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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410786562.3(22)申请日 2014.12.18C12N 5/071(2010.01)(71)申请人 苏州大学地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路 8号(72)发明人 张学光 秦明德 梁含思 李芳孙青(74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103代理人 陶海锋(54) 发明名称汗腺细胞诱导培养基及其应用(57) 摘要本发明公开了一种汗腺细胞诱导培养基及其应用，所述汗腺细胞诱导培养基包括 DMEM/F12细胞培养基、角质化细胞培养基、胎牛血清、表皮生长因子、三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松、胰岛素 - 。
2、转铁蛋白 - 亚硒酸钠、L- 谷氨酰胺、青霉素、链霉素、肝细胞生长因子以及骨形态发生蛋白 4。采用本发明的汗腺细胞诱导培养基可以成功诱导干细胞定向分化为汗腺样细胞，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺细胞，大大改善病人的生活质量。也为研究汗腺的分化发育提供的理论依据，具有潜在的临床应用前景。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图6页(10)申请公布号 CN 104450606 A(43)申请公布日 2015.03.25CN 104450606 A1/1 页21.一种汗腺细胞诱导培养基，其特征在于 ：所述汗腺细胞诱导培养。
3、基包括体积比为（0.8 1） 1 的 DMEM/F12 细胞培养基和角质化细胞培养基 ；还包括以下成分，各成分的用量为 ：胎牛血清 3 6%表皮生长因子 40 55g/L三碘甲状腺原氨酸 0.5 1.5mmol/L氢化可的松 0.1 0.3mg/L胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸钠 0.5 2%L- 谷氨酰胺 0.5 2mmol/L青霉素 0.02 0.08U/L链霉素 0.02 0.09g/L肝细胞生长因子 20 30g/L骨形态发生蛋白 4 8 12g/L。2.根据权利要求 1 所述汗腺细胞诱导培养基，其特征在于 ：所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为 0.9 1 的 DMEM/F12 细胞。
4、培养基和角质化细胞培养基 ；还包括以下成分，各成分的用量为 ：胎牛血清 5%表皮生长因子 50g/L三碘甲状腺原氨酸 1mmol/L氢化可的松 0.2mg/L胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸钠 1%L- 谷氨酰胺 1mmol/L青霉素 0.05U/L链霉素 0.05g/L肝细胞生长因子 25g/L骨形态发生蛋白 4 10g/L。3.根据权利要求 1 或者 2 所述汗腺细胞诱导培养基，其特征在于 ：所述角质化细胞培养基为 KGM2 细胞培养基。4.权利要求1或者2所述汗腺细胞诱导培养基在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用。5.根据权利要求 4 所述的应用，其特征在于 ：所述干细胞为羊水干细胞或者。
5、多潜能干细胞。权 利 要 求 书CN 104450606 A1/6 页3汗腺细胞诱导培养基及其应用技术领域0001 本发明涉及一种汗腺细胞诱导培养基及其在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用，属于汗腺细胞培养技术领域。背景技术0002 我国烧伤年发病率约为 1.5% 2%，即每年约有千万人遭受不同程度烧伤，近万人严重烧伤，其中约 10% 病人由于缺乏皮源无法挽救其性命。大面积烧伤获救病人由于无功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能，严重影响病人生活质量。大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。0003 皮肤是人体最大的器官，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。其中汗。
6、腺作为重要的功能性皮肤附属器，在调节体温，分泌汗液及排出人体部分代谢产物的过程中发挥着重要的作用。人体中汗腺分为两种，顶泌汗腺和外泌汗腺。顶泌汗腺较大，有较大的官腔，与体温调节无关。外泌汗腺较小，分布于人体全身，参与体温调节。0004 外泌汗腺分为导管部和分泌部。分泌部位于真皮层或皮下组织内，是卷曲的小管，而导管部开口于表皮层，连接分泌部和外界环境。0005 轻度烧伤，汗腺的导管细胞可以其深部未受创部分为模版，通过干细胞的分化形成它特有的三维结构而完全修复。但是，全层皮肤大面积深度烧伤，汗腺则不能依赖干细胞的分裂增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。0006 人体内存在的汗腺数量是一定的，。
7、由于其发育是一个复杂的过程，一旦大面积受损，将无法快速有效的恢复有功能性的汗腺。故创面虽经覆盖，但无排汗功能，严重影响病人生活质量。0007 皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。目前，汗腺组织的发育机制还不明确，无法实现临床大量移植。研究表明，干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织 ；然而对于真皮层组织中的功能性皮肤附属器，目前干细胞汗腺细胞定向分化尚未见报道。0008 利用胶原酶消化皮肤，待汗腺个体游离出来在倒置显微镜下吸取分离出至培养皿中培养可以形成汗腺细胞。但目前对此研究存在一些问题，如汗腺分离纯化困难且在体外培养传代有限，限制其应用 ；。
