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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410649193.3(22)申请日 2014.11.14C07K 16/18(2006.01)C12N 15/13(2006.01)C12N 15/63(2006.01)A61K 39/395(2006.01)A61P 25/28(2006.01)(71)申请人 吉林大学地址 130012 吉林省长春市前进大街 2699号(72)发明人 张应玖 张媛(74)专利代理机构 长春吉大专利代理有限责任公司 22201代理人 张景林 王恩远(54) 发明名称一种抗 A42 寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因(57) 摘要本发明涉及基因。
2、工程抗体技术领域，具体涉及一种用于诊断与治疗阿尔茨海默病 ( 老年痴呆症 ) 的单链抗体及编码这种单链抗体的基因。更具体地，本发明提供了一种包括重链可变区、轻链可变区和连接肽序列的人源性抗 A42 寡聚体的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的单链抗体能特异性识别并结合 A42 寡聚体，降低 A42 寡聚体的水平，有效抑制 A42 寡聚体的细胞毒性，并且能够有效穿透血脑屏障体外模型。本发明还同时提供了编码该单链抗体的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页序。
3、列表3页 附图3页(10)申请公布号 CN 104479013 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104479013 A1/1 页21.一种单链抗体，其特征在于 ：其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。2.如权利要求 1 所述的单链抗体，其特征在于 ：是人源化抗体。3.权利要求 1 或 2 所述的单链抗体在检测 A42 寡聚体方面的应用。4.权利要求 1 或 2 所述的单链抗体在抑制 A42 单体聚集方面的应用。5.权利要求 1 或 2 所述的单链抗体在促使 A42 寡聚体解聚方面的应用。6.权利要求 1 或 2 所述的单链抗体在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。7.一。
4、种单链抗体基因，其特征在于 ：其 DNA 序列如 SEQ ID NO.4 所示。8.权利要求 7 所述的单链抗体基因在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。9.一种基因工程重组表达载体，其特征在于 ：是由权利要求 7 所述的单链抗体基因与pET-28a、pET-41b、pMA5 或 pPZW103 载体重组构建得到。10.权利要求 9 所述的基因工程重组表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。权 利 要 求 书CN 104479013 A1/7 页3一种抗 A42 寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因技术领域0001 本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种特异性识别并结合 - 淀粉。
5、样蛋白 (A42) 寡聚体的单链抗体及编码该单链抗体的基因。背景技术0002 阿尔茨海默氏症(Alzheimers disease,AD)是最常见的神经退行性疾病，其病理特征是渐进性的 A42 的聚集与沉积、神经突触丢失和神经纤维缠结，临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。对于 AD 的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是 A42 毒性学说。0003 大量研究已证明，由 A42 单体聚集形成的 A42 寡聚体是引起 AD 的主要致病因子。然而，目前国际上试验的诊断或治疗 AD 用抗体，大多是针对 A42 一级序列的，这些抗体与 A42 单体、寡聚体或纤维均能结合。
6、，而非特异地识别并结合 A42 寡聚体，在病理检测及临床诊断中无法特异地检测出 A42 聚集体的水平，同时，这类抗体在对 AD 的治疗中也易引起副作用。0004 在 AD 的被动免疫治疗报道中，多数采用的是人源化的多克隆抗体或单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子人源性抗体或抗体片段出发，筛选特异性识别和结合A42 寡聚体的单链抗体成为目前诊断或治疗 AD 的热点。0005 单链抗体(single chain Fv,scFv)是一种小分子的基因工程抗体，它是在DNA水平上利用基因工程方法将天然抗体重链可变区(VH。
