一种稀土銪荧光螯合剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种稀土銪荧光螯合剂及其制备方法。
背景技术
稀土离子螯合剂制备是根据自旋对称性匹配的要求，有机分子吸收光能后，电子跃迁发生在自旋相同的电子振动能级之间；此外，电子跃迁还应满足轨道对称性匹配的要求。分子吸收光能后电子被激发到与激发光光能相应的单重激发态，高能级的单重激发态寿命很短(10-10～10-6s)，一般很快地以非辐射方式迁移到低能级单重激发态，然后以辐射方式降至基态并发出一个荧光光子。由于分子势能面的交叉，也可引发电子在单重激发态与三重激发态之间的跃迁(系统间能量传递)。三重激发态寿命较长，因而从三重激发态衰减到基态而发出的磷光具有较长寿命(10-5～1s)。当此分子作为配体与稀土离子络合，而且稀土离子的振动激发态能级低于配体激发三重态能级时，能量便可通过分子内能量传递过程传递给稀土离子，并发出稀土离子的特征荧光。(I Hemmila，T Stahlberg，P Mottram.Bioanalytical Applicationsof Labeling Technologies.Wallac，1994.)。
稀土螯合物的荧光发射机理决定了其独特的荧光特性，即窄的荧光发射峰、大的Stokes位移和比背景荧光长得多的荧光寿命。
稀土Eu3+离子具有9配位的特性，在水溶液中极易被共价结合的H2O分子包围(Hemmila.I.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，1988，48，389-400)，导致荧光淬灭(Veli-MattiM.，Helv.Chim.Acta.，1992，75，1578-1592)。只有当稀土离子Eu3+螯合剂在水溶液中具有充分溶解性及动力学稳定性，能够与Eu3+牢固稳定的结合，才能获得高的荧光量子产率。因此螯合剂应尽可能避免含有高振动基团如O-H，N-H和C-H键，以减少键振动而导致荧光的淬灭。
稀土Eu3+螯合剂以2，2′-联吡啶类为核心配体较多，最初由Cook(1989)合成(Cook M.J.，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，7221-7227)，目前已见到有数百种(Mukkala V.M.，et al.Helv.Chim.Acta.，1992，75，1621-1632)(Takalo H.，etal.Helv.Chim.Acta.，1997，80，372-387)。由于2，2′-联吡啶较高的三重态能级与稀土离子发射能级有足够的间隔，可防止受激发离子的能量向配体的反向传递；以2，2′-联吡啶为核心的螯合剂，按其结构特点可分为二类，一类是联吡啶连接4位芳基，6，6′-多氨多羧基的螯合剂，这类螯合剂以Wallac实验室为代表的研究多集中于结构与光谱学关系的理论探讨；另一类为以联吡啶为核心的穴状螯合剂是1993年Mathis用穴状螯合剂作均相时间分辨稀土荧光光谱分析检测泌乳素，灵敏度达到0.3μg/L(MathisG.，Clin.Chem.，1993，39(9)，1953-1959)。
除2，2′-联吡啶外，还有其它类型的稀土螯合剂，如1，7-双(氯磺二苯基)-1，10-菲洛啉-2，9-二羧酸(BCPDA)和2，6-二(3′-氨甲基-1′-吡唑)-(4-苯基吡啶)-羧酸(BPTA)(Yuan J.，et al.Anal.Chem.，2001，73，1869-1876)。文献(MukkalaV.M.，et al.Helv.Chim.Acta.，1992，75，1621-1632)比较了各种螯合物核心配体的发光效率，发光产额(logR)、最大激发波长(λexc)和代表共价结合于稀土离子的H2O分子数的发射衰减常数(Kchel)，它的λexc＞300nm，可减少本底荧光的影响(Takalo H.，et al.Helv.Chim.Acta.，1993，76，877-883)等。
由于用于免疫标记的Eu3+螯合剂分子结构(Michael P.，etal.Analyst，1984，109，1449-1450)还在研究中，迄今仍未获得理想的有实用价值的荧光强度，目前用于分子生物学、基团组学、蛋白组学分析标记仍然采用光学性能较差的有机染料。因此，开展稀土Eu3+荧光螯合剂的研究具有重要意义。
【发明内容】
本发明提供了一种稀土銪荧光螯合剂及其制备方法。
1)一种稀土銪荧光螯合剂为4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶，其化学式为C28H36N4O8Br2，其结构式如式1：
稀土銪荧光螯合剂的核心配体为2，2′-联吡啶；荧光稳定基团四羧酸不仅能增加螯合剂的水溶解性及水相中的动力稳定性，还能牢固结合稀土离子。四羧基和四个氮原子形成八配位结构，有效地排除水分子的熄灭作用。
2)、所述的稀土銪荧光螯合剂合成的反应路线如下：
