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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410766997.1(22)申请日 2014.12.12C07F 7/20(2006.01)C07F 7/18(2006.01)B01D 15/08(2006.01)G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)(71)申请人 重庆华邦制药有限公司地址 401121 重庆市渝北区人和星光大道69 号(72)发明人 曾正英 周春燕(74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务所 11308代理人 黎昌莉(54) 发明名称卡泊三醇的中间体 Mb 及其杂质的分离测定方法(57) 摘要本发涉及一种卡泊三醇的中。
2、间体 Mb 及其杂质的分离测定方法。该方法采用多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶为填充剂的色谱柱，以乙酸乙酯 - 正己烷或者三氯甲烷 - 乙腈或者水 - 乙醇为流动相，进行了Mb及其杂质 ：Mb的20S-异构体、E、D、F、VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 的分离测定。该方法不仅能够实现Mb及杂质的有效分离，还能够准确测定 Mb 及其杂质的含量，专属性强，准确度高；该操作方法简单，具有简便、快速的优点。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书3页 说明书9页 附图7页(10)申请公布号 CN 104478921 A(43)申请公布日 。
3、2015.04.01CN 104478921 A1/3 页21.一种高效液相色谱法分离如下式所示的 Mb 及其杂质的方法，其特征在于 ：所述方法采用多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶为填充剂的色谱柱进行分离 ；2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于 ：所述杂质包括如下所示的 Mb 的 20S- 异构体、E、D、F、VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) ：权 利 要 求 书CN 104478921 A2/3 页33.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于 ：所述方法以乙酸乙酯 - 正己烷或者三氯甲烷 - 乙腈或者水 - 乙醇为流动相。4.根据权利要求 3 所述的方法，其特征在于 。
4、：所述色谱柱的规格为 4.6250mm,5m或 4250mm,5m ；所述流动相的流速为 0.8-2.0ml/min。5.根据权利要求 2 至 4 任一项所述的方法，其特征在于 ：针对所述 Mb、Mb 的 20S- 异构体和 E 进行分离时，以乙酸乙酯 : 正己烷体积比 2:98 为流动相 ；针对所述 Mb、D 和 F 进行分离时，以三氯甲烷 : 乙腈体积比 8:92 为流动相 ；针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离时，以水 : 乙醇体积比 10:90 为流动相。6.根据权利要求 5 所述的方法，其特征在于 ：针对所述 Mb、Mb 的 20S- 异构体和 E 进行分。
5、离时，设置流动相流速为 1.5ml/min ；针对所述 Mb、D 和 F 进行分离时，设置流动相流速为 2.0ml/min ；针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离时，设置流动相流速为 0.8ml/min。7.一种高效液相色谱法分离测定 Mb 及其杂质的方法，其特征在于 ：在权利要求 5 所述的方法的基础上，在波长 272nm 进行检测。8.根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于 ：采用自身对照法进行分析并计算各成分含量。9.根据权利要求 8 所述的方法，其特征在于 ：针对所述 Mb、Mb 的 20S- 异构体和 E 进行分离测定时，包括以下步骤 ：权 利 要 求 。
6、书CN 104478921 A3/3 页4(1)E 定位溶液 ：称取杂质 E 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL E 定位溶液 ；(2)Mb 的 20S- 异构体定位溶液 ：称取杂质 Mb 的 20S- 异构体约 5mg 加稀释剂溶解制成0.1mg/mL20S- 异构体定位溶液 ；(3)Mb 对照品定位溶液 ：称取对照品 Mb 约 15mg 加稀释剂溶解制成 0.6mg/mL Mb 对照品定位溶液 ；(4) 供试品溶液 ：取供试品约 15mg 加稀释剂溶解制成 0.6mg/mL 供试品溶液 ；(5) 自身对照溶液 ：精密移取供试品溶液 1.0ml，置 100ml 量瓶中，加稀释剂溶。
