《一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410670694.X(22)申请日 2014.11.20C12N 9/00(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C12R 1/19(2006.01)C12R 1/125(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(71)申请人 江苏诚信药业有限公司地址 226221 江苏省南通市启东市滨江精细化工园区(72)发明人 邢将军(74)专利代理机构 上海三和万国知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 31230代理人 章鸣玉(54) 发明名称一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用(57) 摘要本发明提供。
2、一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用。所述生物酶为 SEQID NO:2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制备，首先构建生物酶的基因工程菌株，将全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性内切酶 SalI 线性化重组质粒。将阳性克隆挑入 YPD 液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养至OD为1.0时接入1甲醇诱导，诱导 72h，用于表达生物酶，经过进一步发酵获得催化合成丙谷二肽的生物酶。利用该生物酶催化合成丙谷二肽；经过加热失活、过滤后，采用纳滤技术除去生成的盐，浓缩后用甲醇和水析晶，得到高纯度的丙谷二肽。此合成方法简单，高效，而且环保，具有极高的经济价值和市场竞争力。(51)Int。
3、.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页序列表1页(10)申请公布号 CN 104480075 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480075 A1/1 页21.一种催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶为 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。2.根据权利要求 1 所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，其特征在于，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株 ；所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。3.一种编码权利要求 1 所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO ：1所示。4.一种权。
4、利要求 1 所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤 ：(1) 首先构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株，将权利要求 3 所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中 ；(2)将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养，最后经发酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。5.一种权利要求 1 所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，其特征在于，包括如下步骤 ：(1) 把 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中 ；(2) 将 L- 谷氨酰胺加入水中，降温至 5-15 , 用碱调 pH 至 8.5-9.5，形成反应体系 ；(3) 将所述的生物酶加入到 L- 谷氨酰胺的反应体系中 , 。
5、并将 (1) 中配好的 L- 丙氨酸甲酯水溶液加入所述反应体系中，滴加碱水，pH 保持在 8.5-9.5 ；(4)pH 不变时，反应结束，加热反应体系，升温至 60-100，使生物酶失活，过滤除生物酶；(5) 所得滤液除盐后，减压蒸馏至固体析出 ；(6) 经离心分离后，得丙谷二肽粗品 ；(7) 用甲醇和水精制，得丙谷二肽产品。6.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中所得到 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐的水溶液的质量浓度为 30-60。7.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述生物酶的用量为谷氨酰胺质量的 0.1-1.0。8.根。
6、据权利要求 5 所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述谷氨酰胺和L- 丙氨酸甲酯盐酸盐的用量为 ：谷氨酰胺 ：50155g/L ；L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 70350g/L。9.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中还加入活性炭脱色，促进过滤，所述活性炭的用量为反应液质量的 3-8。10.根据权利要求 5 所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述碱选自 LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、K2CO3和 Na2CO3中的一种或一种以上。权 利 要 求 书CN 104480075 A1/8 页3一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用技术领域。