3)所述的稀土銪荧光螯合剂的制备方法如下：
(1)2-溴-6-甲基吡啶的制备
把2-氨基-6-甲基吡啶溶于质量浓度为40％的HBr溶液中，保持在-15～0℃，滴加浓度为0.02mol/ml的Br2，再滴加浓度为0.66g/ml亚硝酸钠的水溶液，搅拌30min，继续滴加浓度为0.95g/ml的NaOH水溶液，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在4mmHg下收集62-65℃馏出物2-溴-6-甲基吡啶；
所述的2-氨基-6-甲基吡啶的质量g∶质量浓度为40％HBr的体积ml∶浓度为0.02mol/ml的Br2的体积ml∶浓度为0.66g/ml亚硝酸钠的体积ml∶浓度为0.95g/ml的体积NaOH的ml为14-15∶66∶20∶25
2-溴-6-甲基吡啶的表征：
C6H6NBr M＝172
红外光谱IR(kBr)分析表明，原料中2-氨基-6-甲基吡啶的氨基特征峰3460cm-1，3314cm-1，3171cm-1消失，溴的特征峰1029cm-1(s，C-Br)出现，确定产物为2-溴-6-甲基吡啶。
(2)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶的制备
按照2-溴-6-甲基吡啶质量g∶二水合甲酸钠质量g∶含钯质量浓度为5％的钯碳催化剂地质量g∶苄基三乙基氯化铵质量g∶质量浓度为32％的NaOH溶液的体积ml∶水的体积ml的比为88-92∶82∶3.2∶21.2∶53∶130，向反应器内加入2-溴-6-甲基吡啶、二水合甲酸钠、含钯质量浓度为5％的钯碳催化剂、苄基三乙基氯化铵、质量浓度为32％的NaOH溶液和水，搅拌，加热至回流反应48h，每隔4-8h按照二水合甲酸钠质量g：二水合甲酸钠质量g：∶含钯质量浓度5％的钯碳催化剂质量g∶苄基三乙基氯化铵质量g∶质量浓度为32％的NaOH溶液的体积ml的比为3.8～11.5∶0.8～1.5∶0.6～3.8∶6.7～13.5，再加入二水合甲酸钠、含钯质量浓度5％的钯碳催化剂、苄基三乙基氯化铵和质量浓度为32％的NaOH水溶液，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在2mmHg及105-106℃的条件下收集馏分，得到白色固体产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶。
6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶的表征：
C12H12N2 M＝184熔点：DSC 89℃，b.p.110～116℃(30mmHg)；
红外光谱IR(KBr)1577，1442，1084，737cm-1。其特征峰如下：1574cm-1处为吡啶环的伸缩振动所产生的峰；1440cm-1处为甲基的不对称弯曲振动峰；785cm-1处为碳氢振动峰；1081cm-1处为碳氮的伸缩振动峰。确认是联吡啶的特征峰。
元素分析(％)：理论值C 78.26，H 6.52，N 15.22；
实测值C 78.21，H 6.474，N 14.53。
核磁共振图谱：
1HNMRδ2.63(s，Pyr-CH3，6H)，7.16(d，5，5′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)，7.68(t，4，4′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)，8.17(d，3，3′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)。
(3)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶加入冰醋酸中，滴加质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-1，1′-二氧化物；
所述的6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶质量g∶冰醋酸体积ml∶质量浓度为30％的H2O2溶液ml为9.0-12∶63.7∶22.3；
6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的表征：
C12H12N2O2M＝216 熔点：DSC 193℃。
元素分析值(％)理论值C/66.65 H/5.35 N/12.41，
实测值C/66.16 H/5.36 N/12.01。
红外光谱在1248cm-1、1266cm-1出现了两个很强的峰是氧键的特征吸收峰，在吡啶环上有了两个氧键生成。
