氨基酸类双光子荧光染料.pdf

氨基酸类双光子荧光染料，所述荧光染料具有通式I的结构。该类双光子荧光染料在肿瘤活细胞中非核酸区域以及非肿瘤细胞内具有较低的荧光背景，在肿瘤活细胞中核酸区域内具有较强的荧光信号，且对肿瘤活细胞内核酸具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。。

权利要求书
1.  氨基酸类双光子荧光染料，具有通式I的结构：

通式I中：
R选自：

L1和L2各自独立地选自C1-8烷基、-O(CH2)n-、-(CH2)nO-、-O(CH2)nO-、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-和-NH(CH2)nNH-，其中n是1-8的整数。

2.  权利要求1所述的氨基酸类双光子荧光染料，其特征在于：所述的R选自:


3.  权利要求1所述的氨基酸类双光子荧光染料，其特征在于：所述的L1选自C1-8烷基、-O(CH2)n-、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-或-NH(CH2)nNH-。

4.  权利要求1所述的氨基酸类双光子荧光染料，其特征在于：所述的L2选自C1-8烷基、-(CH2)nO-、-O(CH2)n-或-O(CH2)nO-。

5.  权利要求1所述的氨基酸类双光子荧光染料，选自化合物A1-A4：
。

6.  权利要求1所述的氨基酸类双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1)H-R-Br与浓硝酸按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物H-R-NO2；
反应温度为30-150℃，反应时间为1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)化合物H-R-NO2与化合物B1按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-150℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)化合物C2与还原剂按摩尔比1:5-1:20反应，制备化合物C3：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；还原剂选自锌粉、铁粉、氯化亚锡和钯碳；
4)化合物C3与化合物B2按摩尔比1:5-1:20反应，制备化合物C4：

反应温度为25-90℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物；
5)化合物C4经水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。

7.  权利要求1-6中任一权利要求所述的氨基酸类双光子荧光染料在生物检测与标记中的应用。

8.  权利要求7所述的氨基酸类双光子荧光染料在生物检测与标记中的应用，其特征在于所述的生物检测与标记目标物为肿瘤细胞或肿瘤组织中的核酸。

说明书氨基酸类双光子荧光染料
技术领域
本发明涉及一类含有氨基酸结构的双光子荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料对肿瘤活细胞或组织中谷胱甘肽的识别及定量检测。
背景技术
核酸(Nucleic Acids)是细胞内能够起到生物体遗传信息携带和传递的生物大分子。核酸按其组成成分可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。DNA分子是一类含有生物物种的遗传信息的链状结构或者呈环状结构的双链分子，RNA分子是一类负责DNA遗传信息的翻译和表达单链分子。核酸存在于所有动植物细胞、微生物体内，是生命的最基本物质之一，对生物的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用。近些年来，核酸除了具有原来已被研究的作用之外，还被发现了新的作用，例如日本工业技术院产业技术融合领域研究所已经研制出可治疗白血病的人造核酸，此种核酸可主观发现引起白血病的遗传基因并将其剪除，此种人造核酸将来有望成为治疗白血病的主要药物(Nature,2000,406,473-474)。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的、特异性识别肿瘤细胞内的核酸以及可对其定量成像的技术或方法是一项重要的工作。
现有识别及检测核酸的方法种类很多，例如PCR技术、高效液相色谱法来分析、紫外分光光度法等。但上述方法在实际成像应用中存在以下缺陷：细胞膜的通透性差、无法实现对肿瘤细胞的选择性问题等等。随着显微成像技术的发展，荧光染料在显微成像研究中已经成为最重要的依附工具。荧光标记的光学分子成像为核酸的相关基础研究提供了一种很好的解决方法。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等荧光染料都已经应用到核酸相关研究中。然而，这些染料具有一些无法改变的缺点，比如：菲啶染料类中的溴化乙锭(EB)具有致癌性，GoldView对皮肤、眼睛具有一定的刺激性等等。更重要的是，这些传统的单光子荧光染料与新发展起来的双光子荧光染料相比，在近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等方面(Nature,1999,2:989-996.；Science,1997,275:530.；Angewandte Chemie International Edition,2001,40:2098.)具有一定的缺陷。因此，构建并制备低/无毒性、高膜通透性、可选择性识别肿瘤细胞中的核酸类双光子染料仍然存在巨大挑战。
发明内容
本发明的目的，首先在于提供一类氨基酸类双光子荧光染料，所述染料具有通式I的结构：

