状物的化合物6，它在高真空压力和/或溶剂重结晶下重结晶为带有椭圆形表面的不透明晶体。为了获得更清楚的化合物6的图，我们尝试了X射线衍射晶体分析法，但是因为晶体结构的不透明性和复杂性而失败。未观察到不同的多晶型物和玻璃化转变状态。Pikal等的推定为：“....因为物理和化学降解过程需要原子和分子运动，正如结构驰豫需要相似的运动一样，不稳定过程与结构驰豫有关或与之‘关联’”(J.Pharm.Sci.，93(4)：981-994(2004))，这一推定看起来在将化合物6视为无定形化学实体方面是有根据的。
合成两种互联体前药模型以便进行与尝试克服药物和药理难题中的前药相同的过程和/或方法，所述的药物和药理难题诸如使用NSAIDS和葡糖胺观察到的吸收不完全、吸收和排泄过快。最终目的在于使NSAID和葡糖胺达到提供其药理作用的部位，同时将不良药物反应和/或作用减少到最低限度。预计体外和/或体内研究将验证这些新合成的互联体前药及其衍生物和/或类似物的预期目的。
为产生抗炎作用和软骨生长，我们还研发并且进行了其它作为葡糖胺和NSAIDs的递送系统的葡糖胺-NSAID类似物的初期预试工作研究。NSAID可以为例如布洛芬或酮洛芬。
实施例2  -葡糖胺-NSAID互联体前药的溶解度和转运
NSAID-糖胺聚糖互联体前药、诸如布洛芬-葡糖胺的透皮递送可以同时伴随递送NSAID和糖胺聚糖，象葡糖胺。在显示葡糖胺和葡糖胺互联体前药跨过脱落蛇皮转运的实验中，葡糖胺HCl并未通过脱落的蛇皮转运，而N-乙酰基-葡糖胺(NAG)大量转运，即使NAG具有所认为的在辛醇/水中极差的约为0.017的分配系数。
化合物6具有的分配系数(以in silico log P计算)为6.45，且化合物9具有的分配系数(以in silico log P计算)为3.81，表明了更高的脂质溶解度和发生更大的转运可能性的预测。已经证实布洛芬和酮洛芬跨过脱落的蛇皮转运(US 6,368,618 B1；Pharacta Helv 1996，Aug，7(3)：205-212；boll Chim. Farm. 2000 Mar-Apr，139(2)：67-72)；酮洛芬和布洛芬为脂溶性NSAIDS。预计NSAID-糖胺聚糖(glucosaminglycan)互联体前药也跨过脱落的蛇皮转运作为用于人体表皮的模型；还预计NSAID酯前药表现出类似的转运特性，表明了互联体前药发生转运的更大的可能性。
实施例3.葡糖胺和葡糖胺盐跨过皮肤的转运
葡糖胺、其衍生物和类似物，例如N-乙酰基-D-葡糖胺的口服给药受肝的首过代谢的影响(Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，36(4)：729-35(1986)；Du等，Biopharmaceutics&Drug Disposition，25(3)：109-116(2004))。然而，更多近来的报导表示这些活性剂大部分在肠中代谢，而不是仅被肝代谢(Aghazadeh-Habashi等，Journal ofPharmacy&Pharmaceutical Sciences，5(2)：181-184(2002))。现存的这些活性剂在关节软骨中分布的药代动力学文献的报导(Setnikar等，Arzneimittel-Forschung，43(10)：1109-1113(1993)和Arzneimittel-Forschung，51(9)：699-725(2001))几乎未报导有关葡糖胺在狗和人体内的药代动力学特性。据估计约87％的原始葡糖胺口服剂量被吸收和排泄；＜13％广泛分布在体内；且＜1％达到骨关节炎的关节。已知软骨素在肠内可降解成其基本的二糖成分，此后进一步代谢(Lamari等，Biomed.Chromatogr.，16：95-102(2002))。尽管仅有少部分葡糖胺达到关节软骨的靶位，但是据报导它表现出极高的功效；并且葡糖胺和软骨素共同疗法在一段时间内显示出治疗功效(McAlindon等，JAMA，283：1469-1475(2000))。
最初的数据显示了与目前可得到类型的含有葡糖胺的霜剂相比较的本发明的某些局部递送的葡糖胺组合物(糖胺聚糖的酯类)的转运。这些霜剂一般包括葡糖胺盐(HCl盐或硫酸盐)，除非使它们带电荷，否则它们为无法跨过和/或透入皮肤的单价(不带电荷)的化学实体。
所分析的组合物在DMSO溶液中包括如下所述的葡糖胺HCl、N-乙酰基葡糖胺和五乙酰基葡糖胺(glucosamine-pentaacetyl)：
葡糖胺HCl
分子式              ＝C₁₄H₂₂ClNO₉
式量                ＝383.7785
组成                ＝C(43.81％)H(5.78％)Cl(9.24％)N(3.65％)