核磁共振图谱：1HNMRδ2.58(s，Pyr-CH3，6H)，7.27(d，5，5′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)，7.25(t，4，4′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)，7.23(6，3，3′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)。
(4)4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将质量浓度为98％硫酸与质量浓度为98％浓硝酸混合后用冰水冷却，保持温度在-10～0℃，所述的质量浓度为98％硫酸∶质量浓度为98％浓硝酸的体积比为7.7∶5.8；搅拌下加入6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物，所述的质量浓度为98％硫酸体积mL∶6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的质量g为7.7∶1.8-2.0；在70℃反应6h，冷却后倒入碎冰中，溶液变为深绿色，产生黄色沉淀，过滤，用水洗至pH＝5.5，真空干燥，得白色产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物；
4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的表征
C12H10N4O6 M＝306
红外光谱1340cm-1是硝基的特征吸收峰，证明硝基连接到了吡啶环上。
元素分析(％)：计算值 C/47.07 H/3.29 N/18.30，
实测值 C/46.35 H/3.26 N/16.98。
核磁共振图谱：1HNMRδ2.48(s，Pyr-CH3，6H)，8.53(d，5，5′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)，8.62(d，3，3′-Pyr-H，J＝7.5Hz，2H)。
(5)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基-双三氟乙酸酯的制备
按照4，4-二硝基-6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物质量g∶三氟乙酸酐体积mL∶氯仿体积mL为1.5-2.5∶10∶50，把4，4-二硝基-6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物于反应器中，搅拌下加入三氟乙酸酐和氯仿，混合后为浅黄色混浊液，于41℃回流1小时，蒸馏剩余三氟乙酸酐和氯仿；再按氯仿∶三氟乙酸酐体积比为5∶4重新加入三氟乙酸酐，41℃回流62小时，反应过程中要按氯仿∶三氟乙酸酐体积比为10∶1-2补加三氟乙酸酐，反应结束后将过量的酸酐及生成的酸蒸馏出去，得到黄色粘稠状固体，经柱层析分离，用二氯甲烷洗脱，得淡黄色针状固体结晶；
4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′-二亚甲基--双三氟乙酸酯的表征
C16H8F6N4O8 M＝498 DSC：mp 117.89℃
IR(KBr)：3092cm-1(吡啶环上的C-H伸缩振动)，1542，1350cm-1(NO2)
元素分析(％)：
理论值C 38.55，H 1.606，N 11.24；实测值C 38.96，H 1.686，N 11.1。
1HNMR(CDCL3)：5.72(s，2CH20COCF3)；8.20(d，J＝1.5，2H，bpy)；9.14(d，J＝1.5，2H，bpy)。
(6)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇的制备
按照4，4′-二硝基-6，6′-二亚甲基-双三氟乙酸酯-2，2′-联吡啶质量g∶四氢呋喃(THF)体积mL∶水体积mL的比为1∶3∶41∶41，把4，4′-二硝基-6，6′-二亚甲基-双三氟乙酸酯-2，2′-联吡啶、四氢呋喃(THF)和水于反应器中；搅拌下加入碳酸氢钠，室温反应20小时后，抽滤，取沉淀物；按体积比为41∶20向滤液中再加水，抽滤，取第二次沉淀物，合并两次沉淀物，干燥，得浅黄色固体4，4’-二硝基--2，2’-联吡啶-6，6’二亚甲基醇；
4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇的表征
C12H10N4O6 M＝306
DSC：mp 241.58℃(尖锐单峰)
1HNMR((D6)DMSO)：4.85(d，J＝5，2H20H)；5.95(t，J＝5，20H)8.23(d，J＝1.5，2H，bpy)；8.82(d，J＝1.5，2H，bpy)；
IR(KBr)：1259cm-1(N-O)；3092cm-1(吡啶环上的C-H伸缩振动)；1542，1350cm-1(NO2)；3183(OH).
