说明书两个色酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及2个色酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
真菌能产生生物碱、肽类、聚酮类、甾体和萜类等类型的次生代谢产物，其中很多具有显著的抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗虫等生物活性。从真菌中寻找活性化合物是天然药物研发的一个热点。色酮类化合物是一类自然界中存在的具有多种生物活性的物质，无论是天然存在的，还是合成得到的，都引起了化学家等广泛关注。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供2个具有抗肿瘤活性的色酮类化合物。
本发明通过多种柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021的发酵产物中分离得到2个新的色酮类化合物，它们具有抑制多种肿瘤细胞生长的细胞毒活性，可用于制备抗肿瘤药物，从而实现了本发明的目的。
本发明的色酮类化合物，其结构如式(Ⅰ)所示：
本发明的第二个目的是提供白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021，其保藏 编号为：CCTCC NO：M 2014521。
本发明的第三个目的是提供如式(Ⅰ)所示的色酮类化合物的制备方法，其特征在于，是从白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021的发酵培养物中分离得到的。
所述的如式(Ⅰ)所示的色酮类化合物的制备方法，优选包括以下步骤：
(1)制备白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021的发酵产物；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物用丙酮或丙酮水溶液提取，再用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；
(3)将步骤(2)所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过常压硅胶柱层析，以氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，得到能用氯仿-甲醇体积比9：1溶剂系统薄层层析展开的组份A，和氯仿-甲醇体积比7：1溶剂系统薄层层析展开的组份B，组份A经硅胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，得到化合物1，组份B经硅胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，得到化合物2。
步骤(1)中所述的白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021的发酵产物可以将白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021接种到青霉属真菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下制得。优选的制备方法是将白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021接种于淀粉培养基中，于转速200r/min摇床、温度28℃培养2天，得到种子液，再将种子液接种于大米培养基中，于室温静置培养28天得到发酵产物，所述的淀粉培养基每升含有10g葡萄糖，10g可溶性淀粉，1g KH2PO4，1g MgSO4，1g细菌学蛋白胨，30g海盐，20g琼脂，余量为水；所述的大米培养基每750ml水中加入500g大米，2.5g酵母膏，2.5g葡萄糖， 22.5g海盐；步骤(2)所述的萃取最好用乙酸乙酯，所述的浓缩可以采用常规的方法如减压浓缩。
本发明的第四个目的是提供白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021在制备式(Ⅰ)所示的色酮类化合物中的应用。
通过体外抗肿瘤活性筛选实验，结果显示：本发明的式(Ⅰ)所示的色酮类化合物能抑制组织细胞淋巴瘤细胞U937、子宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2和Huh7、前列腺癌PC3、食管癌Eca9706、白血病细胞KG和K562、喉癌细胞Hep2细胞的生长，它们的IC50值如表3所示，由此证明本发明的式(Ⅰ)所示的色酮类化合物可以用于制备抗肿瘤的药物。
因此，本发明的第五个目的是提供式(Ⅰ)所示的色酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
当所述的色酮类化合物为式(Ⅰ)中的化合物2时，所述的抗肿瘤药物优选是抗淋巴瘤、子宫颈癌、人乳腺癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、白血病或喉癌的药物。
本发明的第六个目的是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的式(Ⅰ)所示的色酮类化合物和药学上可以接受的载体。