通式I中：
R选自：

L1和L2各自独立地选自C1-8烷基、-O(CH2)n-、-(CH2)nO-、-O(CH2)nO-、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-和-NH(CH2)nNH-，其中n是1-8的整数。
上述基团的结构式中，“---”用以表示该基团与化合物其它部分连接的游离键。
本发明另一方面的目的，在于提供上述氨基酸类双光子荧光染料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)H-R-Br与浓硝酸按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物H-R-NO2(C1)；
反应温度为30-150℃，反应时间为1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)化合物H-R-NO2(C1)与化合物B1按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-150℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)化合物C2与还原剂按摩尔比1:5-1:20反应，制备化合物C3：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；还原剂选自锌粉、铁粉、氯化亚锡和钯碳；
4)化合物C3与化合物B2按摩尔比1:5-1:20反应，制备化合物C4：

反应温度为25-90℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物；
5)化合物C4经水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。
上述关于本发明的氨基酸类双光子荧光染料的制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R、L1、和L2的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
本发明所述的氨基酸类双光子荧光染料可以双光子激发，在肿瘤活细胞和组织内对核酸有较强的荧光信号，可用于特异专一性的比例标记和检测活肿瘤细胞和组织中核酸的双光子荧光染料。并且这类荧光染料具有一定水平的水溶性，以及良好的细胞膜通透性，并具有较大的有效的双光子吸收截面。同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
因此，本发明再一方面的目的在于提供上述氨基酸类双光子荧光染料在生物检测与标记中的应用。尤其优选应用于目标物为肿瘤细胞或肿瘤组织中的核酸的检测与标记。
附图说明
本发明附图8幅：
图1是实施例1中本发明的荧光染料化合物A1的溶剂化效应表征结果。将化合物A1分别加入到的不同溶剂中。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)
图2是实施例1中本发明的荧光染料化合物A1在核酸存在与不存在时双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：PBS缓冲溶液。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A1溶液浓度都为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图3是实施例4合成的荧光染料化合物A2，以终浓度为2.0μM的A2分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中的有强荧光信号。荧光采集波段为560-650nm。
图4是实施例4中本发明的荧光染料化合物A2的水溶解性表征结果。使用化合物A2不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。
图5是实施例7合成的荧光染料化合物A3，以终浓度为2.0μM的A3分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中的有强荧光信号。荧光采集波段为520-550nm。
图6是实施例7中本发明的荧光染料化合物A3在核酸存在与不存在时双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：PBS缓冲溶液。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A1溶液浓度都为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图7是实施例10合成的荧光染料化合物A4，以终浓度为2.0μM的A4分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中的有强荧光信号。荧光采集波段为560-650nm。
图8是实施例10中本发明的荧光染料化合物A4的水溶解性表征结果。使用化合物A4不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名称，如“丙基”、“异丙基”或“环丙基”，特指具体碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。如概括形式的描述，如“C1-6烷基”，则包括碳原子数满足要求的所有基团，“C1-6烷基”包括但不限于C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明公开一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构：

所述通式I中，R为荧光团；L1，L2为连接臂。 
通式I中，所述的R选自：

所述的R优选:

所述的R最优选：

通式I中，所述的L1和L2各自独立地选自：C1-8烷基、-O(CH2)n-、-(CH2)nO-、-O(CH2)nO-、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-和-NH(CH2)nNH-，其中n是1-8的整数。
作为优选的实施方式，所述的L1选自：C1-8烷基、-O(CH2)n-、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-或-NH(CH2)nNH-；优选C1-8烷基、-NH(CH2)n-、-(CH2)nNH-或-NH(CH2)nNH-；更优选-(CH2)n-或-(CH2)nNH-。任意具体实施方式中，n是1-8的整数，优选n是1-4的整数；尤其优选n为2或3。
作为优选的实施方式，所述的L2选自：C1-8烷基、-(CH2)nO-、-O(CH2)n-或-O(CH2)nO-优选C1-8烷基；更优选-(CH2)n-。任意具体实施方式中，n是1-8的整数，优选n是1-4的整数；尤其优选n为2或3。
以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发明所述及的范围。
优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，所述的氨基酸类双光子荧光染料，选自化合物A1-A4：