元素分析(％)：理论值C 47.06，H 3.268，N 18.30，
实测值C 46.47，H 2.966，N 17.55。
(7)4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的制备
称取4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇于反应器中，加入114.3mL质量浓度为33％氢溴酸/冰醋酸溶液中，升温至100℃回流5小时，反应结束后倒入碎冰中，析出沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用乙醚和二氯甲烷淋洗后，经柱层析分离，用二氯甲烷和正己烷体积比为5∶4的溶液洗脱，得白色固体4，4’-二溴-6，6’二溴甲基-2，2’-联吡啶；所述的取4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇质量g∶质量浓度为33％氢溴酸的冰醋酸溶液体积mL为1-3∶114.3；
4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的表征：
C12H8N4Br4 M＝500
DSC：mp 220.54℃(尖锐单峰)
1HNMR(CDCL3)：4.56(s，2CH2Br)；7.66(d，J＝1.7，2H，bpy)；8.54(d，J＝1.7，2H，bpy)
IR(KBr)：1259cm-1(N-O)；3092cm-1(吡啶环上的C-H伸缩振动)
元素分析(％)：
理论值C 28.84，H 1.613，N 5.61，Br 63.95；
实测值C 28.70，H 2.087，N 5.57，Br 63.48。
色谱分析(THF)：峰面积中产物所占的量为总量的97.53％。
(8)4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶的制备
按照4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶∶无水碳酸钠质量比为40-60∶53，把4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶和无水碳酸钠加入反应器中，依次加入乙腈和亚氨基二乙酸二乙酯，所述的无水碳酸钠质量g∶乙腈体积mL∶亚氨基二乙酸二乙酯体积mL为53∶20∶0.35；加热至回流，反应24h，反应过程中按照亚氨基二乙酸二乙酯∶乙腈体积比为7∶100-200补加乙腈；待反应结束后，冷却至室温过滤，蒸干溶剂，用20mL正己烷重结晶，得白色固体4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶。
4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶的表征：
C28H36N4O8Br2 M＝716
DSC：mp 79.05℃(尖锐单峰)
红外光谱IR(KBr)如图1。有二个强吸收峰1555cm-1，1738cm-1。1555cm-1(吡啶环上的C＝N伸缩振动)；，1738cm-1(v C＝O)，1738cm-1为酯基的特征峰。证明4，4’-二溴-6，6’-二溴甲基-2，2’-联吡啶已连上了亚氨基二乙酸二乙酯。
元素分析(％)：
计算值：C/46.94 H/5.06 N/7.82 Br/21.31，
分析值：C/47.21 H/4.84 N/7.65 Br/22.31。
核磁谱见图2：8.45，7.84位置处的双峰表明两个溴仍在4，4′位，4.11处的单峰表明有亚甲基的存在，所以亚氨基二乙酸二乙酯是连在了6，6′位的甲基上。3.64处的单峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个氮亚甲基上的8个氢，而4.19处的四重峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个亚甲基上的8个氢，1.28处的三重峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个甲基上的12个氢。
1H-NMR(CDCl3)：1.28(t，CH3，12H)；3.64(s，CH2，8H)；4.11(s，CH2，4H)；4.19(q，CH2，8H)；7.84(d，5，5′-Pyr-H，2H)；8.45(d，3，3′-Pyr-H，2H)。由核磁谱分析，8.45，7.84位置处的双峰表明两个溴仍在4，4′位，4.11处的单峰表明有亚甲基的存在，亚氨基二乙酸二乙酯与6，6′位的甲基连接。3.64处的单峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个氮亚甲基上的8个氢，而4.19处的四重峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个亚甲基上的8个氢，1.28处的三重峰为两个亚氨基二乙酸二乙酯上的四个甲基上的12个氢。