                      O(37.52％)
摩尔折射率          ＝未得到
摩尔体积            ＝未得到
等张比容            ＝未得到
折射率              ＝未得到
表面张力            ＝未得到
密度                ＝未得到
介电(Dilectric)常数 ＝未得到
极化率              ＝未得到
单同位素质量        ＝383.098312 Da
标称质量            ＝383 Da
平均质量            ＝383.783195 Da
N-乙酰葡糖胺
分子式               ＝C₁₄H₂₁NO₉
式量                 ＝347.3179
组成                 ＝C(48.41％)H(6.09％)N(4.03％)O(41.46％)
摩尔折射率           ＝77.50±0.4厘米(cm)³
摩尔体积             ＝266.2±5.0cm³
等张比容             ＝703.1±6.0cm³
折射率               ＝1.493±0.03
表面张力             ＝48.6±5.0达因/cm
密度                 ＝1.30±0.1克/cm³
介电常数             ＝未得到
极化率               ＝30.72±0.5×10^-24cm³
单同位素质量         ＝347.121634 Da
标称质量             ＝347 Da
平均质量             ＝347.32248 Da
五乙酰基葡糖胺 
分子式               ＝C₁₆H₂₃NO₁₀
式量                 ＝389.3546
组成                 ＝C(49.36％)H(5.95％)N(3.60％)O(41.09％)
摩尔折射率           ＝86.91±0.4cm³
摩尔体积             ＝299.4±5.0cm³
等张比容             ＝787.0±6.0cm³
折光率               ＝1.492±0.3
表面张力             ＝47.6±5.0达因/cm
密度                 ＝1.30±0.1克/cm³
介电常数             ＝未得到
极化率               ＝34.45±0.5×10^-24cm³
单同位素质量         ＝389.132199 Da
标称质量             ＝389 Da
平均质量             ＝389.359811 Da
通过Franz细胞扩散实验，使用脱落的蛇皮评价体外转运(扩散)。脱落的蛇皮被广泛公认为用于初期渗透性研究的人皮肤的充分模型膜，这是因其组成与人角质层的相似性所致。
将脱落的蛇皮在室温下和0.1％叠氮化钠水溶液中水合48小时。将皮肤固定在三个充满了0.1M pH7磷酸盐缓冲液的Franz受体池中。将受体溶液维持在37℃下并且使用磁性搅拌器搅拌。将供体池与各受体池夹紧，其中将皮肤固定在受体与供体池之间并且给供体池充入在1毫升(ml)DMSO溶液中的100毫克(mg)葡糖胺HCl(例如池1)、N-乙酰葡糖胺(例如池2)和五乙酰基葡糖胺(例如池3)中的每一种。接触扩散的皮肤表面为2.54cm²(1.8cm直径)且受体池的体积为6cm³。使系统平衡2小时，此后取样。
在5、10、20、40、80、160和240分钟间隔取20微升(μl)受体溶液样品并且用新鲜的缓冲液取代。通过带有脉冲电化学检测的高效液相色谱法分析每个样品的10μl等分部分。
正如附图12中所示，未观察到葡糖胺HCl盐组合物跨过皮肤膜扩散和/或转运。糖胺聚糖的酯类的组合物(N-乙酰葡糖胺和五乙酰基葡糖胺)表现出5分钟-240分钟的即刻和恒定扩散和/或转运。分析每个受体池的体积，揭示出超过50％的酯类转运(例如在递送期中有100mg酯类转运，在一段时间内递送了超过50mg的酯类。
实施例4  -N-乙酰基-D-葡糖胺的透皮渗透