7、0001 本发明涉及一种合成丙谷二肽的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和现代化的分离技术的丙谷二肽生物合成方法，具体是一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用。背景技术0002 N(2)-L- 丙氨酞 -L- 谷氨酸胺属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，主要用于人体保健行业，是人体含量最丰富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品。0003 由于谷氨酰胺极为重要的生理功能和药理作用，使其在肠外营养中的应用受到人们普遍的重视。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下，生成有毒的焦谷酸和氨，所以商品氨基酸制剂中都不含有谷氨酰胺。只有将其转化为稳定的衍生物才能对人体起作用。0004 相对于。
8、谷氨酰胺而言，丙谷二肽的溶解度是谷氨酸胺的 20 倍，在储存和加热灭菌中也很稳定，可直接制备成输液制剂用于临床。丙谷二肽进入人体后即迅速分解成谷氨酰胺而发挥作用。研究证明，丙谷二肽在体内很快被分解为其组成氨基酸，半衰期很短，血液中只能检测到少量的二肽，仅有微量的二肽从尿液中排出，说明丙谷二肽可有效的被利用而且不会在血液中积聚，避免了可能产生的药理及生理性损害。健康人体长期静脉滴注丙谷二肽没有任何副作用及不良反应，不影响正常的肾功能。0005 CN101659691A 和 CN1786019A 公开了一种丙谷二肽的化学合成和工业化生产方法( 如下路线 )，但是该方法反应合成路线长，环境污染大，工。
9、艺成本高。0006 发明内容0007 为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶。0008 本发明第二个目的是提供一种编码所述催化合成丙谷二肽的生物酶的核苷酸序列。0009 本发明第三个目的是提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶的制备方法。说 明 书CN 104480075 A2/8 页40010 本发明第四个目的是提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的应用，进一步提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法0011 本发明提供的丙谷二肽的生物合成采用生物酶法催化一步合成丙谷二肽 ；本发明利用毕氏酵母酶高效转化谷氨酰胺生成丙谷二肽，并采用现代化的先进分离技术，使。
10、丙谷二肽的工业化生产成本大大降低。0012 本发明的技术方案如下 ：0013 一种催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶为 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。0014 根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。0015 根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。0016 本发明还提供一种编码所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO ：1 所示。0017 本发明提供还一种所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤 ：0018 (1) 首先构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌。
11、株，将权利要求 3 所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中 ；0019 (2)将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养，最后经发酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。0020 本发明进一步提供一种所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，包括如下步骤 ：0021 (1) 把 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中 ；0022 (2) 将 L- 谷氨酰胺加入水中，降温至 5-15 , 用碱调 pH 至 8.5-9.5，形成反应体系；0023 (3) 将所述的生物酶加入到 L- 谷氨酰胺的反应体系中 , 并将 (1) 中配好的 L- 丙氨酸甲酯水溶液加入所述反应体。
12、系中，滴加碱水，pH 保持在 8.5-9.5 ；0024 (4)pH 不变时，反应结束，加热反应体系，升温至 60-100，使生物酶失活，过滤除生物酶 ；0025 (5) 所得滤液除盐后，减压蒸馏至固体析出 ；0026 (6) 经离心分离后，得丙谷二肽粗品 ；0027 (7) 用甲醇和水精制，得丙谷二肽产品。0028 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤 (5) 中所得滤液经纳滤除盐后，减压蒸馏至固体析出。0029 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤 (6) 中用过滤离心机进行离心分离，得丙谷二肽粗品。0030 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方。
13、法，优选的是，所述步骤 (2) 中 pH 为9.0-9.30031 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤 (1) 中所得到L- 丙氨酸甲酯盐酸盐的水溶液的质量浓度为 30-60。说 明 书CN 104480075 A3/8 页50032 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤 (3) 中所述生物酶的用量为谷氨酰胺质量的 0.1-1.0，进一步优选为 0.5-0.8。0033 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述谷氨酰胺和 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐的用量为 ( 以每升反应液计 ) ：谷氨酰胺 ：50155g/L ；L- 丙氨酸甲酯盐酸盐7。