高分辨质谱图3中加H、Na、K的分子量分别为717(M+1)、739(M+23)、755(M+39)，分子量为716得以确认。由同位素峰可看出该化合物含有2个溴。4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶结构确认。
高压液相色谱相关谱如图4。由高压液相色谱图峰面积中得出产物所占的量为总量的97.43％。得出产物纯度97.43％。
4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪荧光螯合物溶液制备和荧光检测
①按照4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶质量mg∶三氟乙酸体积ml的比为3∶0.2，把4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶，加入到三氟乙酸水解反应24h得到该化合物的水解液。再加入蒸馏水，配制浓度为0.1mg/ml的水解液，避光放置备用；
②把Eu2O3加入体积比为1∶1的盐酸与水配比的溶液溶解后，加热蒸发至干后，再用水稀释配制Eu3+浓度为1×10-3mol/L储备液；
③取步骤②的1×10-3mol/L的Eu2O3储备液，加水稀释至Eu3+浓度为1×10-7mol/L，然后加入步骤①的4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶水解液，加入二次蒸馏水稀释，得到含Eu3+浓度为1×10-8mol/L的4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪荧光螯合物溶液；
所述的Eu2O3储备液∶4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶水解液∶二次蒸馏水的体积比为1∶3∶6。
将该溶液在F-5000荧光光谱仪和荧光寿命测量装置上进行检测：在337nm光源激发下，形成具有銪离子在615nm处的特征峰的荧光光谱。其荧光寿命约610微秒。荧光光谱如图5。
有益效果：本发明得到的稀土銪荧光螯合剂，经过水解能够与三价铕离子形成具有銪离子荧光特征的和荧光寿命的4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-Eu3+荧光螯合物。在荧光时间分辨光谱仪和荧光寿命测量仪上进行检测：在337nm光源激发下，在615nm形成-种新的具有銪离子特征峰的荧光光谱，其荧光寿命约610微秒。
【附图说明】
图1为4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶红外光谱
图2为4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶核磁谱
图3为4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶高分辨质谱
图4为4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶高效液相色谱图
图5为4，4′-二溴-6，6′-二亚甲氨基-二乙酸乙酯-2，2′-联吡啶-Eu(III)的荧光光谱
【具体实施方式】
实施例1
(1)2-溴-6-甲基吡啶的制备
把2-氨基-6-甲基吡啶70g溶于330ml质量浓度为40％的HBr溶液中，保持在0℃，滴加100ml浓度为0.02mol/ml的Br2，再滴加含有亚硝酸钠0.66g/ml的水溶液175ml，搅拌30min，继续滴加含有NaOH 0.95g/ml的水溶液265ml，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在4mmHg下收集62℃馏出物2-溴-6-甲基吡啶103g，bp129-130℃，收率72％。
(2)向反应器内加入2-溴-6-甲基吡啶88g，二水合甲酸钠82.0g，用质量浓度为5％的钯碳催化剂3.2g，苄基三乙基氯化铵21.2g(0.08mol)，质量浓度为32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，搅拌，加热至回流反应48h，每隔4h加入3.8g二水合甲酸钠、0.8g含钯质量浓度5％的钯碳催化剂，0.6g苄基三乙基氯化铵和6.7ml质量浓度为32％的NaOH溶液，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在2mmHg及105℃的条件下收集馏分，得到白色固体产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶。收率约43％。
(3)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶9.0g加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-1，1′-二氧化物。收率70％。
