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本发明涉及一种可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L－苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物，其中L－苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1－1500∶1－100。实验证明，(1)能够显著刺激软骨细胞的生长，从而可促进软骨的生长和修复；(2)大鼠骨关节炎模型的研究结果显示可以减轻关节软骨的损害，预防和治疗骨性关节炎；(3)抑制破骨细胞的骨吸收作用，刺激成骨细胞的生长，增加I型骨胶原的合成；(4)促进骨血管再生、增殖和改善骨血液循环，(5)提高骨密度，增加骨钙化程度和韧性，增加骨折断的受力强度和做功的能量；(6)用本发明的组合物治疗股骨头坏死，也取得了非常好的疗效。

1、  一种用于预防和/或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松症或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1-1500∶1-100。

2、  根据权利要求1的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1.5-1000∶1-70。

3、  根据权利要求1的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为2.5-6∶1-2.5。

4、  根据权利要求1的组合物，进一步包括维生素D3，其中L-苏糖酸钙∶大豆异黄酮∶维生素D3的重量比为1-1500∶1-100∶0.000125-0.00125，优选为1.5-1000∶1-70∶0.00025-0.00075，更优选2.5-6∶1-2.5∶0.000375-0.0005。

5、  根据权利要求1-4中任一项的组合物，还包括药学可接受的载体或稀释剂或常用添加剂。

6、  根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的1-95％。

7、  根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的10-90％。

8、  根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的50-90％。

9、  根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的70-90％。

10、  根据权利要求1的组合物，其中所述组合物以片剂、胶囊、口服液、颗粒剂的形式存在。

一种含有L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物
发明领域
本发明涉及一种含有L-苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物，尤其可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L-苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物。
背景技术
骨性关节炎是指可动关节由于关节软骨退行性改变和在关节表面、边缘形成新骨为其特征的内在的非炎症性疾病。软骨的变化最为显著，关节软骨发生软化，失去正常弹性，暴露软骨的胶原纤维，在关节活动时发生磨损。软骨深层发生裂隙，关节软骨失去其原来的蓝白色和光滑的色泽，而变成暗黄和颗粒状。磨损最大的关节面上的软骨被擦去，使软骨下骨显露。临床以关节的疼痛肿胀、功能障碍为主。此外，由此增生的骨赘压迫刺激周围神经、血管，引起肢体麻木疼痛，如颈椎病、腰椎管狭窄等，更给患者带来巨大痛苦。骨关节炎的发生与肥胖、骨密度、外伤和力的承受以及遗传因素有关。关节软骨由1-2mm厚度的胶原纤维、糖蛋白、透明质酸酯聚集而成，通过水合作用起垫子的作用，主要吸收和分散所承受的负重和机械力量，在生理状况下，关节软骨依靠关节周围肌肉的收缩及软骨下的骨质来完成上述任务。当二者出现问题时，例如软骨下骨质有异常如老年性退行性变、骨质疏松等或肌肉承受了过多的压力如肥胖、外伤等，就导致了软骨的损伤，从而可能发生骨性关节炎。这里值得一提的是骨密度，当软骨下骨小梁变薄、变僵硬时，其承受压力的耐受性就减小，因此在骨质疏松者发生骨性关节炎的机率就增多。
骨性关节炎的预防或治疗，其重要的一个方面就是通过促进关节软骨的生长和修复，最终达到预防和治疗的目的。目前，各种抗炎药物对骨性关节炎的症状具有一定的缓解作用，如减少疼痛等，从治本的角度讲，仍无更有效的方法。本发明的组合物可通过刺激软骨细胞的生长，增强骨胶原的合成从而达到预防和治疗骨性关节炎的作用。从本组合物对骨关节炎大鼠模型的治疗中可见证这一点。