14、0350g/L。0034 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤 (4) 中还加入活性炭脱色，促进过滤，所述活性炭的用量为反应液质量的 3-8。0035 根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述碱选自 LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、K2CO3和 Na2CO3中的一种或一种以上。0036 本发明所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤 ：0037 (1) 取原种菌种在 YPD 平板上划线，30，倒置培养过夜。0038 (2) 从平板上挑单菌落 ( 直径 1mm) 至 50ml YPD 液体培养基 ( 酵母粉 10g，蛋白胨10g，葡萄糖 10g，加水定容至。
15、 1L) 中，30、200rpm 摇床振荡过夜培养过夜 (24h)。OD600 长至 4-5。0039 (3) 以 10的接种量接种到 300mlYPD 液体培养基中 (1L 三角瓶 ) 摇瓶中，30、200rpm 摇床振荡培养，约 24h 后 OD600 长到 12 左右。0040 (4) 将发酵培养基按每升料配置好后，倒入发酵罐 (30L)，121灭菌 30min ；降温后控制温度 30，使用氨水调节 pH 值至 5.0。0041 (5) 将长好的种子液接种进罐，接种量 5。0042 (6) 根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在 30以上，诱导发酵 96h 后，菌体湿重达到约为 340g/L。
16、 左右放罐。0043 (7) 离心，收集清液 ；0044 (8) 将清液超滤浓缩后冻干，得到合成丙谷二肽用生物酶冻干粉。0045 本发明的技术方案主要是 ：构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株 ；建立有效的丙谷二肽生物酶发酵和提取工艺 ；得到有效的生物酶催化合成丙谷二肽的反应条件和分离手段。0046 本发明提供的所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，详述为如下步骤 ：0047 丙谷二肽的生物合成的反应式如下 ：0048 0049 (1) 把 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中 ；0050 (2) 将 L- 谷氨酰胺加入水中，降温至 5-15 , 用碱调 pH 至 8.5-9.5 ；0051 (3)。
17、 将生物酶加入到 L- 谷氨酰胺的反应体系中 , 并将 (1) 中配好的 L- 丙氨酸甲酯水溶液慢慢加入反应体系中，同时滴加碱水，使 pH 保持在 8.5-9.5 ；0052 (4)pH 不变时，加热升温至 60使酶失活，过滤除酶 ；说 明 书CN 104480075 A4/8 页60053 (5) 滤液经纳滤除盐后，减压蒸馏至有大量固体析出 ；0054 (6) 离心分离，得丙谷粗品 ；0055 (7) 用甲醇和水精制，得高纯度丙谷二肽产品。0056 步骤 1 中 L- 丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为 30-60 ；0057 步骤 2 中要求温度为 5-15，最佳温度为 10 ；要求 pH 为 8.。
18、5-9.5，最佳 pH 为9.0 ；0058 步骤 3 中酶的用量为谷氨酰胺量的 0.1-1.0 (w/w)，最佳量为 0.5 ；0059 步骤 4 中要求加热使酶失活，并加入活性炭脱色，促进过滤，活性炭的用量为反应液的 3-8 ；0060 步骤 5 中要求纳滤除盐，采用的纳滤膜截留分子量大于 150，测定氯离子的含量，确定除盐效果 ；0061 步骤 7 中精制包括溶解、析晶、离心过滤、干燥粉碎和包装。0062 本发明的有益技术效果 ：0063 本发明提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用，本发明利用所述生物酶催化合成丙谷二肽 ；经过加热失活、过滤后，采用纳滤技术除去生成的盐，浓缩。
19、后用甲醇和水析晶，得到高纯度的丙谷二肽。0064 本发明提供的丙谷二肽的生物合成方法，合成路线简单，原料便宜易得，设备要求简单，用酶量极少 (0.2 )，反应时间短 (23 小时 )，溶剂回收利用率高，除盐效果好 ；对设备要求简单 ；收率高，后处理简单，产品纯度高 ；成本低，具有极高的经济价值和市场竞争力。具体实施方式0065 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。0066 本发明所应用 LB 液体培养基的组成 ：酵母粉 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 10g，调节 pH到 7.0 ；加水定容至 1L ；0067 YPD 培养基的组成 。
20、：酵母粉 10g，蛋白胨 10g，葡萄糖 10g，加水定容至 1L ；0068 BMGY 液体培养基的组成 ：酵母粉 10g，蛋白胨 10g，YNB 13.4g，甘油 10g，生物素0.004g，用磷酸盐缓冲液 (0.1M) 调节 pH 到 6.0，加水定容至 1L。0069 本发明产品依照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 V D) 测定。0070 实施例 1 ：生物酶的基因工程菌株构建0071 将全基因合成的生物酶基因片段 ( 序列如 SEQ ID NO ：1 所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 )，经限制性内切酶 EcoRI 和 Not I( 购自 New Engl。
21、and Biolabs 公司，根据说明书进行操作 ) 酶切后重组到酵母表达载体 pPIC9K(invitrogen 公司 )，转化到E.coli TOP10(购自北京全式金生物技术有限公司)中，将E.coli TOP10置于LB液体培养基中37、160转震荡培养过夜，中提重组质粒。利用限制性内切酶SalI(购自 New England Biolabs公司，根据说明书进行操作 ) 线性化重组质粒。0072 巴斯德毕赤酵母 GS115 感受态细胞 (invitrogen 公司 ) 的制备 : 将 Pichia Pastoris GS115 单菌落挑入 YPD 培养基中活化，活化的 Pichia G。