(4)4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将质量浓度为98％硫酸7.7ml与质量浓度为98％浓硝酸5.8ml混合后用冰水冷却，保持温度在0℃，搅拌下加入6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物1.8g，在70℃反应6h，冷却后倒入80g碎冰中，溶液即变为深绿色，产生黄色沉淀，过滤，用水洗至pH＝5.5，真空干燥，得白色产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物。收率约80％。熔点＞250℃。
(5)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基-双三氟乙酸酯的制备。
称取1.5g 4，4-二硝基-6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物于反应器中，搅拌下加入10mL三氟乙酸酐和50mL氯仿，混合后为浅黄色混浊液，于41℃回流1小时，蒸馏剩余三氟乙酸酐和氯仿，重新加入40mL三氟乙酸酐，41℃回流62小时，反应过程中要补加5mL三氟乙酸酐，反应结束后将过量的酸酐及生成的酸蒸馏出去，得到黄色粘稠状固体，经柱层析分离，用二氯甲烷洗脱，得淡黄色针状固体结晶1.56g。收率为48.0％。
(6)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇的制备
称取4，4′-二硝基-6，6′-二亚甲基-双三氟乙酸酯-2，2′-联吡啶0.5g、四氢呋喃(THF)和水各20.5mL于反应器中，搅拌下加入0.57g碳酸氢钠，室温反应20小时后，抽滤，取沉淀物；滤液再加水10mL，抽滤，取第二份沉淀物，合并两次沉淀物，干燥后得浅黄色固体4，4’-二硝基--2，2’-联吡啶-6，6’二亚甲基醇0.54g，收率约90％。
(7)4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的制备
称取1.0g 4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇于反应器中，加入114.3mL质量浓度为33％氢溴酸/冰醋酸中，升温至100℃回流5小时，反应结束后倒入100g碎冰中，析出沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用乙醚和二氯甲烷淋洗后，经柱层析分离，用二氯甲烷和正己烷体积比为5∶4的溶液洗脱，得白色固体4，4’-二溴-6，6’-二溴甲基-2，2’-联吡啶2g。收率为31％。
(8)4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶的制备
称取0.40g 4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶和0.53g无水碳酸钠于反应器中，依次加入20mL的乙腈和0.35mL亚氨基二乙酸二乙酯，加热至回流，反应24h。反应过程中补加8mL乙腈。待反应结束后，冷却至室温过滤，蒸干溶剂，用20mL正己烷重结晶，得白色固体4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶。收率：67.0％。
4，4′-二溴-6，6′二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪荧光螯合物的制备和荧光检测
1)称取12mg 4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶，加入0.8ml的三氟乙酸水解反应24h，得到该化合物的水解液，加水稀释至0.1mg/ml，避光放置备用；
2)称取0.00176g的Eu2O3，加入体积比为1∶1的盐酸与水配比的溶液溶解后，加热蒸发至干，用水稀释配制质量浓度为1×10-3mol/L的铕储备液；
3)移取1×10-3mol/L的铕储备液1ml，加水逐步稀释至1×10-7mol。然后取出1mL放入10mL容量瓶，再加入4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶水解液9ml，得到含铕离子浓度为1×10-8mol/L的4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪螯合物荧光液10ml。
4)将该溶液在荧光时间分辨光谱仪和荧光寿命测量仪上进行检测：在337nm激光光源激发下，荧光光谱如图5，形成一种新的具有銪离子特征峰(615nm)的荧光光谱，其荧光寿命约610微秒。
实施例2
(1)2-溴-6-甲基吡啶的制备
把2-氨基-6-甲基吡啶73g溶于330ml质量浓度为40％的HBr溶液中，保持在-8℃，滴加100ml浓度为0.02mol/ml的Br2，再滴加含有亚硝酸钠0.66g/ml的水溶液175ml，搅拌30min，继续滴加含有NaOH 0.95g/ml的水溶液265ml，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在4mmHg下收集63℃馏出物2-溴-6-甲基吡啶103g，bp129-130℃，收率71％。