7、)和轻链可变区(VL)通过一段人工合成的链接肽 (Linker) 连接而成的小分子重组抗体。与完整抗体分子相比，它具有以下特点 ：含有完整的抗体可变区，具有较完整的抗原结合位点 ；不含有抗体分子的 Fc 段，因而免疫原性弱，用于人体不易产生免疫反应 ；分子量小，穿透力强，易穿过血脑屏障，适用于 AD 的诊断或治疗 ；体内循环半衰期短，易从血循环中排除 ；不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，所以利于进行基因工程操作和可以利于原核表达系统大量生产。因此，单链抗体是目前报道最多、也最有发展前景的抗 AD 的基因工程抗体。0006 虽然目前国际上已有抗 A42 的单链抗体的报道 (Fukuc。
8、hi K，2006，Biochem Bioph Res Co,344，79-86 ；Yoshihara T 等，2008，J Biochem,143，475-486 ；Zameer A 等，J Mol Biol,384，917-928 ；Robert R等，2009,Protein Eng Des Sel.22，199-208)，但这些单链抗体对 A42寡聚体的特异性不高，亲和性也有限，而且未显示出明显的可诱导A42寡聚体解聚的功效。迄今为止，国内尚未见有特异性结合 A42 寡聚体、并可有效诱导其解聚的单链抗体的报道。发明内容0007 本发明的目的在于提供一种特异性识别并结合 A42 寡聚体的。
9、单链抗体以及编码这种单链抗体的基因。说 明 书CN 104479013 A2/7 页40008 本发明解决了现有抗体无特异性地与包括A42单体在内的所有A42形式均可结合的技术问题，利用基因工程抗体技术成功筛选出特异性与 A42 寡聚体结合，而不与A42 单体及纤维结合的单链抗体。本发明所述的单链抗体与 A42 寡聚体特异性结合的特性与A42的一级结构无关，而是基于A42寡聚体所特有的空间立体构象，是构象依赖型的单链抗体。0009 本发明所述的 A42 寡聚体是由 2 个到几十个不等的 A42 单体聚集形成的聚集体，分子间主要以氢键和疏水键相结合，分子量从 9kDa 至 100kDa 不等。0。
10、010 本发明提供了一种包括重链可变区 (VH)、轻链可变区 (VL) 的人源性抗 A42 寡聚体的单链抗体 MO6，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示，分子量约为 28kDa，其中 VH 具有SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列，VL 具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。0011 本发明还提供了一种编码前面所述的人源性抗A42寡聚体的单链抗体MO6的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。0012 本发明所述的单链抗体 MO6 能够有效抑制 A42 单体的聚集，还能够使 A42 寡聚体解聚，并能明显降低 A42 寡聚体对神经细胞的毒性，在制备抗阿尔茨海默。
11、氏病的药物中具有广泛应用。0013 进一步，本发明所述的单链抗体 MO6 能够有效穿透血脑屏障体外模型。0014 再进一步，本发明所述的编码一种人源性抗 A42 寡聚体的单链抗体 MO6 的基因可与pET-28a、pET-41b、pMA5或片pPZW103构建基因工程表达载体，该基因及该基因工程表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。0015 本发明所述的单链抗体MO6能够特异性识别并结合A42寡聚体，作为检测A42寡聚体的临床诊断制剂和 AD 治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。附图说明0016 图 1 ：pET28a-MO6 重组表达载体的测序谱图 ；0017 图 2 ：纯化的单。
12、链抗体 MO6 的 SDS-PAGE 图谱，其中 M ：蛋白质 Marker ；A ： 阴性对照 ；B: 表达的 MO6 ；C ：纯化的 MO6 ；0018 图 3 ：单链抗体 MO6 与不同形态 A42 的识别的 Dot-Blot 分析谱图 ；0019 图 4 ：ELISA 检测 MO6 与 A42 寡聚体的亲和性曲线图 ；0020 图 5 ：单链抗体 MO6 与不同分子量 A42 的识别 Western blot 分析谱图 ；0021 图 6 ：ThT-F 法分析单链抗体 MO6 抑制 A42 聚集的谱图，其中 A 图为 A42 单体分析谱图，B 图为 A42 寡聚体分析谱图 ；0022 。
13、图 7 ：MTT 法测定单链抗体 MO6 抑制 A42 细胞毒性的柱形图。0023 图 8 ：单链抗体 MO6 穿透体外血脑屏障模型的柱形图。0024 具体实施方式0025 实施例 1 A42 寡聚体和 A42 纤维的制备0026 A42单体(购自美国sigma公司)用冰预冷的六氟异丙醇(HFIP)溶解至浓度为1mg/mL，冰水浴超声 10min，真空干燥，-20冻存。使用时，先将 A42 单体用二甲基亚砜说 明 书CN 104479013 A3/7 页5(DMSO) 溶解至浓度为 1mg/mL，再将 A42 稀释到浓度为 10M 的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4，50mM) 中，终浓度为 10。