当所述的色酮类化合物为式(Ⅰ)中的化合物2时，所述的抗肿瘤药物优选是抗淋巴瘤、子宫颈癌、人乳腺癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、白血病或喉癌的药物。
本发明的式(Ⅰ)所示的色酮类化合物对淋巴瘤细胞U937、子宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2和Huh7、前列腺癌PC3、食管癌Eca9706、白血病细胞KG和K562、喉癌细胞Hep2细胞的生长有较强的抑制作用，在制备抗肿瘤药物方面有良好的应 用前景。
本发明的白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021，于2014年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2014521。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：式(I)所示的色酮类化合物1-2的制备
每瓶大米培养基是这样配制的：将500克大米，2.5g酵母膏，2.5g葡萄糖，22.5g海盐加入到750ml水中。将大米培养基装入约10个1000mL的三角烧瓶中，在121℃高压蒸汽灭菌25分钟。
每升淀粉培养基是这样配制的：将10g葡萄糖，10g可溶性淀粉，1g KH2PO4，1g MgSO4，1g细菌学蛋白胨，30g海盐，加入到水中，定容1L。121℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
淀粉琼脂培养基是在每升淀粉培养基中加入20g琼脂。
用移液枪吸取约20ml的白色侧齿霉菌(Engyodontium album)DFFSCS021菌种接种入淀粉琼脂培养基上，28℃培养3天，得到培养有菌种的平板，然后用竹签从平板中挑取约3微升菌种接种于含150mL上述装有淀粉培养基的三角烧瓶中，于摇床(转速200r/min)温度28℃培养2天，得到种子液，在上述每瓶装有大米培养基的三角瓶中接种20mL种子液，于室温(26℃)静置培养28天后，收取发酵产物。
将经大米培养基培养得到的发酵产物用体积分数80％丙酮水溶液浸泡提取，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物121g。乙酸乙酯提取物用正相硅胶(100-200目)干 法拌样后，装入玻璃层析柱(含100-200目正相硅胶约2kg)，进行常温柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，根据薄层层析(GF254硅胶板)情况合并各个流份，回收洗脱溶剂，蒸干流分用甲醇转移。总共合并得到9个组分(A-I组份)，将组分A(褐色浸膏，溶于氯仿和甲醇，能用氯仿-甲醇体积比9：1溶剂系统薄层层析展开的组份)经过中压反相柱，以甲醇-水溶剂系统为洗脱剂，从体积10：90到100:0进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，总共得到5个组分(组分4-1到4-5)，组分4-3(黄色浸膏，溶于氯仿和甲醇，能用氯仿-甲醇体积比9：1溶剂系统薄层层析展开的组份)经过高效液相色谱(YMC-Pack,ODS-A S-5μm×12nm 250×20mm i.d.,5mL/min，乙腈-水-三氟乙酸，体积比50-50-0.03)纯化得到化合物1(保留时间为34.5min)。将组分B(褐色浸膏，溶于氯仿和甲醇，能用氯仿-甲醇体积比7：1溶剂系统薄层层析展开的组份)经过中压反相柱，以甲醇-水溶剂系统为洗脱剂，从体积10：90到100:0进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，总共得到6个组分(组分8-1到8-6)；组分8-3(褐色浸膏，溶于氯仿和甲醇，能用氯仿-甲醇体积比7：1溶剂系统薄层层析展开的组份)经过高效液相色谱(YMC-Pack,ODS-A S-5μm×12nm 250×20mm i.d.,5mL/min，乙腈-水-三氟乙酸：35-65-0.03)纯化得到化合物2(保留时间为22.0min)；
结构推定：
化合物1：通过高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 331.0801[M+H]+处给出准分子离子峰，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C17H14O7。13C NMR谱和DEPT谱显示分子中有17个碳原子，分别为δC 180.2(C，C-9)，166.2(C，C-14)，160.2(C，C-8)，156.2(C，C-12)，155.5(C，C-6)，154.4(C，C-2)，152.0(C，C-11)，121.3(CH，C-3)，120.8(CH， C-4)，120.3(C，C-1)，117.1(C，C-10)，113.4(C，C-13)，107.2(CH，C-7)，103.9(CH，C-3)，62.3(CH2，C-16)，56.8(CH3，OCH3-2)，52.4(CH3，C-15)。1H谱分别为δH 12.11(1H，s，OH-8)，7.79(1H，d，J＝9.0Hz，H-3)，7.82(1H，d，J＝9.0Hz，H-4)，7.02(1H，s，H-5)，6.77(1H，s，H-7)，4.60(2H，s，H-16)，3.88(3H，s，OCH3-2)，3.87(3H，s，H-15)。