(2)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶的制备
向反应器内加入2-溴-6-甲基吡啶90g，二水合甲酸钠82.0g，用质量浓度为5％的钯碳催化剂3.2g，苄基三乙基氯化铵21.2g(0.08mol)，质量浓度为32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，搅拌，加热至回流反应48h，每隔6h加入～5.5g二水合甲酸钠、1.0g含钯质量浓度5％的钯碳催化剂，1.8g苄基三乙基氯化铵和10.5ml质量浓度为32％的NaOH溶液，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在2mmHg及106℃的条件下收集馏分，得到白色固体产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶。收率约42％。
(3)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶10.5g加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-1，1′-二氧化物。收率70％。
(4)4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将质量浓度为98％硫酸7.7ml与质量浓度为98％浓硝酸5.8ml混合后用冰水冷却，保持温度在-5℃，搅拌下加入6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物1.9g，在70℃反应6h，冷却后倒入80g碎冰中，溶液即变为深绿色，产生黄色沉淀，过滤，用水洗至pH＝5.5，真空干燥，得白色产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物。收率约80％。熔点＞250℃。
(5)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基-双三氟乙酸酯的制备
称取2.0g 4，4-二硝基-6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物于反应器中，搅拌下加入10mL三氟乙酸酐和50mL氯仿，混合后为浅黄色混浊液，于41℃回流1小时，蒸馏剩余三氟乙酸酐和氯仿，重新加入40mL三氟乙酸酐，41℃回流62小时，反应过程中要补加7mL三氟乙酸酐，反应结束后将过量的酸酐及生成的酸蒸馏出去，得到黄色粘稠状固体，经柱层析分离，用二氯甲烷洗脱，得淡黄色针状固体结晶1.56g。收率为48.0％。
(6)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇的制备
称取4，4′-二硝基-6，6′-二亚甲基-双三氟乙酸酯-2，2′-联吡啶1.0g、四氢呋喃(THF)和水各20.5mL于反应器中，搅拌下加入0.57g碳酸氢钠，室温反应20小时后，抽滤，取沉淀物；滤液再加水10mL，抽滤，取第二份沉淀物，合并两次沉淀物，干燥后得浅黄色固体4，4’-二硝基--2，2’-联吡啶-6，6’二亚甲基醇0.54g，收率90％。
(7)4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的制备
称2.0g 4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇于反应器中，加入114.3mL质量浓度为33％氢溴酸/冰醋酸中，升温至100℃回流5小时，反应结束后倒入100g碎冰中，析出沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用乙醚和二氯甲烷淋洗后，经柱层析分离，用二氯甲烷和正己烷体积比为5∶4的溶液洗脱，得白色固体4，4’-二溴-6，6’-二溴甲基-2，2’-联吡啶2g。收率为31％。
(8)4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶的制备
称取0.50g 4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶和0.53g无水碳酸钠于反应器中，依次加入20mL的乙腈和0.35mL亚氨基二乙酸二乙酯，加热至回流，反应24h。反应过程中补加10mL乙腈。待反应结束后，冷却至室温过滤，蒸干溶剂，用20mL正己烷重结晶，得白色固体4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶。收率：67.0％。
4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪荧光螯合物的制备和检测与例1相同。
实施例3
(1)2-溴-6-甲基吡啶的制备
