芦荟内脂在制药中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种化合物芦荟内脂5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮的用途，尤其是在制药领域中的用途。
背景技术
芦荟内脂Synonym：5-hydroxy-6-octen-4-olide，Aloelactone 5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮为一已知化合物，1969年，Evans Jr，RH，Ellested GA andKunstann MP在《Tetrahedron Lett.》杂志上首次报导从一株未鉴定的黑孢霉菌培养液分离得到5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮化合物。在国际通用的hdsch软件化合物库中检索，显示如下：名称：5-羟基-6辛烯基-4-脂(5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮)，化合物注册编号：23790-99-0，分子式：C8H12O3，分子量：156.08。但公开文献中并未报道芦荟内脂的用途。1996年，Zeeck，A.及Burkhardt，K.等人，在抗生物活性杂志《J.Antibiot.》上，报导了上述化合物对部分病原细菌有抗性作用，1998年，Fukushima，T.等人，植物化学《Phytochemistry》上，报导了在含有上述化合物与其他2种内脂化合物的培养液对温室植物病害有预防作用。
【发明内容】
本发明的目的在于提供芦荟内脂的新用途，即在制药中的新应用。
本发明涉及芦荟内脂作为制备治疗抗皮肤真菌的药中的应用。
本发明涉及芦荟内脂作为制备治疗抗肿瘤的药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用芦荟内脂的药理试验及结果来说明其在制药领域中地新用途。
一、经动物(小鼠)灌胃及注射急性毒性试验，证明本化合物使用安全。
二、抗皮肤真菌活性
供试样品：单体化合物芦荟内脂，提取分离自云南元江芦荟植物元江黑孢菌的发酵产物。
样品数量：5mg。
试剂：二甲基亚砜Dimethy Sulfoxide (CH3)2SO4 国产(CP)
培养基：固体沙孢弱培养基；PDA液体培养基
方法1：用无菌水洗下星型石膏样毛癣皮肤真菌孢子，制成孢子悬液，取0.5ml孢子悬液于固体沙孢弱培养基平皿上涂皿，将无菌钢管—即牛津杯置于平板培养基上，加入浓度为1mg/ml二甲亚砜溶解的芦荟内脂单体化合物0.2ml，置于28℃±2℃培养72h，抑菌圈直径达到45mm。说明芦荟内脂单体化合物对星型石膏样毛癣皮肤真菌(Trichophyton gypseum astenides)具有很强的抑制生长活性。
方法2：在5ml含有5％浓度的毛癣皮肤真菌孢子液体(PDA)培养基中，加入芦荟内脂单体化合物，置于28℃±2℃静止培养72h后，观查化合物对皮肤真菌星型石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum astenides)的抑制生长情况。结果显示，加入剂量150-200ug/ml时，芦荟内脂单体化合物对星型石膏样毛癣菌生长抑制率达到80-90％范围内。
三、抗肿瘤活性
就芦荟内脂单体化合物，采用细胞学培养方法，观察该单体化合物对供试肿瘤细胞生长的抑制作用。
1、材料
1.1供试样品：单体化合物芦荟内脂。
1.2样品数量：5mg。
1.3试剂
二甲基亚砜Dimethy Sulfoxide (CH3)2SO4 国产(CP)
EDTA乙二胺四乙酸ethylene diamietetraacetic acid(国产)
三蒸馏水，蒸馏水重蒸2次。
新生牛血清Newborn Calf Serum，NCS，美国HyClone-PIERECE公司提供。
胰蛋白酶(1∶250)猪胰蛋白酶干粉，美国HyClone-PIERECE公司提供。
0.25％的胰蛋白酶溶液：含有0.5g/L猪胰蛋白酶(1∶250)溶于三蒸馏水，同时加入0.5mM的EDTA试液1ml，-20℃保存。
1.4细胞培养基(美国HyClone-PIERECE公司提供)：
DMEM低糖Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium。
Low Glucose；RPMI-1640，含有L-谷氨酰胺2.05mM；不含碳酸氢钠；含酚红。
2、细胞系
MolT-4 白血病淋巴细胞 悬浮培养
K-562 骨髓白血病淋巴细胞 悬浮培养
CA 人肝癌细胞贴壁培养 贴壁培养
HAS-84 人肺癌细胞贴壁培养 贴壁培养
HSC 人胃癌细胞贴壁培养 贴壁培养
上述细胞系由中国科学院典型培养物保藏委员会，中科院昆明动物研究所细胞库提供。
3、方法
3.1样品处理
取供试样品5mg，加入2.5ml二甲基亚砜溶解，制成含量2000ug/ml供试液。根据国际抗肿瘤活性检测标准原则，供试样品最终稀释剂量为10ug/ml。
3.2细胞培养