14、M，在 37分别孵育 12h 形成 A42 寡聚体的聚集状态以及孵育 3天形成成熟纤维的聚集状态。所有 A42 聚集状态均通过电镜确认。由于 A42 形成聚集体的不可逆性，A42 的寡聚体及纤维的使用均为现用现制备，若短期使用则于 -80储存。0027 实施例 2 阳性克隆的筛选0028 (1) 外周血淋巴细胞 RNA 提取及反转录合成 cDNA0029 外周血淋巴细胞分离提取 ：用乙二胺四乙酸二钾 (EDTA-2K) 抗凝管采集人外周血血样 10mL，用无钙、镁离子的平衡盐缓冲液 (DHanks)( 购自碧云天生物技术研究所 ) 以1:1 体积稀释，以稀释血样与淋巴细胞分离液 2:1( 体积。
15、比 ) 的比例加入聚蔗糖 - 泛影葡胺淋巴细胞分离液 ( 购自美国 sigma 公司 )。室温下，以 2000rpm/min 离心 20min。离心后，吸取单个核细胞层。用 DHanks 洗涤细胞，1000rpm/min 离心 10min，获得外周血淋巴细胞。0030 外周血淋巴细胞 RNA 提取 ：在 1107个外周血淋巴细胞中加入 1mL 苯酚 - 异硫氰酸胍总 RNA 抽提试剂 ( -Reagent)( 购自 Invitrogen 公司 )4静置 5min。加入200l氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色。置于冰上5min。在4条件下，12000rpm/min离心 15min。将上层水相移入另。
16、一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育 10min。以 4条件下，12000rpm/min，离心 10min。弃上清，在沉淀 ( 含 RNA) 中加 1mL 75 ( 体积分数 ) 乙醇洗涤。在 4条件下，12000rpm/min 离心 5min，得到 RNA 沉淀。空气干燥后，用适量三羟甲基氨基甲烷 - 乙二胺四乙酸缓冲液 (TE) 或无 RNA 酶的去离子水溶解备用。0031 反转录合成 cDNA：在反转录酶的作用下用上述提取的 RNA 合成 cDNA 的方法如下，取 4l RNA 加入到 0.1mL 离心管中，加入寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸引物 (Oligo dT Primer)1l 和脱氧核糖。
17、核苷三磷酸混合物 (dNTP)1l，最后以无 RNA 酶去离子水补充至 10l，65保温 5min 后，于冰浴中迅速冷却。在上述离心管中加入反转录缓冲液(5PrimerScript Buffer)4l、RNA 酶抑制剂 (RNase Inhibitor)0.5l、反转录酶(PrimerScript RTase)1l，最后以无RNA酶去离子水补充到20l，缓慢混匀。以42 30-60min，95 5min 的条件进行反转录反应后，冰上冷却。0032 (2) 编码 VH 与 VL 的 DNA 片段扩增0033 依据 VH 和 VL 的保守序列，设计并合成了扩增编码 VH 和 VL 的 DNA 片段。
18、的引物，其序列如下 ：0034 VHS1 5 GGAATTCCATATGCAGGTGCAGCTGGTG 30035 5 CCTGAGCCACCTCCGCCAGAACCGCCTCCACCTGAAGAGACGGT0036 VHA10037 GACCGTTGTCC 30038 5 TGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGAGGATCGGATATCCAGATGA0039 VLS10040 CTCAGTCTCC 30041 VLA1 5 ATAAGAATGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACTTTGGTCC 30042 其中 VHS1 5端的 CATATG 序列是内切酶 Nde 识别位点。
19、，VLA1 3端的 GCGGCCGC序列是内切酶 Not 识别位点。说 明 书CN 104479013 A4/7 页60043 扩增过程如下 ：0044 上述步骤(1)中制备的cDNA用无RNA酶的去离子水释50倍后，取1L分别加入如下扩增编码VH、VL的DNA片段的PCR体系中，编码VH的DNA片段扩增体系 ：VHS1(25mol/L)0.4L，VHA1(25mol/L)0.4L ；编 码 VL 的 DNA 片 段 扩 增 体系 ：VLS1(25mol/L)0.4L，VLA1(25mol/L)0.4L ；两 体 系 再 各 加 入 DNA 聚 合 酶(r-Taq)0.1L，dNTPs 0.8。
