一组抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其应用 【技术领域】
本发明涉及一组抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其应用。
背景技术
近两年的研究结果证实短的双链RNA在多种哺乳动物细胞中具有干扰RNA功能，可以特异抑制特定基因在细胞内的表达。通过该途径也可抑制病毒(包括HIV病毒)基因在细胞内的表达。但是由于HIV病毒具有极大的变异性，目前所使用的序列均只与少数HIV株序列同源，因此不能作为普遍有效的基因治疗药物使用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一组抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸序列的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下设计方案：
一组抗HIV感染及防治艾滋病的RNA序列及其片段，该组RNA序列如下：
(1)aucaaugaggaagcugcagaaugg；
(2)gggaagugacauagcaggaacuacuag；
(3)uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu；
(4)uaugggguaccugugugga；
(5)gccaauucccauacauuauugugc；
(6)uuaaauggcagucuagcagaa；
(7)accacacacaaggcuacuucccugau；
(8)acagccgccuagcauuucaucac；
(9)ggauggugcuucaagcuaguaccaguu。
一组由所述的RNA序列及其片段和与之互补的序列杂交形成的双链RNA序列。
一组由所述地RNA序列及其片断在其5’端或3’端加核苷酸修饰的序列。
一组所述的RNA序列及其片段和与之反向互补的序列加上中间非互补连接序列形成的发夹样RNA双链。
一组所述序列对应的DNA序列。
包含所述的RNA序列的表达载体。
包含所述的DNA序列的表达载体。
包裹所述的RNA序列的脂质体。
包裹所述的DNA序列的脂质体。
包裹所述的表达载体的脂质体。
将权所述的RNA序列在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的DNA序列在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的表达载体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
所述的RNA序列及其片段用于制备抗HIV感染及艾滋病诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的DNA序列及其片段用于制备抗HIV感染及艾滋病诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的表达载体用于制备抗HIV感染及艾滋病诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的脂质体用于制备抗HIV感染及艾滋病诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的方法用于制备抗HIV感染及艾滋病诊断、治疗和预防的药物的应用。
本发明的优点是：通过同源比较，获得一系列与所有已经发表的HIV序列高度同源的RNA序列片段，使用该系列片段衍生的双链RNA序列可以有效地抑制HIV基因的表达；使用质粒转录的该系列RNA也可在细胞内抑制HIV基因的表达；携带该片段对应DNA腺病毒伴随病毒感染细胞后可以转录出对应的双链RNA并抑制HIV基因的表达。
【附图说明】
图1为报告质粒pEGFP-gp120的构建图。
图2为通过荧光显微镜检测的双链干扰RNA可以降低EGFP-HIV gp120融合蛋白的表达图。
图3为通过Western-Blot检测的双链干扰RNA可以降低EGFP-HIV gp120融合蛋白的表达图。
图4为表达内部双链RNA的质粒p-H1-gp120i的构建图。
图5为质粒pAAV-120i的构建图。
图6为通过荧光显微镜检测的携带可转录HIV gp120发夹样双链RNA的重组AAV病毒可抑制GFP-GP120融合蛋白的表达图。
【具体实施方式】
实施例中采用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。
实施例1：极度保守HIV RNA序列的获得
选择已经发表的HIV1典型序列，按功能基因分成每个约70个核苷酸(nt)的片段；每一个片段用NIH(美国国立卫生研究院)提供的BLAST软件(BLASTN 2.2.4/2.2.5)在英特网上分析其在GenBank(NCBI，美国国家生物技术信息中心)，EMBL(欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库)，DDBJ(日本DNA数据库)及GDB(基因组数据库)不少于14万个核苷酸序列中的同源序列；选择出符合以下条件的核苷酸序列：(1)该片段大于或等于19个核苷酸；(2)该片段在所比较的HIV序列中完全同源或至少有1000个以上公开序列中该片段完全同源；(3)不完全同源时，相应序列与该片段仅一个nt不同。所获得的序列见表1，比较结果详见表2。
表1.通过同源比较发现的HIV序列中极度保守的RNA序列