这些NMR信号与化合物sydowinin B基本骨架的NMR信号相似[1.Healy,P.C.；Hocking,A.；Tran-Dinh,N.；Pitt,J.I.；Shivas,R.G.；Mitchell,J.K.；Kotiw,M.；Davis,R.A.Phytochemistry.2003,65,2373-2378.2.Little,A.；Porco,J.J.Org.Lett.2012,14,2862-2865.]，这说明化合物1具有色酮类化合物的结构特征(A环和B环的基本骨架)。在HMBC谱中，化学位移δH 12.11的活泼氢与C-7，C-8，C-13相关，说明有一个羟基连接在8号位，化学位移(δH3.88)的甲基氢与C-2相关，说明该甲基连接到2号位碳上，化学位移(δH 4.60)的氢与C-5，C-6，C-7相关，说明该羟甲基连接在6号位的碳上。此外，柑橘1号位的碳的化学位移为120.3，而化学位移(δH 3.87)的甲基氢与C-14相关，说明该甲基氢连接在1号位的碳上。因此确定化合物1的结构如式(I)中的1所示，化合物1为黄色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、DMSO，难溶于水。
化合物2：通过高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 319.0922[M+H]+处给出准分子离子峰，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C16H14O7，与AGI-B4的分子式一样[Kim,H.S.；Park,I.Y.；Park,Y.J.；Lee,J.H.；Hong,Y.S.；Lee,J.J.J.Antibiot.2002,55,669-672.]。通过1H NMR谱可以看出，有3个活泼H信号，分别是[δH 12.11(1H,s,),5.90(1H,br s),5.50(1H,br s)]；2个芳香质子信号，分别是[δH 6.98(1H,s),6.75(1H,s)]；4个次甲基信号，分别是[δH 6.49(1H,d,J＝2.0Hz),6.36(1H,d,J＝2.0Hz),5.01(1H,br d,J＝10.0Hz),4.03(1H,d,J＝10.0Hz)]；1个羟甲 基信号[δH 4.56(1H,s)]和一个氧甲基信号[δH 3.58(1H,s)]。13C NMR谱显示存在16个碳，包括2个羰基碳[δC 180.0(C-9),169.7(C-14)]、7个季碳[δC 160.4(C-11),159.3(C-8),154.9(C-12),152.2(C-6),111.0(C-10),108.3(C-7),108.3(C-13)]，5个叔碳[δC 145.0(C-3),119.7(C-4),104.1(C-5),65.9(C-2),41.7(C-1)]，1个仲碳[δC 62.1(C-16)]和1个甲基碳[δC 51.5(C-15)]。化合物2的NMR数据显示，化合物2与AGI-B4的结构具有很大的相似性，唯一的不同在于H-2的化学位移和H-1和H-2间的耦合常数(在化合物4中为10Hz，在AGI-B4中为3.5Hz)，以上说明化合物2是AGI-B4的差向异构体。通过HMBC和HSQC证实，化合物2与AGI-B4具有相同的平面结构，而H-1和H-2间的耦合常数(10Hz)说明H-1和H-2为顺式构型，因此确定化合物2的结构如式(I)中的2所示。
实施例2：如式(I)所示的色酮类化合物1、2的体外抗肿瘤活性筛选实验：
分别收集对数生长期的组织细胞淋巴瘤细胞U937、子宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、Huh7、前列腺癌PC3、食管癌Eca9706、白血病细胞KG、K562、喉癌细胞Hep2用10％血清1640培养基使其悬浮，再接种于96孔培养板，每孔细胞数为5000个/80μL，置于5％CO2培养箱37℃培养。用10％血清1640培养基将含硫色酮类化合物(化合物1或2)稀释成浓度为3.125μg/mL，6.25μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的实验溶液。次日于不同的实验组的培养板中分别加入浓度为3.125 μg/mL,6.25μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的实验溶液20μL，并使每孔中的终浓度达到测试(实验组浓度采用对倍稀释)。另外阴性对照组中加入等量的10％血清1640培养基。48h后，吸取实验组和对照组中的培养液，每孔加入MTT20μL(2.5mg/mL)，继续培养4h，再每孔加入DMSO 100μL终止反应，37℃放置20min，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率。细胞生长率＝(实验组OD÷对照组OD)×100％。
实验结果显示，式(I)所示的色酮类化合物1-2能抑制组织细胞淋巴瘤细胞U937、子宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2和Huh7、前列腺癌PC3、食管癌Eca9706、白血病细胞KG和K562、喉癌细胞Hep2的生长，它们的IC50值如表3所示。因此本发明的如式(I)所示的色酮类化合物能用于制备抗肿瘤药物。
表3.化合物1-2对多种肿瘤细胞的细胞毒活性
NT指没有测试 。