在无菌操作条件下，MolT-4、K-562悬浮肿瘤细胞及CA人肝癌贴壁细胞37℃培养48hr，每24小时计算细胞生长数量。
4、观察
分别记录24hr-48hr期间细胞生长情况，同时检测细胞数量。
5、结果
按照中华人民共和国医药管理局“新药(西药)临床前研究指导原则”中化合物IC50≤10ug/ml判为有效的规定评价标准。芦荟植物内生真菌单体化合物芦荟内酯对MolT4白血病淋巴细胞、K562骨髓白血病淋巴细胞以及CA人肝肿瘤细胞生长抑制作用的实验表明，以10ug/ml剂量，芦荟内酯化合物对上述3种肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用。其中，对CA人肝脏肿瘤细胞生长的抑制率为65.67％；MolT4白血病淋巴细胞生长的抑制率是62.50％；而K562骨髓白血病淋巴细胞生长的抑制率60.25％。
本发明的优点在于：
1、本发明对已知化合物芦荟内脂发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明的芦荟内脂安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
3、本发明的芦荟内脂可从多种渠道获得，如：1979年，Asaaka，M.等人在日本化学公报《Bull.Chem.Soc.Jpn.》上，报导了采用化学人工方法合成了5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮化合物；也可由微生物途径获得。
4、本发明的芦荟内脂配制成的药物可为多种剂型，如：口服胶囊剂、片剂型、皮肤用剂、软膏剂型等。
【具体实施方式】
实施例1：
芦荟内脂的提取：取元江黑孢菌(Nigrospora yuanjiangensis sp.nov.Chenet Yin)作为发酵获取芦荟内脂化合物的出发菌株，以马铃薯培养基(PDA)为发酵基质。采用液态发酵技术，收集发酵液置容器内。按发酵液与乙酸乙酯溶剂1∶4比例(v/v)萃取发酵液，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩得到芦荟内脂粗提物。取芦荟内脂粗提物适量，采用国产硅胶(Silica)进行第1次柱层析分离，以溶剂氯仿-甲醇(95∶5)洗脱得到分离物F1、F2、F3。取浓缩分离物F2进行第2次硅胶柱层析分离，以溶剂氯仿-丙酮(8∶2)洗脱得到含有芦荟内脂的混合物H1、H2。再取浓缩混合物H2进行第3次硅胶柱层析分离，以溶剂石油醚-乙酸乙酯(6∶4)洗脱后，浓缩挥弃溶剂即得芦荟内脂[(5-(1-羟基-2-丁烯基)-二氢呋喃-2-酮)]。
片剂的制备：片剂成分为芦荟内脂、二甲基亚砜(DMSO)、可溶性淀粉、硬脂酸镁和羟丙基甲基纤维素(HPMCP)。首先按规格、剂量要求用二甲基亚砜(DMSO)对芦荟内脂进行溶解，其余原料粉碎过筛，称量待用。将定量溶解的芦荟内脂和可溶性淀粉倒入混合机充分混合均匀，加入80％药用乙醇作为湿润剂，继续混合至16-18目筛的颗粒机进行制粒形成片芯，然后将片芯置60℃下干燥。干燥后的片芯加入硬脂酸镁及羟丙基甲基纤维素(HPMCP)6-9％的乙醇溶液，混合均匀后，采用压片机进行压片即成。
实施例2：
由已知方法提取芦荟内脂。
胶囊的制备：按剂量要求，先取芦荟内脂一定量，溶解于适量的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中；同时对环状糊精(或淀粉)原料进行粉碎过筛，称量备用。将溶解于二甲基亚砜的芦荟内脂、3-5％甘油乙醇溶液及环状糊精(或淀粉)投入混合机内混合均匀，60℃下干燥，取出后过80目孔筛。以2号或3号规格硬胶囊，采用自动胶襄充填机，将一定量的芦荟内脂及辅料制成均匀的粉末充填于空心胶囊中制成。
实施例3：
由已知方法提取芦荟内脂。
皮肤用剂的制备：芦荟内脂皮肤用剂涂敷皮肤表面，在局部发生作用以防治皮肤真菌疾患。称取芦荟内脂单体化合物10克，并溶解于二甲基亚砜(DMSO)50ml甲醇溶液中，室温下缓慢搅拌使其充分溶解，得到溶解液A。称取羟乙基纤维素(HEC)25克，另取一容器中加入无菌水250ml，在低速搅拌下加入羟乙基纤维素，搅拌至所有物料完全湿透，得到羟乙基纤维素溶解液B。再取一容器中加入水200ml，加热至80-90℃，在不断搅拌下慢慢加入甲基纤维素(MC)10克，所形成的淤浆，经降温冷却后，得到溶解液C。将溶液A、B、C溶液A、B、C混合于容器内，搅拌均匀后，又取丙二醇1.0克，尿素0.5克加入混合A、B、C溶解液中，溶解即为抗皮肤真菌芦荟内脂皮肤用剂。
此方法制备的芦荟内脂皮肤用剂，可引起皮肤屏障变化或改变毛囊和皮脂腺途径，减低皮肤对渗透的阻力，起到防治皮肤真菌疾病的较好作用。
实施例4：
芦荟内脂的提取同实施例1。
软膏剂的制备：取实施例3中的芦荟内脂皮肤用剂100ml，按重量/体积百分比计算，加入凡士林0.8-1.0％；植物油0.2-0.4％；氮酮1.0-1.5％；聚乙二醇0.3-0.5％；羊毛脂2-5％，水浴加热溶化后，混合搅拌均匀即为芦荟内脂软膏剂。此外，以0.1-0.2mg/剂量的芦荟内脂加入1％氟脲嘧啶丙二醇溶液和5％的氟脲嘧啶软膏同样具有很好的抗皮肤真菌的效果。