编号 HIV基因 RNA序列 1 gag-pol aucaaugaggaagcugcagaaugg 2 gag-pol gggaagugacauagcaggaacuacuag 3 gag-pol uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu 4 env uaugggguaccugugugga 5 env gccaauucccauacauuauugugc 6 env uuaaauggcagucuagcagaa 7 nef accacacacaaggcuacuucccugau 8 3-UTR acagccgccuagcauuucaucac 9 LTR ggauggugcuucaagcuaguaccaguu
表2.极度保守RNA序列的同源比较结果
编号 HIV基因 片段大小 (nt) 同源比较的 HIV序列数 完全同源 序列数相差一个nt 序列数 1 gag-pol 24 1050 1050 0 2 gag-pol 27 1051 1050 1 3 gag-pol 29 1050 1048 2 4 env 19 1050 1050 0 5 env 24 1050 1050 0 6 env 21 1050 1050 0 7 nef 26 1082 1082 0 8 3-UTR 23 1070 1070 0 9 LTR 27 1069 1069 0
实施例2.使用合成RNA双链，降低HIV env基因的表达。
根据上述env基因的保守序列(表1中4号序列)19核苷酸的RNA片断，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在RNA链3’端加UU修饰：
5’ uaugggguaccuguguggauu
3’uuauaccccauggacacaccu
如图1所示，质粒pEGFPC1(Clontech，CA)用EcoRI和BamHI双酶切(37℃ 1小时)后回收大片断作为载体；以HIV-1 Bru株cDNA(2ng)为模板，加gp120引物1(5’cggaattctaaagagcacaaga cagtggac)；和引物2(5’cggatcctactctaccgtcagcgtcattga)各100ng，Pfu高保真酶2.5单位，dNTP 250μmol/L，2.5mol/L MgCl2，25mmol/LTrisHCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪，共30循环)，PCR产物用Qiagen Gel Extraction Kit(购自Biolab)EcoRI和BamHI酶切后与上述载体连接后转化大肠杆菌JM109(购自Promega)，获得完全正确的质粒pEGFP-gp120，该质粒转染细胞后可表达绿色荧光蛋白与HIV gp120的融合蛋白。
质粒pEGFP-gp120 1μg和1μg上述合成的RNA双链，使用LIPOFECTamine法(见Invitrogen说明书)共转染HEK293细胞(购自ATCC)，36小时后与加1μg无关双链(使用实施例3中的GAG双链作为无关双链)RNA的共转染细胞用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-GP120融合蛋白的表达量，并可通过使用抗GFP抗体(购自Clontech)进行免疫印迹(IB)，比较融合蛋白的表达产量。
结果：如图2所示，与对照比较，env基因特异的双链RNA使融合蛋白的表达产量显著降低；重复该实验两次，分别以DsRNA1和DsRNA2表示，如图3所示，该dsRNA能降低GFP-HIV GP120融合蛋白的表达产量80％以上。
实施例3、合成RNA双链抑制gag基因表达
根据上述gag保守序列(表1中2号序列)合成19核苷酸的RNA片断，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在互补RNA链3’端加UU，退火后形成RNA双链：
5’ gugacauagcaggaacuacuu
3’uucacuguaucguccuugaug
按照实施例2的方法，通过PCR从HIV(LAV-1，Bru分离株)cDNA扩增出GAG基因，克隆至pEGFP C1质粒(Clontech，CA)，该质粒转染细胞后可表达绿色荧光蛋白与HIV gag的融合蛋白。
所获得质粒与RNA双链，使用LIPOFECTamine法共转染HEK293细胞，36小时后与不加双链RNA的转染细胞通过荧光显微镜观察比较绿色荧光蛋白-GAG融合蛋白的表达量，发现该RNA可使融合蛋白的表达产量显著降低。
实施例4.合成双链RNA抑制nef基因表达
根据nef保守序列(表1中的7号序列)，合成19核苷酸的RNA片断，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在互补RNA链3’端加UU，退火后形成RNA双链：
5’ accacacacaaggcuacuuuu
3’ uuuggguguguuccgaugaa
按照实施例2的方法，通过PCR从HIV(LAV-1，Bru分离株)cDNA扩增出nef基因，克隆至pEGFP C1质粒(Clontech，CA)，该质粒转染细胞后可表达绿色荧光蛋白与HIV NEF的融合蛋白。
所获得质粒与RNA双链使用LIPOFECTamine法共转染HEK293细胞，36小时后与不加双链RNA的转染细胞通过荧光显微镜观察比较绿色荧光蛋白-NEF融合蛋白的表达量，发现该RNA可使融合蛋白的表达产量显著降低。
实施例5.使用合成双链RNA降低其他HIV蛋白的产量
按照实施例2所述的方法使用合成双链RNA降低相应HIV蛋白的产量，结果见表3。
表3使用新型双链核糖核酸制HIV其它基因表达的效率
