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本发明涉及烟酰胺或其衍生物，具体地，包括烟酰胺或其衍生物用于预防癌症和治疗的药剂，其中所述烟酰胺或其衍生物增强RUNX3基因，被甲基化作用灭活的癌症抑制基因的表达。本发明用于预防癌症和治疗的药剂用于与RUNX3灭活相关的癌症，诸如胃癌、肺癌、肝癌、喉癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌和乳腺癌。

1.  一种用于预防和治疗癌症的药剂，其含有具有下式的烟酸或其衍生物作为有效成分：

其中，R₁是氧或硫，R₂是H，OH，C₁～C₁₀烷基，NH₂，NH-NH₂，NH-C₂H₄-O-NO₂-或OR₃，R₃是C₁～C₅烷基，X是H，NH₂或卤素原子，并且Y是H或CH₃。

2.  权利要求1中提出的用于预防和治疗癌症的药剂，其中所述R₁是C₁～C₅烷基。

3.  权利要求1中提出的用于预防和治疗癌症的药剂，其中所述卤素原子是F或Cl。

4.  权利要求1中提出的用于预防和治疗癌症的药剂，其中所述R₂是CH₃或C₂H₅。

5.  权利要求1中提出的用于预防和治疗癌症的药剂，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺(isonicotinamide)，异烟酰肼(isonicotinohydrazide)，N-甲基烟酰胺，尼可地尔(nicorandil)，吡啶-2-羧酰胺(pyridine-2-carboxamide)，硫代烟酰胺(thionicotin amide)和6-氯烟酰胺。

6.  权利要求1中提出的用于预防和治疗癌症的药剂，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌，子宫癌，食管癌和乳腺癌。

7.  一种预防和/或治疗癌症的方法，其包括给目标受试者施用权利要求1的烟酸衍生物或其药用盐的步骤。

8.  权利要求7中提出的预防和/或治疗癌症的方法，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺，异烟酰肼，N-甲基烟酰胺，尼可地尔，吡啶-2-羧酰胺，硫代烟酰胺和6-氯烟酰胺。

9.  权利要求7中提出的预防和/或治疗癌症的方法，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌，子宫癌，食管癌和乳腺癌。

10.  权利要求1的烟酸衍生物或其药用盐用于制备预防和/或治疗癌症的药剂的应用。

11.  权利要求10中提出的应用，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺，异烟酰肼，N-甲基烟酰胺，尼可地尔，吡啶-2-羧酰胺，硫代烟酰胺和6-氯烟酰胺。

12.  权利要求10中提出的应用，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌，子宫癌，食管癌和乳腺癌。

13.  一种用于激活RUNX3或编码RUNX3的基因的方法，其包括给患有癌症的受试者施用权利要求1的烟酸衍生物的步骤。

14.  权利要求13中提出的方法，其中所述患有癌症的受试者具有脱乙酰基(deacethylated)的RUNX3。

15.  权利要求13中提出的方法，其中所述患有癌症的受试者具有甲基化的编码RUNX3的基因。

16.  权利要求13中提出的方法，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌，子宫癌，食管癌和乳腺癌。