8、同时，体外培养汗腺所用的培养基目前还没有确定，对于汗腺细胞体外培养效果均不理想。0009 现有研究发现，与汗腺细胞共培养的干细胞可分化为汗腺细胞。将汗腺细胞进行热休克处理，收集热休克后汗腺细胞的培养上清，与间充质干细胞共培养，发现间充质干细胞可以分化成具有汗腺表型的细胞。但是这一方法也存在问题，由于汗腺细胞分离纯化和传代培养效率低，获取大量培养上清存在困难 ；而且培养上清成分不清楚，其具体作用机制也不明 ；特别是能否获得具有功能性的汗腺细胞还不确定。0010 因此研发新的诱导分化培养基，建立新型高效的干细胞汗腺细胞定向分化方法十分必要。说 明 书CN 104450606 A2/6 页4发明内容。
9、0011 本发明的目的是提供一种可以将干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的诱导分化培养基 ；并公开了利用其将干细胞诱导分化为汗腺样细胞的方法，从而解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。0012 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是 ：一种汗腺细胞诱导培养基，所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为（0.8 1） 1 的 DMEM/F12 细胞培养基和角质化细胞培养基 ；还包括以下成分，各成分的用量为 ：胎牛血清 3 6%表皮生长因子 40 55g/L三碘甲状腺原氨酸 0.5 1.5mmol/L氢化可的松 0.1 0.3mg/L胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸钠 0.5 2%L- 谷氨酰胺 0.。
10、5 2mmol/L青霉素 0.02 0.08U/L链霉素 0.02 0.09g/L肝细胞生长因子 20 30g/L骨形态发生蛋白 4 8 12g/L。0013 优选的，所述汗腺细胞诱导培养基包括体积比为 0.9 1 的 DMEM/F12 细胞培养基和角质化细胞培养基 ；还包括以下成分，各成分的用量为 ：胎牛血清 5%表皮生长因子 50g/L三碘甲状腺原氨酸 1mmol/L氢化可的松 0.2mg/L胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸钠 1%L- 谷氨酰胺 1mmol/L青霉素 0.05U/L链霉素 0.05g/L肝细胞生长因子 25g/L骨形态发生蛋白 4 10g/L。0014 上述技术方案中，所。
11、述角质化细胞培养基为 KGM2 细胞培养基。0015 本发明还公开了上述汗腺细胞诱导培养基在诱导干细胞分化为汗腺样细胞中的应用。0016 上述技术方案中，所述干细胞为羊水干细胞或者多潜能干细胞。0017 利用上述汗腺细胞诱导培养基诱导干细胞分化为汗腺样细胞的方法，包括取干细胞铺于培养皿中，贴壁培养 ；待所述干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基，开始诱导干细胞 ；然后每天更换汗腺细胞诱导培养基 ；待诱导后的干细胞生长至汇合率为 70 80%，进行消化传代，按 1 传 3 的比例接种至新的培养皿中，添加汗腺定向诱导分化培养基 ；诱导分化一段时间后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测。干细胞的数。
12、量与培养器具有说 明 书CN 104450606 A3/6 页5关，如果太多细胞的生长会太快导致消化传代的次数会增多，比如取 1105干细胞种在 6孔板里，密度比较合适。0018 本发明中，羊水干细胞（Amniotic Fluid Stem Cell, AFS）具有良好的增殖效率以及低免疫源性，是一种新型的干细胞。0019 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点 :1本发明公开了一种新的汗腺诱导培养基，能有效的诱导干细胞分化为汗腺样细胞 ；运用本发明的汗腺诱导培养基可很好地将干细胞在体外诱导分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞，并且该汗腺样细胞在胶中可形成类似于汗腺结构的管状结构。
13、。0020 2本发明以 DMEM/F12 细胞培养基和角质化细胞培养基为基础培养基配置新的汗腺诱导培养基，用于诱导干细胞转化为汗腺细胞时的培养设备简单，操作步骤简便、快速，成本低，适用于大量干细胞的诱导分化，易于推广普及。附图说明0021 附图 1 为实施例一中人羊水干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的形态图 ；附图 2 为实施例一中 mRNA 水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图 ；附图 3 为实施例一中诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图 ；附图 4 为实施例一中人羊水干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的透射电镜图 ；附图 5 为实施例一中人汗腺组织、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细。