7、解制成0.006mg/mL 自身对照溶液 ；(6) 测定方法 ：设置流动相流速为 1.5ml/min，分别取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，按自身对照法计算各杂质的含量 ；针对所述 Mb、D 和 F 进行分离测定时，包括以下步骤 ：(1)D 定位溶液 ：称取杂质 D 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL D 定位溶液 ；(2)F 定位溶液 ：称取杂质 F 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL F 定位溶液 ；(3)Mb 对照品定位溶液 ：称取对照品约 10mg 加稀释剂溶解制成 1mg/mL Mb 对照品定位溶液 ；(4) 供试品溶液 ：取供试品适量，加稀释剂溶解制成 。
8、1mg/ml 供试品溶液 ；(5) 杂质 D 贮备液 ：取杂质 D 适量，加稀释剂溶解制成 0.1mg/ml 杂质 D 贮备液 ；(6) 杂质 F 贮备液 ：取杂质 F 适量，加稀释剂溶解制成 0.1mg/ml 杂质 F 贮备液 ；(7) 对照品溶液 ：分别精密移取杂质 D 贮备液和杂质 F 贮备液各 1.0ml，加稀释剂溶解制成 0.001mg/ml 对照品溶液 ；(8) 测定方法 ：设置流动相流速为 2.0ml/min，分别取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，比较供试品溶液与对照品溶液中杂质的峰面积 ；针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离测定时，包括以下步骤 。
9、：(1)VD2定位溶液 ：称取杂质 VD2 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mLVD2定位溶液 ；(2)I(Ma) 定位溶液 ：称取杂质 I(Ma)5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL I(Ma) 定位溶液；(3)Mb 的 1- 异构体定位溶液 ：称取杂质 Mb 的 1- 异构体 5mg 加稀释剂溶解制成0.1mg/mL Mb 的 1- 异构体定位溶液 ；(4) 供试品溶液 ：取供试品适量，加稀释剂溶解制成 1mg/ml 供试品溶液 ；(5)杂质Mb的1-异构体贮备液 ：取杂质1-异构体适量，加稀释剂溶解制成0.1mg/ml 杂质 1- 异构体贮备液 ；(6) 对照品溶液 ：精。
10、密移取杂质 1 异构体贮备液 1.0ml，加稀释剂溶解制成 0.001mg/ml 对照品溶液 ；(7) 测定方法 ：设置流动相流速为 0.8ml/min，分别取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，比较供试品溶液与对照品溶液中杂质的峰面积 ；所述稀释剂为相应的流动相或流动相中的一种有机溶剂。10.一种固定相及流动相在分离和 / 或测定 Mb 及其杂质的色谱法中的应用，所述固定相为多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶，所述流动相为乙酸乙酯 - 正己烷或者三氯甲烷 - 乙腈或者水 - 乙醇。权 利 要 求 书CN 104478921 A1/9 页5卡泊三醇的中间体 Mb 及其杂质的分离测定方法技术领域。
11、0001 本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种卡泊三醇的中间体 Mb 及其杂质的分离测定方法。背景技术0002 卡泊三醇是维生素 D 的衍生物，能抑制皮肤细胞 ( 角朊细胞 ) 的过度增生和诱导其分化，从而使银屑病皮肤细胞的增生及分化异常得以纠正。Mb 是合成卡泊三醇的一个重要的中间体，化学名称 ：(S)-2-(3R,3aR,7E,7aS)- 八氢 -7-(E)-2-(3S,5R)-3,5- 双 叔丁基二甲基硅 氧基 -2- 亚甲基环己亚基 乙烯基 -3a- 甲基 -1H- 茚 -3- 基 ) 丙醛 ；英文名称 ：(S)-2-(3R,3aR,7E,7aS)-octahydro-7-(E)-2-。
12、(3S,5R)-3,5-Bis(tert-butyl)dimethylsilyloxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-3a-methyl-1H-inden-3-yl)propanal ；其结构式如下 ：0003 0004 在 Mb 的合成中，其合成使用的原料 (VD2、三苯基磷及其氧化产物三苯基氧磷 )，以及合成过程产生的中间体 (D、E、F、I(Ma)、副产物 (Mb 的 20S- 异构体、Mb 的 1,- 异构体 )，这些都是最终获得的 Mb 中含有的杂质，它们的结构式如下 ：0005 说 明 书CN 104478921 A2/9 页6000。