含有烟酸或其衍生物作为有效成分用于预防和治疗癌症的治疗剂
【技术领域】
本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为有效成分，更具体地，本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为有效成分，所述烟酸或其衍生物增强RUNX3基因，一种被甲基化作用灭活的癌症抑制基因的表达，并且通过防止RUNX3蛋白的脱乙酰基作用(deacethylation)抑制RUNX3蛋白的分解而激活所述基因。
【背景技术】
现今，癌症的3种主要治疗方法，为外科手术、化学疗法和放射疗法。并且实际上，正在实行将上述方法与激光治疗等组合的多元方法。考虑到治疗的疼痛或转移的可能性，在它们之中化学疗法是最受期望的。因此，已经研发了各种抗癌药剂并且将它们临床上用于辅助化学治疗。基于选择性杀死活跃分裂的细胞的原理，已经研发了那些药剂。然而，那些药剂不但杀死癌细胞还杀死活跃分裂的正常细胞，诸如免疫细胞、毛囊细胞等，引起严重的副作用，以致长期施用那些药剂是不可行的。因此，基于癌症起因的根本治疗来研发新的抗癌药剂是重要的。
尽管癌基因的激活诱导细胞的异常增殖，但是肿瘤抑制基因抑制细胞的异常增殖，并且有时通过运行细胞死亡程序破坏特异的靶细胞而阻碍肿瘤细胞的产生。即使当在细胞中包含异常激活的癌基因时，通过肿瘤抑制基因的正常作用所述细胞不能长成肿瘤细胞。因此，为了产生肿瘤细胞，癌基因的激活和肿瘤抑制基因的灭活应该在细胞中同时发生。
不恰当的细胞增殖，肿瘤细胞的一种特征，被确定是由癌基因的激活和肿瘤抑制基因的灭活同时引起。特别地，正常细胞中的TGF-β依赖的程序性细胞死亡在抵御肿瘤细胞中起重要作用。此时，肿瘤抑制基因的灭活促进细胞分裂，并且抑制TGF-β依赖的程序性细胞死亡，这导致肿瘤细胞的产生。
引起肿瘤抑制基因灭活的一种关键观点是在CpG岛的异常DNA甲基化作用(Jones和Laird，Nature genet.21，163-167，1999)。在CpG岛中的甲基化作用由DNA甲基化酶诱导。当这样的甲基化作用进行时，MeCP2蛋白结合于甲基化的DNA，导致组蛋白脱乙酰酶(deacethylase)的集中。然后，组蛋白脱乙酰酶移除连接在组蛋白上的乙酰基(acethyl group)，并且因此，周围的DNA结构更加致密，这导致基因表达的抑制。由DNA甲基化作用抑制的基因可以通过DNA甲基化酶抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂的活性而重新表达。
乙酰化作用/脱乙酰基作用不仅在组蛋白中而且在一些转录因子，诸如p53、RUNX3等中发生。例如，当在RUNX3中的乙酰化作用被诱导时，抑制了通过遍在蛋白化作用的蛋白分解作用，但是促进了RUNX3的活性(Jin等.，J.Biol.Chem.2004，279卷，第29409-17页)。即，RUNX3活性的促进由脱乙酰化作用的抑制引起。因此，乙酰化作用/脱乙酰基作用是一种调控蛋白功能的非常重要的机制。
事实上，最近已经报道，RUNX3，其为本发明人早先确定的肿瘤抑制基因，其表达在许多人类癌症中通过DNA甲基化作用而被抑制，例如，按照那些报道，RUNX3的表达在胃癌中60％被抑制(Li QL等.，Cell.2002109(1)：113-24；Oshimo Y.等.，Pathobiology.2004，71(3)：137-43)，在肺癌中25-40％被抑制(LI QL等.BBRC.2004，314(1)：223-8；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，在喉癌中62％被抑制，在乳腺癌中25％被抑制(KimTY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，在胰腺癌中70％被抑制(LiJ等.，JClin Patho1.2004 57(3)：294-9；Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)：2401-7)，在肝细胞癌中73％被抑制(Xiao WH和Liu WW， World JGastroenterol.2004，10(3)：376-80；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，在胆管癌中75％被抑制(Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)：2401-7)，在前列腺癌中23％被抑制(Kang GH等.，J.Pathol.2004，202(2)：233-40；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，和在结肠癌中45％被抑制(Ku JL等.，Oncogene，2004，23，6736-6742)。
另外，证明RUNX3基因的激活显著地抑制肿瘤细胞增殖(Li等.，Cell，109(1)，113-24，2002；Balmain，Nature 417(6886)，235-7，2002)。基于这一证明，用于预防和治疗癌症的药剂的研发已经集中在RUNX3基因激活的研究上。
因此，本发明人尝试找出能够激活RUNX3的因子，所述RUNX3为一种肿瘤抑制基因，其在体内在癌症细胞中被灭活。因此，本发明人发现这样的事实，即，烟酸及其衍生物可以激活被甲基化作用灭活的RUNX3基因，并且增加RUNX3蛋白的量。并且此外，本发明人通过确定烟酸及其衍生物可以有效地用于预防和治疗癌症而完成本发明。