编号 DsRNA HIV靶基因 抑制率 1 5’aucaaugaggaagcugcaguu 3’uuuaguuacuccuucgacguc gag-pol ++++ 2 5’guaagaaugucuagcccuguu 3’uucauucuuacagaucgggac gag-pol +++ 3 5’uucccauacauuauugugcuu 3’uuaaggguauguaauaacacg env +++ 4 5’aaauggcagucuagcagaauu 3’uuuuuaccgucagaucgucuu env +++
注：+++抑制60-80％；++++抑制80-100％。
实施例6、合成含有env基因保守序列对应的DNA片段及其杂交序列，克隆至真核表达载体，在细胞内表达干扰RNA，抑制HIV膜蛋白的表达
合成含有env基因保守序列(表1中5号序列)对应的DNA片段及其杂交序列(黑斜体)的DNA片断，退火后形成DNA片段，5’端为BamHI位点的末端，3’端为HindIII位点的末端，在同源序列及其互补序列中间含有间隔序列。B为A的互补序列：
A：5’gatccccttcccatacatttattgtgcttcaagagagcacaataatgtatgggaatttttggaaa
B：5’agcttttccaaaaa ttcccatacattattgtgctctcttgaagcacaataatgtatgggaaggg
如图4所示，通过PCR(以人基因组DNA 1μg为模板，引物15’-TAATTAATGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3’，引物2 5’-GCACTAGTAAGCT TGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3’，扩增条件同实施例2)获得人H1 RNA基因的启动子区，质粒pEGFPC1(Clontech)用AseI和XbaI酶切后回收大片段作为载体，上述扩增片段用AseI和SpeI酶切后回收，与载体连接，转化大肠杆菌后获得质粒pH1。将上述合成的DNA片段(A，B)退火后克隆至pH1质粒的BamHI和HindIII位点，构建质粒pH1-gp120i。该质粒在细胞中，在RNA聚合酶III的作用下，表达发夹状RNA，形成RNA双链。
用4μg pH1-gp120i质粒(使用同量pH1质粒作为对照)与表达EGFP-HIV GP120融合蛋白的质粒共转染HEK293细胞，通过如实施例2所述方法比较融合蛋白的表达产量的差异，结果表明EGFP-gp120融合蛋白的表达产量有显著降低；该结果说明使用质粒载体携带编码上述RNA的DNA序列可以有效抑制HIV靶基因的表达。
实施例7.使用腺病毒伴随病毒载体，携带如实施例6中所述的H1启动子及编码发夹状双链RNA的DNA片段，重组病毒感染细胞后抑制HIV GP120基因的表达。
如图5所示，质粒pAAV-MCS(购于Stratagene)用NotI和HindIII酶切；含H1启动子和编码gp120的发夹状RNA的DNA片段从质粒pH1-gp120i中用NotI和HindII酶切获得，并克隆至pAAV-MCS的相应位点。构建质粒pAAV-gp120i，将该质粒(4μg)(对照病毒载体用pAAV-MCS)与辅助质粒pHelper(1μg，Stratagene)和质粒pAAV-RC(2μgStratagene)一起用LIPOFECTamine法共转染HEK 293FT细胞，48小时后取上清制备“重组AAV病毒”及对照病毒；将pEGFP-GP120(1μg)的质粒转染HEK293细胞，然后加入上述含重组病毒的制备上清，24小时后用荧光显微镜分析细胞内GFP发光强度。
结果如图6所示，表明携带可转录HIV gp120发夹样双链RNA的重组AAV病毒可使GFP-GP120融合蛋白表达水平显著降低。
序列表
<110>北京昭衍新药研究中心
<120>一组抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其应用
<130>
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>1
aucaaugagg aagcugcaga augg 24
<210>2
<211>27
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>2
gggaagugac auagcaggaa cuacuag 27
<210>3
<211>29
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>3
uaaauaaaau aguaagaaug uauagcccu 29
<210>4
<211>19
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>4
uaugggguac cugugugga 19
<210>5
<211>24
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>5
gccaauuccc auacauuauu gugc 24
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>6
uuaaauggca gucuagcaga a 21
<210>7
<211>26
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>7
accacacaca aggcuacuuc ccugau 26
<210>8
<211>23
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>8
acagccgccu agcauuucau cac 23
<210>9
<211>27
<212>RNA
<213>慢病毒属(Lentivirus genera)
<400>9
ggauggugcu ucaagcuagu accaguu 27