另一方面，本发明提供了上述本发明氨基酸类双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1)H-R-Br与浓硝酸按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物H-R-NO2(C1)；
反应温度为30-150℃，反应时间为1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤1)的反应温度优选30-130℃，更优选30-120℃，最优选30-110℃；所述的反应时间优选1-18小时，更优选1-17小时，最优选1-16小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；H-R-Br与浓硝酸进行反应优选摩尔比1:1-1:4.5，更优选1:1-1:4.3，最优选1:1-1:4。
2)化合物H-R-NO2(C1)与化合物B1按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-150℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤2)的反应温度优选30-130℃，更优选30-120℃，最优选30-110℃；所述的反应时间优选1-9.5小时，更优选1-9小时，最优选2-9小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；化合物H-R-NO2(C1)与化合物B1进行反应优选摩尔比1:1-1:4.5，更优选1:1-1:4.3，最优选1:1-1:4。
3)化合物C2与还原剂按摩尔比1:5-1:20反应，制备化合物C3：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；还原剂选自锌粉、铁粉、氯化亚锡和钯碳；
具体实施方式中，所述步骤3)的反应温度优选30-100℃，更优选30-95℃，最优选30-90℃；所述的反应时间优选1-9.5小时，更优选1-9小时，最优选2-9小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、醋酸或其混合物，更优选乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、醋酸或其混合物，最优选乙醇、甲醇、丙酮、醋酸或其混合物；化合物C2与还原剂进行反应优选摩尔比1:7-1:20，更优选1:8-1:20，最优选1:10-1:20；还原剂优选自锌粉、铁粉、氯化亚锡，更优选锌粉、氯化亚锡，最优选锌粉。
4)在DMAP催化下，化合物C3、化合物B2与EDCl按摩尔比1:5:1-1:20:1反应，制备化合物C4：

反应温度为25-90℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤4)的反应温度优选25-85℃，更优选25-80℃，最优选25-75℃；所述的反应时间优选1-9.5小时，更优选1-9小时，最优选2-9小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物，更优选二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯或其混合物，最优选二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物；化合物C3、化合物B2与EDCl进行反应优选摩尔比1:6:1-1:20:1，更优选1:7:1-1:20:1，最优选1:8:1-1:20:1。
5)化合物C4经水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。
具体实施方式中，所述步骤5)的反应温度优选25-45℃，更优选25-40℃，最优选25-35℃；所述的反应时间优选1-5.5小时，更优选1-5小时，最优选2-5小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、丙酮、水或其混合物，更优选二氯甲烷、丙酮、水或其混合物，最优选二氯甲烷、水或其混合物；三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠与化合物C4进行水解反应优选摩尔比1:1-1:9，更优选1:1-1:8，最优选1:1-1:7。
对本发明采用上述方法合成的氨基酸类双光子荧光染料化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。
本发明所述的氨基酸类双光子荧光染料具备以下优点：
所述染料化合物引入了与核酸特异性结合位点，提高了染料对肿瘤活细胞和组织中核酸检测和识别的专一性、特异性；
所述染料化合物具有优异的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性；
所述染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化；
鉴于此，本发明所述的双光子荧光染料可用于肿瘤活细胞中核酸的标记。除了以本文中所述的形式直接用于肿瘤活细胞中核酸的标记，含有本发明的双光子荧光染料化合物的组合物也可以用于肿瘤活细胞中核酸的标记。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明还提供使用上述本发明的双光子荧光染料化合物标记肿瘤活细胞中核酸的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
制备荧光染料化合物A1，采用如下合成路线：

(1)化合物1-1的合成
将20mmol 4-硝基-1，8-萘酐和25mmol N,N-二甲基乙二胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物1-1，收率90％。
(2)化合物1-2的合成
将20mmol化合物1-1和400mmol锌粉加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物1-2，收率95％。
(3)化合物1-3的合成
将20mmol化合物1-2和200mmol E1加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热50℃回流持续反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物1-3，收率32％。
(4)化合物A1的合成
将上步化合物1-3在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的化合物A1，产率18％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.11(s,1H),7.97-7.83(m,4H),7.63(s,1H),6.65(s，1H),6.43(s,2H),3.48(s,1H),3.08(s,2H),2.67–2.52(m,6H),2.27(s,6H).
实施例2
荧光染料化合物A1的溶剂化效应检测试验
使用上述实施例1合成的荧光染料化合物A1分别加入到不同溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果如图1所示，可见：随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图1(a)为荧光染料化合物A1在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图1(b)为荧光染料化合物A1在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。
实施例3
荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面检测试验：
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例1合成的荧光染料化合物A1分别加入到的二甲基亚砜溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式如下所示：
δ s = δ r C r C s n r n s F s F r Φ r Φ s ]]>
公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。
测定在核酸存在与不存在时双光子有效吸收截面(Φδ，如图2)。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。由实验结果(图2)所示，当没有核酸时，荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面在800nm只有11GM；当测试体系中存在有核酸是，荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面在770nm只有139GM。
实施例4
制备探针化合物A2：