14、胞的汗腺样导管结构图 ；附图 6 为实施例一中人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程图 ；附图 7 为实施例二中多潜能干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的形态图 ；附图 8 为实施例二中 mRNA 水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图 ；附图 9 为实施例二中诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图 ；附图 10 为实施例二中多潜能干细胞、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的透射电镜图；附图 11 为实施例二中人汗腺组织、诱导后的汗腺样细胞、人汗腺细胞的汗腺样导管结构图 ；附图 12 为实施例二中多潜能干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程图。具体实施方式0022 。
15、下面结合实施例与附图对本发明作进一步描述 :实施例一 ：诱导人羊水干细胞分化为汗腺样细胞汗腺细胞诱导培养基，包括 450mL DMEM/F12 细胞培养基（Hyclone，SH30023.01B），500mL 角质化细胞培养基（KGM2）（Lonza，CC-3107），额外添加 50mL 特级胎牛血清、1mmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.2mg/L 氢化可的松、1% 胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸钠、1mmol/L L- 谷氨酰胺、0.05U/L青霉素和0.05g/L链霉素 ；再加入50g/L表皮生长因子（EGF），25g/L 肝细胞生长因子（HGF）以及 10g/L 骨形态发生蛋白 4（B。
16、MP4）。说 明 书CN 104450606 A4/6 页60023 诱导羊水干细胞分化为汗腺样细胞，包括以下步骤 ：（1）取 5104个 / 孔的人羊水干细胞铺于 6 孔板中，使用羊水干细胞培养基培养 ；羊水干细胞培养基 ：-MEM 培养基中添加 15% 胎牛血清（FBS），1 mM L- 谷氨酰胺和0.05U/L 青霉素，0.05g/L 链霉素，18%Chang B 和 2%Chang C 培养基 ；（2）20h 后，待羊水干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基 ；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基 ；（3）待诱导后的羊水干细胞生长至汇合率为 80%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
17、，使用 1mL 0.25% 胰酶对细胞消化 2 分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200 转 / 分钟，离心 5 分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按 1 传 3 的比例接种细胞至新的培养皿中 ；（4）重复步骤（3），诱导分化 28 天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测。0024 附图 1 为体外培养的人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出人羊水干细胞，细胞较小，呈梭型，排列无规则 ；由人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，排列规则 ；人汗腺细胞。
18、，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。人羊水干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。0025 附图 2 为 mRNA 水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图。Realtime-PCR 结果显示，人羊水干细胞在诱导的过程中，逐渐表达汗腺细胞指标 EDA、EDAR、K8 和 CEA，且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。人羊水干细胞（hAFS）作为阴性对照，人汗腺细胞（hSG）作为阳性对照。0026 附图 3 为诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图。经过 28 天的诱导，用流式细胞仪技术检测诱导后的细胞在汗腺细胞指标上的表达。经过。
19、分析，人羊水干细胞诱导后的汗腺样细胞表达 EDA 大约 36%，EDAR 大约 43%， K8 大约 45%，CEA 大约 32%。人羊水干细胞可以很好的被诱导分化为汗腺养细胞。0027 附图 4 为透射电镜在细胞器水平上检测人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺指标图。人羊水干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在细胞器水平上接近人汗腺细胞，具体表现在诱导后的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛（黑色箭头），而人羊水干细胞则没有微绒毛。0028 附图 5 为人汗腺组织，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺样导管结构图，图中可见汗腺管状结构的横截面，能观察到汗腺。