骨质疏松症是骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女的绝经)等比例的减少、骨组织显微结构发生变化，使骨的正常荷载功能发生变化，骨密度降低，骨折危险明显增大、伴有周身骨骼疼痛和体态变化的一种疾病。骨质疏松的发生机制比较复杂，骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞的功能起着关健性的作用，增加成骨细胞的数量和功能、抑制破骨细胞的功能是预防和治疗骨质疏松的重要手段，因为成骨细胞及破骨细胞两者共同作用，决定了骨骼中骨小梁的生长，骨盐矿架结构的形成，骨胶原的合成及包括钙元素在内的矿物质的沉积。缺钙是骨质疏松的一种表现，但单纯补钙不能解决骨质疏松的主要原因是人类骨骼衰老所致，具体说是因为骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞功能的退化所致。因此，治疗或预防骨质疏松的关健是通过影响骨细胞使骨细胞减缓退化或衰老，促进成骨细胞、抑制破骨细胞。
从目前来看，社会上预防和治疗骨质疏松的物质主要有以下三类，一是二磷酸盐类，以抑制破骨细胞为主，如阿伦磷酸钠等；二是激素类，如雌激素或降钙素等，有刺激成骨细胞或抑制破骨细胞的作用。三是补钙剂，比如碳酸钙等，钙是骨骼的主要成分之一，骨质疏松的症状之一就是缺钙，但骨骼对钙的吸收及利用是要通过骨细胞的作用，因此单纯补钙效果不好。本发明中的组合物通过刺激成骨细胞的生长同时抑制破骨细胞的作用，来达到预防和治疗骨质疏松的目的，相关的基础研究及整体动物模型研究很好地说明了这一点。
股骨头坏死多由于股骨颈骨折后，股骨头的血液供应发生障碍所致。目前主要的治疗方法还只是手术治疗，药物或其它物质治疗股骨头坏死的效果均不好，本组合物对骨骼及关节软骨地生长和修复有明显的作用，同时可促进骨骼血管的重建及生长，从而可改善骨骼局部的血液循环，减少或减缓股骨头坏死的发生率。
发明内容
发明人发现，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮作为一种组合物使用，具有以下几方面的作用：(1)能够显著刺激软骨细胞的生长，增加软骨细胞的数量，同时促进II型骨胶原的合成，从而可促进软骨的生长和修复；(2)大鼠骨关节炎模型的研究结果显示可以显著改善骨性关节炎模型大鼠的各种病理表现，减轻关节软骨的损害，预防和治疗骨性关节炎；(3)抑制破骨细胞的骨吸收作用，刺激成骨细胞的生长，增加I型骨胶原的合成，调节人体激素水平；(4)促进骨血管再生、增殖和改善骨血液循环，(5)可以提高骨质疏松模型大鼠的血钙水平，降低AKP水平，提高骨密度，骨钙含量，增加骨钙化程度和韧性，增加骨折断的受力强度和做功的能量，(6)该组合物在以上方面与L-苏糖酸钙组比较，效果明显，证实了二者具有协同作用。(7)用本发明的组合物治疗股骨头坏死，也取得了非常好的疗效。基于这些发现，实现了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的的含有L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物。
在本发明的组合物中，L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1-1500∶1-100，优选为1.5-1000∶1-70，更优选2.5-6∶1-2.5。本发明的组合物可以任选包括药学可接受的载体或稀释剂或常用添加剂，如香味剂，甜味剂等。L-苏糖酸钙与大豆异黄酮二者在组合物中的含量优选为10-100wt％，更优选30-95wt％，还更优选50-90wt％。
根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的组合物还含有适量的维生素D3，其中L-苏糖酸钙∶大豆异黄酮∶维生素D3的重量比为1-1500∶1-100∶0.000125-0.00125，优选为1.5-1000∶1-70∶0.00025-0.00075，更优选2.5-6∶1-2.5∶0.000375-0.0005。
本发明的组合物可以制成常用剂型，例如片剂，胶囊，颗粒剂，口服液等。制备本发明的组合物的方法为常规方法，这些方法对于本领域的技术人员来说是公知的。
在本发明的单位剂型中例如可以包括大豆异黄酮10-300mg，苏糖酸钙10-100mg(按钙元素计)，50-500IU维生素D3。日用量可以是1-6个单位剂型，优选1-3个单位剂型。
以下通过实施例来说明本发明。应该理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，不限制本发明的范围。
实施例
实施例1                 片剂的制备(1000片)
苏糖酸钙                775g
大豆异黄酮              50g
预胶化淀粉              130g
糊精                    15g
甜味剂                  10g
香精                    6g
微晶纤维素              80g
聚乙烯吡咯烷酮          18g