13、6 为了控制 Mb 的质量，需要对 Mb 及其杂质进行分离测定。但是，目前还没有分离测定 Mb 及其杂质的 HPLC 方法。本发明对分离测定 Mb 及其杂质的 HPLC 方法进行了探索。说 明 书CN 104478921 A3/9 页7发明内容0007 有鉴于此，本发明首先提供一种高效液相色谱法分离 Mb 及其杂质的方法，该方法能够有效实现 Mb 及杂质的分离。0008 为实现上述目的，本发明的技术方案为 ：0009 一种高效液相色谱法分离如下式所示的 Mb 及其杂质的方法，其特征在于 ：所述方法采用多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶为填充剂的色谱柱进行分离。0010 进一步，所述杂质包括如下。
14、所示的 Mb 的 20S- 异构体、E、D、F、VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) ：0011 0012 说 明 书CN 104478921 A4/9 页80013 进一步，所述方法以乙酸乙酯 - 正己烷或者三氯甲烷 - 乙腈或者水 - 乙醇为流动相。0014 进一步，所述色谱柱的规格为 4.6250mm,5m 或 4250mm,5m ；所述流动相的流速为 0.8-2.0ml/min。0015 进一步，针对所述 Mb、Mb 的 20S- 异构体和 E 进行分离时，以乙酸乙酯 : 正己烷体积比 2:98 为流动相 ；针对所述 Mb、D 和 F 进行分离时，以三氯甲烷 : 乙腈体积比 8。
15、:92 为流动相 ；针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离时，以水 : 乙醇体积比 10:90 为流动相。0016 进一步，针对所述Mb、Mb的20S-异构体和E进行分离时，设置流动相流速为1.5ml/min ；针对所述 Mb、D 和 F 进行分离时，设置流动相流速为 2.0ml/min ；针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离时，设置流动相流速为 0.8ml/min。0017 本发明还提供一种高效液相色谱法分离测定 Mb 及其杂质的方法，该方法不仅能够实现 Mb 及杂质的有效分离，而且能够准确测定 Mb 及有关杂质的含量。0018 为实现上。
16、述目的，本发明的技术方案为 ：0019 一种高效液相色谱法分离测定 Mb 及其杂质的方法，在上述方法对 Mb 及其杂质分离的基础上，在波长 272nm 进行检测。0020 进一步，采用自身对照法进行分析并计算各成分含量。0021 具体地，计算式如下 ：0022 说 明 书CN 104478921 A5/9 页90023 总杂质 单个杂质含量0024 式 中 ：AX供试品溶液中各杂质的峰面积 ；0025 Ar对照溶液中主成分峰面积。0026 具体地，针对所述 Mb、Mb 的 20S- 异构体和 E 进行分离测定时，包括以下步骤 ：0027 (1)E 定位溶液 ：称取杂质 E 约 5mg 加稀释剂。
17、溶解制成 0.1mg/mL E 定位溶液 ；(2)Mb 的 20S- 异构体定位溶液 ：称取杂质 Mb 的 20S- 异构体约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL20S- 异构体定位溶液 ；(3)Mb 对照品定位溶液 ：称取对照品 Mb 约 15mg 加稀释剂溶解制成 0.6mg/mL Mb 对照品定位溶液 ；(4) 供试品溶液 ：取供试品约 15mg 加稀释剂溶解制成0.6mg/mL供试品溶液 ；(5)自身对照溶液 ：精密移取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解制成 0.006mg/mL 自身对照溶液 ；(6) 测定方法 ：设置流动相流速为 1.5ml/min，分别。
18、取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，按自身对照法计算各杂质的含量。0028 针对所述 Mb、D 和 F 进行分离测定时，包括以下步骤 ：0029 (1)D 定位溶液 ：称取杂质 D 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL D 定位溶液 ；(2)F定位溶液 ：称取杂质 F 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL F 定位溶液 ；(3)Mb 对照品定位溶液 ：称取对照品约10mg加稀释剂溶解制成1mg/mL Mb对照品定位溶液 ；(4)供试品溶液 ：取供试品适量，加稀释剂溶解制成 1mg/ml 供试品溶液 ；(5) 杂质 D 贮备液 ：取杂质 D 适量，加稀释剂溶解制成 0.1m。
19、g/ml 杂质 D 贮备液 ；(6) 杂质 F 贮备液 ：取杂质 F 适量，加稀释剂溶解制成 0.1mg/ml 杂质 F 贮备液 ；(7) 对照品溶液 ：分别精密移取杂质 D 贮备液和杂质 F 贮备液各 1.0ml，加稀释剂溶解制成 0.001mg/ml 对照品溶液 ；(8) 测定方法 ：设置流动相流速为 2.0ml/min，分别取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，比较供试品溶液与对照品溶液中杂质的峰面积。0030 针对所述 VD2、Mb 的 1- 异构体和 I(Ma) 进行分离测定时，包括以下步骤 ：0031 (1)VD2定位溶液 ：称取杂质 VD2 约 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1m。