20、管腔 ；人羊水干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺管状结构，可见管状结构横截面以及管腔 ；人汗腺细胞在胶中形成的管状结构，可见管状结构横截面以及管腔。0029 附图6 为人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。0030 实施例二 ：诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞汗腺细胞诱导培养基，包括450mLDMEM/F12细胞培养基、450mL角质化细胞培养基（KGM2），额外添加55mL特级胎牛血清、1.5mmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.3mg/L氢化可的松、2%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1.5mmol/L L-谷氨。
21、酰胺、0.08U/L青霉素和0.09g/L链说 明 书CN 104450606 A5/6 页7霉素 ；再加入 55g/L 表皮生长因子（EGF），30g/L 肝细胞生长因子（HGF）以及 8g/L 骨形态发生蛋白 4（BMP4）。0031 诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞，包括以下步骤 ：（1）取 1105个 / 孔的多潜能干细胞铺于 6 孔板中，使用多潜能干细胞培养基培养 ；多潜能干细胞培养基 ：含 20%KnockOut 血清、1% 非必需氨基酸、0.1mmol/L-2- 巯基乙醇、4g/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.1ug/L链霉素的 。
22、DMED F12 细胞培养基。0032 （2）24h 后，待多潜能干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基 ；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基 ；（3）待诱导后的多潜能干细胞生长至汇合率为70%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，使用 0.8mL 0.25% 胰酶对细胞消化 2 分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按 1 传 4 的比例接种细胞至新的培养皿中 ；（4）重复步骤（3），诱导分化 21 天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测，利用汗腺细胞诱导培养基可以成。
23、功将多潜能干细胞诱导为汗腺样细胞。0033 附图 7 为体外培养的多潜能干细胞，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出多潜能干细胞，细胞较小，呈克隆样生长，细胞核质比较高 ；由多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，核质比变小 ；人汗腺细胞，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。多潜能干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。0034 附图 8 为 mRNA 水平上检测诱导得到的汗腺样细胞的汗腺指标图。Realtime-PCR 结果显示，多潜能干细胞在诱导的过程中，。
24、逐渐表达汗腺细胞指标 EDA、EDAR、K8 和 CEA，且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。多潜能干细胞（SG-iPS）作为阴性对照，人汗腺细胞（SG）作为阳性对照。0035 附图 9 为诱导得到的汗腺样细胞的分化比率图。经过 21 天的诱导，用流式细胞仪技术检测诱导后的细胞在汗腺细胞指标上的表达。经过分析，多潜能干细胞诱导后的汗腺样细胞表达 EDA 大约 63%，EDAR 大约 65%， K8 大约 76%，CEA 大约 56%。多潜能干细胞可以被高产率的诱导分化为汗腺养细胞。0036 附图 10 为透射电镜在细胞器水平上检测多潜能干细胞，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺。
25、指标图。多潜能干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在细胞器水平上接近人汗腺细胞，具体表现在诱导后的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛（黑色箭头），而多潜能干细胞则没有微绒毛。0037 附图 11 为人汗腺组织，多潜能干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞的汗腺样导管结构图，图中可见汗腺管状结构的横截面，能观察到汗腺管腔 ；多潜能干细胞诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺管状结构，可见管状结构横截面以及管腔 ；人汗腺细胞在胶中形成的管状结构，可见管状结构横截面以及管腔。0038 附图 12 为多潜能干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。说 明 书CN 104450606 A6/6 页80039 综上所述，可以使用本发明的汗腺细胞诱导培养基成功诱导干细胞定向分化为汗腺样细胞，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺细胞，大大改善病人的生活质量。也为研究汗腺的分化发育提供的理论依据，具有潜在的临床应用前景。说 明 书CN 104450606 A1/6 页9图1说 明 书 附 图CN 104450606 A2/6 页10图2图3说 明 书 附 图CN 104450606 A。