本项研究的目的在于评价葡糖胺类、其酯类及其衍生物的透皮渗透性，为了评价持续经皮制剂在局部疗法中的可行性，选择NAG用于分析，因为它是葡糖胺的活性代谢物和前药；并且由于其在商业上可得到、成本相对较低和稳定性。它具有如下物理和化学特性，使得它成为透皮递送和经皮吸收的合理候选物：a)高功效；b)合理的脂溶性；c)低分子量；d)独特的活性成分从血液转运入关节软骨的生化途径(Milewski，Biochimicaet Biophysica Acta，1597：173-192(2002))。此外，应理解外源性葡糖胺可促进糖胺聚糖合成以便通过避免其从葡萄糖转化成葡糖胺的限速步骤，并最终通过谷氨酰胺(果糖-6-磷酸酰胺转移酶)转化成N-乙酰基-D-葡糖胺而产生蛋白聚糖(McClain等，Diabetes，45：1003-1009(1996))。葡萄糖和葡糖胺为葡萄糖激酶的底物(Singh等，Diabetes，50：2355-2362(2001))。磷酸化葡糖胺产物葡糖胺-6-磷酸抑制葡萄糖激酶并且改变葡萄糖和随后的葡糖胺代谢(Van Schaftigen 等，Biochem.J.，308：23-29(1995))。Miwa等报导葡萄糖激酶对NAG具有低亲和性(Enzyme Protein，48：135-142(1994))，于是，NAG激酶介导NAG的磷酸化以产生NAG-6-磷酸，其不影响葡糖激酶的活性(Miwa等，EnzymeProtein，46：135-142(1994))，使得葡萄糖和葡糖胺进行无限制性的代谢。从这一观点来看，在某些实施方案中并且就某些具体的应用而言，通过使用NAG或某些其它限速葡糖胺类似物而非通过葡糖胺可以更好地促进糖胺聚糖类的生物合成(Shikhman等，J.Immunol.，166：5155-5160(2001))，不过，并不排除使用葡糖胺。
通过使用不同的已知膜转运增强试剂乙醇、油酸、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯的NAG混悬液；NAG水溶液和磷酸盐缓冲液；以及NAG饱和的二甲亚砜(DMSO)溶液评价渗透性。
葡糖胺和软骨素是带电荷、高度极性、水溶性的且为透皮吸收差的候选物。目前，存在市售的含有这些以盐形式存在的成分的用于治疗骨关节炎的营养制品的局部用产品，它们含有这类组分，其作用在短期内可能是错误的，因为治疗性的NAG，即乙酰化葡糖胺代谢物为低极性并且中性似乎使其更能够成为透皮递送和经皮吸收的候选物。
葡糖胺通过己糖胺途径被代谢成NAG；将葡糖胺或半乳糖胺+糖醛酸作为二糖单位掺入所有需要氨基糖类的大分子，诸如角质素、皮肤素、软骨素、透明质酸(hyluronates)和肝素，以便产生糖胺聚糖类(GAG)。GAG为带大量负电荷的分子、具有伸展的构象并且表现出作为用于解剖关节的理想润滑液的高粘性和低可压缩性。体内的大部分GAG与核心蛋白连接成为皮肤、组织和软骨的基本成分的蛋白聚糖类或粘多糖类(Merrick等，J.Bio.Chem.5：235(1960)；Milewski，“葡糖胺-6-磷酸合酶”Biochimicaet Biophysica Acta，1597：173-192(2002)。
材料和方法
化学品
99.9+％纯度的NAG购自MP Biomedical(Aurora，0hio)。用于本研究的所有增强剂试剂均为99.9+％纯度。所有其它试剂具有分析级并且无需进一步纯化使用。
分析
使用带有脉冲电流检测的高效离子交换色谱法(HPAE-PAD)在包括GP40梯度泵、ED40电化学检测器、AS3500自动采样器和PEAKNET色谱工作站的Dionex DX-500HPLC系统(Dionex，Sunnyvale，CA)上进行NAG分析(“使用Dionex ED40电化学检测器对碳水化合物的脉冲电流检测的最佳设定”技术注释21，Dionex Corp.，Sunnyvale，CA，USA.；Clarke等，Anal Chem，71：2774-2781(1999)；Campo等，J.Chrom.B，765：151-160(2001)；LaCourse，W.R.Pulsed ElectrochemicalDetectionin High-Performance Liquid Chromatography，JohnWiley&Sons Inc.(1997))。HPAE-PAD安装有：CARBOPAC PA20(3×150mm)；分析型阴离子交换柱(Dionex，Sunnyvale，CA)，它用于使用脉冲电流检测快速高分辨分离单糖类和二糖类；CARBOPAC PA20分析型保护柱(3×30mm)(Dionex，Sunnyvale，CA)；和碳酸盐截留柱(25×15mm)(Dionex，Sunnyvale，CA)。给流动相(A)脱气并且使用去离子水制备。流动相(B)包括用去离子水制备并且在真空中脱气的溶剂过滤仪(Warters-Millipore，Milford，MA，USA)中使用0.45微米(μm)滤膜过滤的0.02N NaOH。使流动相系统以16mM NaOH的梯度浓度和0.5毫升/分钟(ml/min)的流速运行。使用线性回归获得NAG的标准校准曲线(附图13)且R²值＝0.9936。使用外标测试每个样品组。通过PEAKNET软件获得样品的浓度值。将这些值与通过计算作为标准曲线线性回归方程函数测定的峰面积和峰高获得的那些值进行比较。仪器的灵敏度约为10^-4个单位。