【公开内容】
【技术问题】
本发明的目的是提供含有烟酸或其衍生物作为有效成分用于预防和治疗癌症的药剂，其能够激活RUNX3基因，一种在肿瘤细胞中通过甲基化作用被灭活的肿瘤抑制基因，并且促进源自所述基因的RUNX3蛋白的活性。
【技术方案】
为了实现上述目的，本发明提供用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为有效成分。
在下文中，详细地描述本发明。
本发明提供用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为有效成分。
本发明人期望能够在体内再激活被灭活的肿瘤抑制基因RUNX3的药剂具有抗癌作用。因此，本发明人已经找到一种能够激活RUNX3基因的物质，并且结果已经确定烟酰胺可以激活RUNX3。
本发明人研究，RUNX3，一种肿瘤抑制基因，是否在肿瘤组织中被甲基化，以检验癌症患者中肿瘤发展和甲基化作用的关系。结果，在癌症患者的组织中RUNX3基因常常被甲基化，并且证明显示出RUNX3甲基化的那些患者组具有高比例的癌症复发和转移(参见表1-表3)。
上述结果表明，再激活被甲基化作用灭活的RUNX3是预防癌症发展的一种方法。并且这一想法促使本发明人寻找能够激活RUNX3基因的物质，作为检测阻碍癌症发生和发展的药剂的努力。结果，确定烟酰胺可以再激活被甲基化作用灭活的RUNX3(参见图2)。
还研究了烟酰胺是否能够增加RUNX3蛋白的量。结果，由于RUNX3通过由组蛋白脱乙酰酶诱导的脱乙酰基作用所分解，RUNX3蛋白的量减少，然而，烟酰胺的施用引起RUNX3蛋白乙酰化的增加，这导致所述蛋白的量的增加(参见图3和图4)。
为了确定烟酰胺的体内抗癌作用，在患有由致癌物诱发的癌症的小鼠中观察到肿瘤形成的抑制。本文将N-丁基-N-4-(羟丁基)-亚硝胺(BBN)用作致癌物，并且通过比较被提供以BBN溶液作为饮用水持续20周的小鼠与被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的小鼠之间的肿瘤发生，来分析肿瘤形成的抑制(参见图5和图6)。结果，在BBN处理组，在RUNX3外显子1区域的CpG岛中诱导甲基化，意味着RUNX3的活性被抑制。因此，在所述组中100％发展了膀胱癌，并且它们中80％为浸润癌和23％为浅表癌。与之相反，在BBN和烟酰胺处理组中，在RUNX3外显子1区域的CpG岛中，甲基化作用被显著地减少，这导致膀胱癌发生的减少(58％)，并且癌症的恶性也减少了。因此，它们中只有23％为浸润癌，并且它们中77％为浅表癌。上述结果表明，烟酰胺抑制由BBN引起的RUNX3的灭活，这表明它可以抑制BBN引起的肿瘤发生。
从上述结果，证实本发明的烟酰胺可以再激活被甲基化灭活的RUNX3，并且因此显著地抑制肿瘤生长。
按照上述结果，发现肿瘤抑制基因RUNX3，事实上，在各种人类癌症，诸如胃癌、肺癌、喉癌、乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管癌、前列腺癌、结肠癌等中，通过甲基化作用被灭活(Li QL等.，Cell.2002109(1)：113-24；Oshimo Y.等.，Pathobiology.2004，71(3)：137-43)；LI QL等.BBRC.2004，314(1)：223-8；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84；Li J等.，J Clin Pathol.2004 57(3)：294-9；Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)：2401-7；Xiao WH和Liu WW World J Gastroenterol.2004，10(3)：376-80；Kang GH等.，J.Pathol.2004，202(2)：233-40；Ku JL等.，Oncogene，2004，23，6736-6742)，并且证明RUNX3基因的激活显著地抑制癌细胞的增殖(Kim等.，Lab Invest.84(4)，479-84，2004；Wada等.，Oncogen，23(13)，2401-7，2004；Li等.，Biochem Biophys Res Commun，314(1).223-8，2004；Li等.，Cell，109(1)，113-24，2002；Li等.，Cell，109(1)，113-24，2002；Balmain，Nature，417(6886)，235-7，2002)。因此，本发明的包含烟酸或其衍生物作为有效成分的药物组合物，可以再激活RUNX3基因，因此所述组合物可以有效地用于预防和治疗许多由RUNX3的灭活所诱导的癌症，例如胃癌、肺癌、肝细胞瘤、喉癌、结肠直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌或乳腺癌。
烟酸或其衍生物可以用作本发明用于预防和治疗癌症的药剂的有效成分，并且所述烟酸衍生物可以包括烟酰胺、烟酸、6-氨基烟酰胺、异烟酰胺、异烟酰肼(isonicotinohydrazide)、N-甲基烟酰胺、尼可地尔(nicorandil)，吡啶-2-羧酰胺(pyridine-2-carboxamide)、硫代烟酰胺(thionicotin amide)或6-氯烟酰胺。