22、S115 按 0.5的接种量接说 明 书CN 104480075 A5/8 页7入50ml YPD培养基中30培养至对数期，离心获得的菌体用20ml无菌水洗2次，再用20ml无菌 1M 山梨醇洗 2 次，加入 1ml 1M 山梨醇溶液重悬菌体获得巴斯德毕赤酵母 GS115 感受态细胞。0073 将线性化片段加入到 80l 巴斯德毕赤酵母 GS115 感受态细胞中冰浴 5 分钟，电转化后加入800l山梨醇将细胞洗至1.5ml无菌离心管中，25温育2h后，离心涂MD 平板，30培养至长出菌落后，划线分离出单菌落。将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase( 购自 sigma 公司 ) 后 37温。
23、育 1h 消化细胞壁，取部分消化产物加入 PCR 体系检测阳性克隆。0074 将阳性克隆挑入 YPD 液体培养基活化后转接入 BMGY 液体培养基中，培养至 OD 为1.0 时接入 1甲醇诱导，诱导 72h，每 24h 补加一次甲醇用于表达本发明的生物酶。0075 实施例 2 ：生物酶的发酵制备0076 取原种菌种在 YPD 平板上划线，30，倒置培养过夜。从平板上挑单菌落 ( 直径1mm) 至 50ml YPD 液体培养基 ( 酵母粉 10g，蛋白胨 10g，葡萄糖 10g，加水定容至 1L) 中，30、200rpm 摇床振荡过夜培养过夜 (24h)。OD600 长至 4-5。以 10的接种。
24、量接种到300mlYPD 液体培养基中 (1L 三角瓶 ) 摇瓶中，30、200rpm 摇床振荡培养，约 24h 后 OD600长到 12 左右。将发酵培养基按每升料配置好后，倒入发酵罐 (30L)，121灭菌 30min ；降温后控制温度 30，使用氨水调节 pH 值至 5.0。将长好的种子液接种进罐，接种量 5。根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在 30以上。培养 24h 左右，待溶氧突变上升，此时湿重约为 140g/L，开始补料 30 (w/v) 甘油，补料速度约为 15ml/L 发酵液 / 小时，补料速度控制溶氧保持在 30以上 ；待菌体湿重长至 180g/L 左右，停止补加甘油，以 7。
25、.2ml/L 发酵液/ 小时流速流加 100甲醇，诱导 10h 后，pH 值调节为 6.0，诱导 24h，pH 值调节为 7.0，补料速度保持不变，根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在 30以上。诱导 96h 后菌体湿重约为 340g/L 左右放罐。离心，收集清液，超滤浓缩后冻干，得到合成丙谷二肽用生物酶冻干粉350g。0077 实施例 3 ：0078 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用NaOH水溶液(2M)调 pH 至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol。
26、)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 60g。0079 精制 ：把 60g 丙谷二肽粗品溶于 60mL 水中，于 50，加入 300mL 甲醇，缓慢降温至5-10析晶 4h，离心过滤，烘干粉碎得 51g 丙谷二肽纯品，收率 85，纯度 99。依照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 V D) 测定。0080 实施。
27、例 4 ：0081 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至15,用NaOH水溶液(2M)调 pH 至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入说 明 书CN 104480075 A6/8 页820g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50。
28、减压烘干得丙谷二肽粗品 50g。0082 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 83，纯度 98。0083 实施例 5 ：0084 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至5,用氨水调pH至9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 (590mmol) 溶解于 100mL 水中 ) 滴加入反应体系中，同时滴加 NaOH 水溶液 (2M)，使pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入 20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除。
29、盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 55g。0085 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 85，纯度 97。0086 实施例 6 ：0087 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用NaOH水溶液(2M)调 pH 至 9.3，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min。
30、，加入20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 45g。0088 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 86，纯度 92。0089 实施例 7 ：0090 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用NaOH水溶液(2M)调 pH 至 8.8，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.。