溶解度测定
将过量的NAG(pKa 6.73)放入含有10ml去离子水、10ml正-己烷和10ml磷酸盐缓冲液(pH6，6.73，和7.4；1M)的单独的小瓶并且在37℃下搅拌24小时。将溶液以9000转/分钟离心5分钟并且使用乙酸纤维素膜滤膜(0.45μm孔大小)(Dionex，Sunnyvale CA)过滤上清液。在适当稀释后通过HPAE-PAD测定每份滤液中的NAG浓度。
分配系数的测定
使用正-己烷/磷酸盐缓冲液(pH5.5、6、6.73和7.4，0.1M)和正-己烷/水测定NAG的油/水分配系数(Bernacki等J.Supramolecular Structure，7：235-250(1977))。在每种情况中，将5ml正-己烷与含有NAG的水溶液混合并且在37℃下振摇24小时。此后离心该混合物并且分离有机相和水相。在适当稀释后通过HPAE-PAD测定滤液中的NAG浓度。
体外膜渗透
将脱落的蛇皮用作渗透研究的模型膜，该研究使用：在已知膜渗透增强剂中的NAG混悬液；乙醇、油酸、肉豆蔻酸异丙酯和棕榈酸异丙酯；NAG在水和在磷酸盐缓冲液中的饱和溶液；以及在饱和DMSO溶液和含有2％、5％、10％、25％和50％乙醇溶液的磷酸盐缓冲液(pH5.5)中的溶液。
在室温下将皮肤和0.1％叠氮化钠水溶液中水合48小时。进行Franz-池扩散(Franz-cell diffusion)实验。一般来说，给受体池充入7.4pH0.1M磷酸盐缓冲液并且给供体池充入溶液或混悬液。就在供体相中的含有2％、5％、10％、25％和50％乙醇溶液的磷酸盐缓冲液(pH5.5)而言，受体相由磷酸盐缓冲液(pH5.5，0.1M)组成。将受体溶液维持在37℃下并且使用磁性搅拌器搅拌。
将蛇皮固定在受体池与供体池之间。接触扩散的表面为2.54cm²(直径1.8cm)且受体池体积为6cm³。用塑料薄膜覆盖供体池。使系统在37℃下平衡2小时，此后进行各实验。向供体池中加入5mlNAG-增强剂混悬液或溶液。在24-小时期限内间隔取样，取200-μl受体溶液样品并且使用新鲜缓冲液取代；实验按一式三份进行。通过HPAE-PAD测定通过蛇皮渗透的NAG的量。
数据处理
NAG(mg/m²/h)的稳态流量(J_ss)根据其在受体介质中的增加量计算(Bach等，Eur.J.Pharm.Biopharm，46：1-13(1998))。以cm/h计的NAG的渗透系数(k_p)根据已知的物理化学参数计算(Hadgraft等，“局部和透皮递送的可行性评价：数学模型和体外研究”-TransdermalDrugDelivery.2^nd Ed.Marcel Dekker，Inc.，pages1-23(2003))。根据图示，从每单位面积上释放的药物蓄积量(mg/cm²)与时间关系的图中确定迟滞时间(t_lag)。获得时间的平方根(t^1/2)与每单位面积上释放的药物蓄积量(mg/cm²)的关系以便监测NAG的体外释放速率(mg/cm²)(Guidance for Industry：SUPAC-SS Semisolid DosageForms.Scale-up and Postapproval Changes：Chemistry，Manufacturing，和Control；In Vitro Release Testing和In VivoBioequivalence Documentation. US Department of Health and HumanServices，Food and Drug Administration，Center for.DrugEvaluation and Research，1997年5月)。
结果
使用脱落的蛇皮作为用于人体皮肤的模型膜进行最初的渗透性研究；这种模型因其在组成上与人角质层的相似性而被广泛公认为充分的前期研究模型(Itoh等，“脱落蛇皮作为模型膜在体外经皮渗透研究中的应用：与人皮肤比较”-Pharm.Res.，7：1042-1047(1990))。从膜渗透增强剂的混悬液；乙醇、油酸、肉豆蔻酸异丙酯和棕榈酸异丙酯中观察到了可忽略不计的NAG转运。从NAG在水或磷酸盐缓冲液溶液(pH 5.5，6.0，6.73，和7.4；0.1M)的水溶液中未观察到渗透。因为与表1中所示的NAG’的分配系数的选择的定量相关性，所以预计NAG从前述膜渗透增强剂混悬液或水溶液中渗透。
表1.实验测定的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)的分配系数(pK6.73)和渗透系数(k_p)