本发明的含有烟酸衍生物作为有效成分的药物组合物可以口服或肠胃外给药，并且可以以药物制剂的一般形式应用。
本发明的药物组合物可以通过与通常所用的填充剂、补充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、稀释剂诸如表面活性剂或赋形剂混合而制备，用于口服或肠胃外给药。用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、扑粉、颗粒剂和胶囊。这些固体制剂通过将一种或多种适当的赋形剂，诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合进行制备。除了所述简单的赋形剂之外，可以应用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为混悬液、溶液、乳剂和糖浆，并且上文提到的制剂除了含有通常所用的简单的稀释剂，诸如水和液体石蜡之外，可以包含各种赋形剂，诸如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂为无菌水性溶液、水不溶性赋形剂、混悬液、乳剂和栓剂。水不溶性赋形剂和混悬液除了含有一种或多种活性化合物之外，可以含有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的酯，如油酸乙酯(ethylolate)，等。除了一种或多种活性化合物之外，栓剂可以包含witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂精脂，甘油胶冻(glycerogelatin)等。
本发明的烟酸衍生物的有效剂量为1～50mg/kg，并且更加优选地10～30mg/kg，并且给药频率为每天1～3次。
在小鼠中进行用烟酸衍生物进行的急性毒性测试。在用烟酸衍生物处理的组中，直到2g/kg的剂量，没有观察到任何变化，并且，与仅施用水的组相比较，也没有观察到任何显著的副作用。
本发明还提供对于癌症的预防和/或治疗方法，其包括将烟酸衍生物施用给目标受试者的步骤。本发明还提供将烟酸衍生物用于制备预防和/或治疗癌症的药剂的应用。
【附图描述】
图1A是显示通过PCR证实RUNX3基因在正常组织中没有被甲基化的电泳照片，，
M：甲基化的DNA    U：未甲基化的DNA
图1B是显示通过PCR证实RUNX3基因在膀胱癌组织中被甲基化的电泳照片，，
M：甲基化的DNA    U：未甲基化的DNA
图2是显示通过烟酰胺处理将甲基化的RUNX3激活的电泳照片，
图3是显示通过组合组蛋白脱乙酰酶(Sirt2)将RUNX3蛋白的量减少的照片，
图4是这样的照片，其显示，由组蛋白脱乙酰酶(Sirt2)引起的RUNX3蛋白的减少与RUNX3乙酰化作用的抑制相关，并且相反地，细胞内RUNX3蛋白的乙酰化和由此导致的RUNX3蛋白的增加是由施用烟酰胺诱导的，
图5是由肉眼观察到的膀胱癌组织的照片，其显示在被提供以一种致癌物质N-丁基-N-4-(羟丁基)-亚硝胺(BBN)溶液作为饮用水持续20周的组，与被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的另一组之间肿瘤发生的比较，
图6A是显示被提供以BBN溶液，一种致癌物质，作为饮用水持续20周的小鼠的膀胱组织的显微照片，
图6B是显示被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的小鼠的膀胱组织的显微照片。
【最佳方式】
本发明实用的和目前优选的实施方案如在下述实施例中所显示的那样进行举例说明。
然而，应该理解，考虑到本发明公开内容，本领域的那些技术人员可以在本发明的精神和范围之内进行各种更改和改进。
<实施例1>RUNX3甲基化和肿瘤发生之间的相互关系
为了确定RUNX3基因在癌症患者组织中是否被甲基化，提取膀胱癌患者的组织并且研究其中的甲基化。具体地，从正常膀胱组织和膀胱癌组织中提取基因组DNA，然后将其纯化，接着用3M NaSO₂(重亚硫酸钠，(sodium bisulfite))在50℃处理16小时。在上述处理过程中，DNA中的胞嘧啶变成未被甲基化的尿嘧啶。
处理之后，再次纯化DNA。然后，应用基于RUNX3基因组DNA的CpG岛的序列制备的两组引物进行PCR；由SEQ.ID.No 1和SEQ.ID.No2组成的一组引物用于扩增甲基化的DNA，由SEQ.ID.No 3和SEQ.ID.No 4组成的另一组引物用于扩增未甲基化的DNA。PCR按下述进行；94℃变性14秒，60℃退火50秒，72℃聚合58秒，从变性到聚合进行40个循环。
应用上述引物的PCR可以确定RUNX3基因是否被甲基化灭活。如果DNA是用引物组SEQ.ID.No 1和SEQ.ID.No 2扩增的，那么意味着RUNX3被甲基化灭活。同样地，如果DNA是用引物组SEQ.ID.No 3和SEQ.ID.No 4扩增的，那么意味着RUNX3没有被甲基化。
如在图1中所示，在从20名正常个体中提取的正常膀胱组织中的RUNX3基因的启动区，没有观察到甲基化作用。同时，在膀胱癌患者组织中观察到74％的甲基化作用(119名个体中有88名)。关于膀胱癌复发率，在他们的癌组织中使得RUNX3基因未被甲基化的患者显示出61.11％的复发率，而那些在他们的癌组织中使得RUNX3基因被甲基化的患者显示出88％的复发率。即，在那些具有甲基化的RUNX3基因的患者中，癌症复发的机会是很高的(表1)。
【表1】
RUNX3甲基化和癌症复发率之间的相互关系