31、0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 48g。0091 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 87，纯度 94。0092 实施例 8 ：0093 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用氨水调pH至9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 (590mmol) 溶解于 100mL 水中 ) 滴加入反应体系中，同时滴加氨水。
32、溶液 (20 )，使pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入 20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 65g。0094 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 86，纯度 97。0095 实施例 9 ：0096 将 158g L- 谷氨酰胺 (1.08mol) 加入 1400mL 水中，降温至 10 , 用氨水调 pH 至9.0，将630mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将225g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(1.62mol)溶解于2。
33、00mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加氨水溶液(20)，说 明 书CN 104480075 A7/8 页9使pH保持在8.9-9.0 ；pH不变时，反应结束，加热升温至60失活30min，加入100g活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 165g。0097 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 88，纯度 98。0098 实施例 10 ：0099 将 158g L- 谷氨酰胺 (1.08mol) 加入 1400mL 水中，降温至 10 , 用氨水调 pH 至9.0，将630mg酶干粉加入到反应体系中,然后。
34、将L-丙氨酸甲酯水溶液(将250g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(1.80mol)溶解于200mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加氨水溶液(20)，使pH保持在8.9-9.0 ；pH不变时，反应结束，加热升温至60失活30min，加入100g活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 169g。0100 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 87，纯度 97。0101 实施例 11 ：0102 将 58g L- 谷氨酰胺 (397mmol) 加入 400mL 水中，降温至 10 , 用 LiOH 溶液 (2M)调 pH 。
35、至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加LiOH溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入 20g活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 41g。0103 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 85，纯度 96。0104 实施例 12 ：0105 将 58g L- 谷氨酰胺 (397mmol。
36、) 加入 400mL 水中，降温至 10 , 用 KOH 溶液 (2M)调 pH 至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 (590mmol) 溶解于 100mL 水中 ) 滴加入反应体系中，同时滴加 KOH 溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入 20g活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 45g。0106 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 。
37、83，纯度 97。0107 实施例 13 ：0108 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用K2CO3溶液(2M)调 pH 至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 (590mmol) 溶解于 100mL 水中 ) 滴加入反应体系中，同时滴加 K2CO3溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50。
38、减压烘干得丙谷二肽粗品 50g。0109 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 82，纯度 97。0110 实施例 14 ：0111 将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10,用Na2CO3溶液(2M)调 pH 至 9.0，将 110mg 酶干粉加入到反应体系中 , 然后将 L- 丙氨酸甲酯水溶液 ( 将 82g 说 明 书CN 104480075 A8/8 页10L- 丙氨酸甲酯盐酸盐 (590mmol) 溶解于 100mL 水中 ) 滴加入反应体系中，同时滴加 Na2CO3溶液 (2M)，使 pH 保持在 8.9-9.0 ；pH 不变时，反应结束，加热升温至 60失活 30min，加入20g 活性炭，搅拌 10min 后过滤 ；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出 ；降温过滤，固体在 50减压烘干得丙谷二肽粗品 50g。0112 所述粗品的精制与实施例 3 同，收率 84，纯度 98。0113 本说明书描述了一些实施方式，然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书可获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应当包括在所附权利要求书范围内。说 明 书CN 104480075 A。