20、g/mL VD2定位溶液 ；(2)I(Ma)定位溶液 ：称取杂质I(Ma)5mg加稀释剂溶解制成0.1mg/mL I(Ma)定位溶液 ；(3)Mb 的 1- 异构体定位溶液 ：称取杂质 Mb 的 1- 异构体 5mg 加稀释剂溶解制成 0.1mg/mL Mb 的 1- 异构体定位溶液 ；(4) 供试品溶液 ：取供试品适量，加稀释剂溶解制成 1mg/ml 供试品溶液 ；(5) 杂质 Mb 的 1- 异构体贮备液 ：取杂质 1- 异构体适量，加稀释剂溶解制成 0.1mg/ml 杂质 1- 异构体贮备液 ；(6) 对照品溶液 ：精密移取杂质 1 异构体贮备液 1.0ml，加稀释剂溶解制成 0.001。
21、mg/ml 对照品溶液 ；(7) 测定方法 ：设置流动相流速为0.8ml/min，分别取上述溶液 20l 进样，记录色谱图，比较供试品溶液与对照品溶液中杂质的峰面积。0032 上述所述稀释剂为各自对应的流动相，或各自对应的流动相中的一种有机溶剂。0033 本发明采用多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶为填充剂的色谱柱，以乙酸乙酯-正己烷或三氯甲烷-乙腈或水-乙醇为流动相，成功解决了MB与杂质的有效分离问题，进而可以准确测定 Mb 的含量，实现了杂质有效控制，从根本上确定了产品质量。0034 因此，本发明还保护一种固定相及流动相在分离和 / 或测定 Mb 及其杂质的色谱法中的应用，所述固定相为多孔。
22、硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶，所述流动相为乙酸乙说 明 书CN 104478921 A6/9 页10酯 - 正己烷或者三氯甲烷 - 乙腈或者水 - 乙醇。所述色谱法具体包括高效液相色谱、液质联用色谱、薄层色谱等。0035 本发明的有益技术效果是 ：0036 本发明 HPLC 的方法，采用多孔硅胶微粒或十八烷基键合多孔硅胶为填充剂的色谱柱，以乙酸乙酯 - 正己烷或三氯甲烷 - 乙腈或水 - 乙醇为流动相对 Mb 及杂质进行检测。特别是，针对原料 VD2、中间体 I(Ma)、副产物 Mb 的 1,- 异构体的检测，针对中间体 D、E、F的检测，针对副产物 Mb 的 20S- 异构体、E、的检测，。
23、分别建立了一套 HPLC 分析方法。该方法不仅能够实现 Mb 及杂质的有效分离，还能够准确测定 Mb 及其杂质的含量，专属性强，准确度高 ；该操作方法简单，具有简便、快速的优点。附图说明0037 图 1 为实施例 1Mb 对照品 HPLC 图，图 1 中的色谱峰为 Mb 对照品的色谱峰，保留时间在 7.5min 左右 ；0038 图 2 为实施例 1 杂质 20S- 异构体对照品 HPLC 图，图 2 中的色谱峰为杂质 20S- 异构体的色谱峰，保留时间在 6.8min 左右 ；0039 图 3 为实施例 1 杂质 E 对照品 HPLC 图，图 3 中的色谱峰为杂质 E 的色谱峰，保留时间在 。
24、37.7min 左右 ；0040 图 4 为实施例 1 混合 HPLC 图，图 4 中的色谱峰为 Mb、20S- 异构体、E 的色谱峰，保留时间依次为 ：7.41min，6.89min，37.65min ；0041 图 5 为实施例 2Mb 对照品 HPLC 图，图 4 中的色谱峰为 Mb 的色谱峰，保留时间在4.1min 左右 ；0042 图 6 为实施例 2 杂质 D 对照品 HPLC 图，图 5 中的色谱峰为杂质 D 的色谱峰，保留时间在 11.1min 左右 ；0043 图 7 为实施例 2 杂质 F 对照品 HPLC 图，图 6 中的色谱峰为杂质 F 的色谱峰，保留时间在 18.0m。
25、in 左右 ；0044 图 8 为实施例 2 混合 HPLC 图，图 8 中的色谱峰为 Mb、D、F 的色谱峰，保留时间依次为 ：4.11min，11.04min，17.97min ；0045 图 9 为实施例 3Mb 对照品 HPLC 图，图 7 中的色谱峰为 Mb 的色谱峰，保留时间在33.9min 左右 ；0046 图10为实施例3杂质VD2对照品 HPLC 图，图 8 中的色谱峰为杂质 VD2的色谱峰，保留时间在 17.5min 左右 ；0047 图 11 为实施例 3 杂质 I(Ma) 对照品 HPLC 图，图 8 中的色谱峰为杂质 I(Ma) 的色谱峰，保留时间在 4.2min 左右 ；0048 图12为实施例3杂质1-异构体对照品HPLC图，图8中的色谱峰为杂质1-异构体的色谱峰，保留时间在 40.3min 左右 ；0049 图 13 为实施例 3 混合 HPLC 图，图 13 中的色谱峰为 Mb，VD2，I(Ma)，1- 异构体的色谱峰，保留时间依次为 ：33.84min，17.54min，4.18min，40.27min。具体实施方式说 明 书CN 104478921 A。