(1)化合物2-1的合成
将20mmol 5-硝基吖啶-1-胺和30mmol溴乙二胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物2-1，收率79％。
(2)化合物2-2的合成
将20mmol化合物2-1和400mmol锌粉加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体 粉末粗产品，化合物2-2，收率93％。
(3)化合物2-3的合成
将20mmol化合物2-2和200mmol E1加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热50℃回流持续反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物2-3，收率35％。
(4)荧光染料化合物A2的合成
将化合物2-3在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A2，产率15％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),7.97(s,1H),7.63(s,2H),7.22(s,2H),6.95(s，2H),6.65(s，1H),6.43(s,2H),4.41(s,1H),3.48(s,1H),3.08(s,2H),2.67–2.52(m,6H),2.27(s,6H).
实施例5
荧光染料化合物A2对肿瘤活细胞中核酸的识别
使用实施例4合成的荧光染料化合物A2，以终浓度为2.0μM的A2分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。实验结果表明：荧光染料化合物A2在Hela细胞中的有强荧光信号。图3的荧光采集波段为560-650nm。
实施例6
荧光染料化合物A2的水溶解性检测试验
使用上述实施例4合成的荧光染料化合物A2加入到水中，测定在不同浓度A2水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图4，结果显示：当化合物A2浓度为4.0μM时，吸光度值未发生偏移，即荧光染料化合物A2在水中的溶解度为4.0μM。图4为不同探针A2浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例7
制备荧光染料化合物A3

(1)化合物3-1的合成
将20mmol 4-硝基-1，8-萘酐和25mmol N,N-二甲基乙二胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物3-1，收率90％。
(2)化合物3-2的合成
将20mmol化合物3-1和400mmol锌粉加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物3-2，收率95％。
(3)化合物3-3的合成
将20mmol化合物3-2和200mmol E2加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热50℃回流持续反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物3-3，收率38％。
(4)荧光染料化合物A3的合成
将化合物3-3在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A3，产率18％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.11(s,1H),7.95-7.81(m,4H),7.67(s,1H),6.55(s，1H),6.40(s,2H),3.45(s,1H),3.08(s,2H),2.67–2.48(m,8H),2.27(s,6H).
实施例8
荧光染料化合物A3对活细胞中核酸的标记
使用实施例7合成的荧光染料化合物A3，以终浓度为2.0μM的A3分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子 激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。结果如图5所示，成像显示结果显示：荧光染料化合物A3在Hela细胞中的有强荧光信号。图5的荧光采集波段为520-550nm。
实施例9
荧光染料化合物A3的双光子有效吸收截面检测试验：
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例7合成的化合物A3分别加入到的二甲基亚砜溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式如下所示：
δ s = δ r C r C s n r n s F s F r Φ r Φ s ]]>
公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。
测定在核酸存在与不存在时双光子有效吸收截面(Φδ，如图6)。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。由实验结果(图6)所示，当没有核酸时，荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面在800nm只有11GM；当测试体系中存在有核酸是，荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面在770nm只有124GM。
实施例10
制备荧光染料化合物A4

(1)化合物4-1的合成
将20mmol 5-硝基吖啶-1-羧酸和30mmol乙二胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，加入20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护。回流反应5h后停止。反应结束，柱色谱分离，得橘黄色固体粉末粗产品，化合物4-1，收率67％。
(2)化合物4-2的合成
将20mmol化合物4-1和400mmol锌粉加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应8h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得橘黄色固体粉末粗产品，化合物4-2，收率96％。
(3)化合物4-3的合成
将20mmol化合物4-2和200mmol E1加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热50℃回流持续反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物4-3，收率39％。
(4)荧光染料化合物A4的合成
将化合物4-3在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A4，产率15％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),7.97(s,1H),7.63(s,2H),7.22(s,2H),6.95(s，2H),6.65(s，2H),6.43(s,2H),3.48(s,1H),3.08(s,2H),2.67–2.52(m,6H),2.27(s,6H).
实施例11
荧光染料化合物A4对活细胞中核酸的标记
使用实施例10合成的荧光染料化合物A4，以终浓度为2.0μM的A4分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像结果显示：荧光染料化合物A4在Hela细胞中的有强荧光信号。图7的荧光采集波段为560-650nm。
实施例12
荧光染料化合物A4的水溶解性检测试验
使用上述实施例10合成的荧光染料化合物A4加入到水中，测定在不同浓度荧光染料化合物A4水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果如图8所示，显示当荧光染料化合物A2浓度为6.0μM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A4在水中的溶解度为6.0μM。图8为不同探针A4浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明 的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。