羧甲基纤维素            80g
硬脂酸镁                1.6g
上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例2             口服液的制备
大豆异黄酮          8.5g
L-苏糖酸钙          23.7g
蔗糖                88.5g
柠檬酸              9.46g
阿斯巴甜            4.3g
山梨酸钾            0.18g
上述物质加水至1000毫升，加热溶解，加入香精，搅拌均匀，分装到灭菌的瓶中，包装即可。
实施例3             胶囊的制备
L-苏糖酸钙          294g
大豆异黄酮          153g
将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
实施例4             片剂的制备(1000片g)
苏糖酸钙            775g
大豆异黄酮          50g
维生素D3            200IU
预胶化淀粉          130g
糊精                15g
甜味剂              10g
香精                6g
微晶纤维素          80g
聚乙烯吡咯烷酮      18g
羧甲基纤维素        80g
硬脂酸镁            1.6g
上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例5             胶囊的制备
L-苏糖酸钙          294g
大豆异黄酮          153g
维生素D3            200000IU
将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
一、本发明组合物对骨性关节炎的疗效的动物试验
骨性关节炎是指可动关节由于关节软骨退行性改变和在关节表面、边缘形成新骨为其特征的内在的非炎症性疾病。临床以关节的疼痛肿胀、功能障碍为主。此外，由此增生的骨赘压迫刺激周围神经、血管，引起肢体麻木疼痛，如颈椎病腰椎管狭窄等，更给患者带来巨大痛苦，本病在中老年人群中十分常见。
材料和方法
1材料
试验动物：新生Wistar大白鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)
试剂：
DMEM高糖培养基，胰蛋白酶，II型胶原酶，抗坏血酸，Phalloidin-DexasRed，Tubulin抗体，II型胶原蛋白抗体，甲苯胺蓝，BMP，IGF-I，TGF-β抗体，HRP-IgG，FITC-IgG，亚甲基蓝，DAB，OPD，RNA提取试剂盒
仪器：
全自动生化分析仪  荧光显微镜，相差倒置显微镜，二氧化碳培养箱，低温离心机，电子天平，酶标仪，透射电子显微镜
2方法
(1)骨性关节炎动物模型的建立
a骨性关节炎模型制作
取出生7-8天的Wistar大白鼠，切除尾巴和双侧前肢，造成双后肢大鼠。具体操作：以手术缝合线自双前肢肱骨中段及尾部结扎，消毒后，距结扎处2mm剪除远端，电凝止血，不需包扎，放回窝内，交母鼠喂养，三个月后可形成典型的骨性关节炎模型。
b实验分组
正常对照组10只(A)，双后肢组24只(模型对照组B)，服用L-苏糖酸钙双后肢组24只(C)，服用大豆异黄酮双后肢组24只(D)，和服用L-苏糖酸钙+大豆异黄酮双后肢组24只(E)。
B、C、D和E组于出生一周造成双后肢大鼠模型，5组动物在同等条件下饲养，断奶后自由饮水，喂混合饲料。但B、C、D和E组水及食物放置较高，以促其直立。
c给药处理
大鼠离乳后，开始持续灌胃给药至取材。C组L-苏糖酸钙0.77g/kg/d，D组大豆异黄酮0.3g/kg/d，E组L-苏糖酸钙0.60g+大豆异黄酮0.10g/d。
(2)软骨组织观察
取材与病理切片的制作：
腹腔注射麻醉处死动物后，取一侧后肢股骨头于10％甲醛内固定2周，脱钙4周，常规脱水，二甲苯透明。石蜡浸透包埋。切片厚约6μm。股骨上端切片取自圆韧带前后200μm内的冠状面切片。均顺骨小梁方向纵切。
观察方法：
通过光学显微镜对各模型组与对照组大鼠不同阶段的股骨头关节软骨变化进行观察。
(3)电镜观察
腹腔注射麻醉处死动物后，取一侧后肢股骨头固定，2％多聚甲醛和2％戊二醛混合液，在4℃下前固定1小时；磷酸缓冲液在4℃下浸洗样本2小时，其间换液2次；室温下，用1％四氧化锇溶液浸泡1小时，进行后固定。采用阶梯丙酮脱水，树脂包埋。37℃聚合12小时；45℃聚合12小时；60℃聚合12小时。修整包埋块，超薄切片：切片厚度约600埃。醋酸铀饱和酒精溶液和枸橼酸铅进行超薄切片双重染色。在电镜下进行观察。
(6)大鼠软骨细胞体外培养方法
取新生3-4天Wistar大白鼠关节软骨，剪成1cm左右的组织片，加入0.25％胰酶37℃消化30分钟，弃去上清液，再加入0.1％胶原酶37℃消化30min两次，取未消化的组织片，加入含10％小牛血清，50μg/ml抗坏血酸的高糖DMEM培养基，5％CO₂，37℃培养。待细胞长满成单层状时传代，取3-4代细胞进行实验。