把2-氨基-6-甲基吡啶75g溶于330ml质量浓度为40％的HBr溶液中，保持在-15℃，滴加100ml浓度为0.02mol/ml的Br2，再滴加含有亚硝酸钠0.66g/ml的水溶液175ml，搅拌30min，继续滴加含有NaOH 0.95g/ml的水溶液265ml，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在4mmHg下收集65℃馏出物2-溴-6-甲基吡啶103g，bp129-130℃，收率70％。
(2)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶的制备
向反应器内加入2-溴-6-甲基吡啶92g，二水合甲酸钠82.0g，用质量浓度为5％的钯碳催化剂3.2g，苄基三乙基氯化铵21.2g(0.08mol)，质量浓度为32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，搅拌，加热至回流反应48h，每隔8h加入11.5g二水合甲酸钠，1.5g含钯质量浓度5％的钯碳催化剂，3.8g苄基三乙基氯化铵和13.5ml质量浓度为32％的NaOH溶液，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压蒸馏在2mmHg及106℃的条件下收集馏分，得到白色固体产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶。收率约40％。
(3)6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶12g加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-1，1′-二氧化物。收率68％。
(4)4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物的制备
将质量浓度为98％硫酸7.7ml与质量浓度为98％浓硝酸5.8ml混合后用冰水冷却，保持温度在-10℃，搅拌下加入6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物2.0g，在70℃反应6h，冷却后倒入80g碎冰中，溶液即变为深绿色，产生黄色沉淀，过滤，用水洗至pH＝5.5，真空干燥，得白色产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶-N，N′-二氧化物。收率约80％。熔点＞250℃。
(5)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基-双三氟乙酸酯的制备
称取2.5g 4，4-二硝基-6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物于反应器中，搅拌下加入10mL三氟乙酸酐和50mL氯仿，混合后为浅黄色混浊液，于41℃回流1小时，蒸馏剩余三氟乙酸酐和氯仿，重新加入40mL三氟乙酸酐，41℃回流62小时，反应过程中要补加10mL三氟乙酸酐，反应结束后将过量的酸酐及生成的酸蒸镏出去，得到黄色粘稠状固体，经柱层析分离，用二氯甲烷洗脱，得淡黄色针状固体结晶。收率为46.0％。
(6)4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇的制备
称取4，4′-二硝基-6，6′-二亚甲基-双三氟乙酸酯-2，2′-联吡啶1.5g、四氢呋喃(THF)和水各20.5mL于反应器中，搅拌下加入0.57g碳酸氢钠，室温反应20小时后，抽滤，取沉淀物；滤液再加水10mL，抽滤，取第二份沉淀物，合并两次沉淀物，干燥后得浅黄色固体4，4’-二硝基--2，2’-联吡啶-6，6’二亚甲基醇，收率90％。
(7)4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的制备
称取3.0g 4，4′-二硝基--2，2′-联吡啶-6，6′二亚甲基醇于反应器中，加入114.3mL质量浓度为33％氢溴酸/冰醋酸中，升温至100℃回流5小时，反应结束后倒入100g碎冰中，析出沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用乙醚和二氯甲烷淋洗后，经柱层析分离，用二氯甲烷和正己烷体积比为5∶4的溶液洗脱，得白色固体4，4’-二溴-6，6’-二溴甲基-2，2’-联吡啶2g。收率为31％。
(8)4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶的制备
称取0.60g 4，4′-二溴-6，6′-二溴甲基-2，2′-联吡啶和0.58g无水碳酸钠于反应器中，依次加入20mL的乙腈和0.35mL亚氨基二乙酸二乙酯，加热至回流，反应24h。反应过程中补加10mL乙腈。待反应结束后，冷却至室温过滤，蒸干溶剂，用20mL正己烷重结晶，得白色固体4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰基)氨甲基)-2，2′-联吡啶。收率：66.0％。
4，4′-二溴-6，6′-二(N，N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2，2′-联吡啶-銪荧光螯合物的制备和荧光检测同例1。