取样进行甲苯胺蓝、II型胶原蛋白染色鉴定。
将细胞随机分为：L-苏糖酸钙(100μg/ml)组，大豆异黄酮组(60μg/ml)，L-苏糖酸钙(70μg/ml)+大豆异黄酮组(30μg/ml)。
L-苏糖酸钙对软骨细胞的作用
亚甲基蓝染色法测得软骨细胞密度：培养细胞传代后培养于24孔板中；将待测细胞青春培养基，PBS清洗干净；200μl 4％多聚甲醛(PBS液配制)固定30min；1ml PBS(0.01M，PH7.4)清洗三次，然后用100μl 1％亚甲基蓝染色10min；1ml的硼酸盐缓冲液(PH8.4)反复清洗，至清洗液无色；5ml 0.1NHCl脱色15min，取脱色液在662nm处测OD值。
免疫细胞化学染色法检测II型胶原蛋白：将细胞培养于玻璃片上，取细胞生长至汇合的片子，用pH7.4 PBS缓冲液洗2次；室温下以3.7％多聚甲醛固定过夜；PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；1％牛血清蛋白BSA作用30min，于湿盒中封盖；一抗孵育2小时(室温，避光)；PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；二抗孵育1小时(室温，避光)；OPD法显色，酶标仪比色测定OD值，片子清洗后以亚甲蓝法染色，酶标仪测定OD值。
结果
L-苏糖酸钙+大豆异黄酮对整体模型大鼠骨性关节炎的作用
1骨性关节炎大鼠组织学变化
骨性关节炎的病理表现主要为：1关节软骨面表层变薄。2中深层出现大量骨髓组织与骨样组织。3软骨下骺软骨板先是变薄并可见骨样组织贯通，继而则增生变厚。4软骨下骨质增厚。5软骨细胞排列紊乱，中、深层可见软骨细胞簇。
本实验结果显示：正常对照组(A)：在13周时，关节软骨厚，细胞密度大，偶见骨样组织侵驻，骺骨板厚，细胞柱内细胞丰富，细胞柱排列紧密。18周时，关节软骨略有变薄，细胞略小，软骨膜层稍有变薄，偶见骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板完整，细胞丰富。23周时，关节软骨中度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量中等，个小，骨髓及骨样组织侵入较多，骺骨板破损，细胞较大。28周时，关节软骨中度变薄，细胞量减少，个中等或较小，软骨膜层几乎消失。软骨中深层广泛出现骨髓及骨组织，骺骨板破损。
模型对照组(B)：13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨中等变薄，细胞略少，个小。软骨膜层变薄，软骨中深层广泛出现骨髓及骨组织，骺骨板破损，有骨样组织贯通。23周时，关节软骨变薄，细胞量少，个小。软骨中深层广泛出现中至大量的骨髓及骨组织，骺骨板消失，28周时，关节软骨变得非常薄，细胞少且小，软骨膜层消失，软骨中深层出现大量骨样组织，骺骨板消失。
大豆异黄酮组：13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。骨样组织与骨髓组织侵入较少，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨重度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵入至软骨中深层，骺骨板消失。28周时，关节软骨重度变薄，细胞量少而个中等或较小，软骨膜层消失，软骨中深层出现较多骨组织。
L-苏糖酸钙组：13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。偶有骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨重度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵驻贯通，骺骨板消失。28周时，关节软骨中度变薄，细胞量少而个中等或较小，软骨膜层几乎消失，软骨中深层出现广泛出现骨髓和骨组织。
L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组：13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。偶有骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵驻贯通，骺骨板破损。28周时，关节软骨薄，细胞量稍减少，个中等或较小，软骨膜层稍薄，软骨中深层广泛出现骨髓和骨组织，其中骨髓样组织较多。
从以上结果可以看出L-苏糖酸钙组，大豆异黄酮组和L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组明显优于对照模型组，而L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组优于L-苏糖酸钙组和大豆异黄酮组。
本发明组合物对大鼠软骨细胞的作用
表1  药物对软骨细胞增殖的作用  单位：OD平均值，n＝4