20、L，10buffer 1L，无 RNA 酶的去离子 水 6.3L，分别进行目的基因的扩增 ：94 5min，94 30s，55 30s，72 1min 作用 30 个循环，72 10min。最后各取 1L 反应产物进行 1琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分凝胶电泳后用胶回收试剂盒 ( 购自上海生工生物工程有限公司 ) 回收编码 VH、VL 的 DNA 片段。0045 (3) 编码 scFv 的 DNA 片段的拼接和扩增0046 拼接体系如下 ：编码 VH 的 DNA 片段 2L 来自步骤 (2)、编码 VL 的 DNA 片段1L 来自步骤 (2)，dNTPs 0.8L，10buffer 1L，r-T。
21、aq DNA 聚合酶 0.1L，无 RNA酶的去离子水 5.1L，在如下条件下实现编码 scFv 的 DNA 片段的拼接 ：94 5min，94 50s，55 50s，72 1min，作用 30 个循环，72 10min，4保存。0047 编码scFv的DNA片段的扩增 ：将拼接后的编码scFv的DNA片段稀释50倍，取5L加入如下扩增体系中 ：VHS1 2.5L，VLA1 2.5L，r-Taq DNA 聚合酶 0.5L，dNTPs 4L，10buffer 5L，无 RNA 酶的去离子水 30.5L，扩增条件为 ：94 5min，94 30s，55 30s，72 1min，作用30个循环，72。
22、 10min。取1L扩增产物进行1琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收 ( 购自上海生工生物工程有限公司 )。0048 (4) 阳性克隆的筛选0049 引物中所设计的Nde 和Not 酶切位点与本发明所用的原核表达载体pET28a( 通用的大肠杆菌表达载体，含有 T7 强启动子、C- 末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen 等公司有售 ) 的 Nde 和 Not 相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。利用 Nde 和 Not 切割位点将此人源 scFv 基因片段克隆进表达载体pET28a 中 Nde 和 Not 酶切位点之间，连接便得到重组。
23、表达载体。0050 上述表达载体的构建步骤具体如下 ：0051 双酶切反应 ：将1.0g pET28a载体和上述获得的scFv基因片段分别与适量去离子水混匀，使其总体积分别为 18L，各加入 2-3 单位的限制性内切酶 Nde 和 2-3 单位的Not 及2L相应的10H缓冲液，混匀，置37水浴保温2-3小时后，分别采用凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的 DNA( 购自上海生工生物工程有限公司 )。0052 编码 scFv 的 DNA 片段与 pET28a 载体的连接 ：取 0.5g 上述步骤回收的 pET28a载体 DNA，加入 2-10 倍摩尔量的上述步骤得到的编码 scFv 基因片段、2L。
24、10T4 DNA 连接酶缓冲液，加入去离子水定容置 20L，最后加入 1 单位的 T4 DNA 连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置 16水浴过夜，得到连接好的重 组表达载体 pET28a-scFv。0053 重 组 表 达 载 体 pET28a-scFv 转 化 E.coli BL21(DE3) 感 受 态 细 胞【E.coli BL21(DE3) 感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”( 第二版，科学出版社 )49 页】中，冰浴30分钟后置入42水浴保温1分钟，立即取出并置冰浴中冷却2分钟。加入200L 37预热的LB液体培养基，37 150rpm振摇培养60分钟后，取出100。
25、L培养液涂布于含卡那霉素 (Kan) 的 LB 琼脂培养平板上，37培养 12h 后，出现转化菌落。说 明 书CN 104479013 A5/7 页70054 挑取单克隆到96孔细菌培养板上(购自美国Corning公司)，每孔加入LB液体培养基 200L，培养基中含有 100g/mL 卡那霉素 (Kan)。37 200rpm 振摇培养过夜。每孔吸取 2L 菌液，加入到另外一块新的 96 孔细菌培养板中，每孔添加 LB 培养基 200L，培养基含有 100g/mL Kan，37 200rpm 振摇培养至 OD600 0.8 1.0。再向第一块板加入一定体积的甘油，甘油终浓度为 15，-80保存。。
26、向第二块 96 孔板中每孔加入异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)( 购自美国 sigma 公司 ) 至终浓度为 0.05mM，20，160rpm振荡诱导 12h 后，用 96 孔板离心机以 4000rpm 离心 10 分钟，弃去培养基收集菌体。再向 96孔板中加入菌体裂解液冰浴裂解 1 小时，4000rpm 离心 10 分钟，收集裂解后的总蛋白。0055 用10g/mL的A42寡聚体(来自实施例1)以100L/孔包被96孔酶标板(购自美国 Corning 公司 )，4，16-18h。弃抗原液，每孔加入 100L 1 ( 体积比 ) 的牛血清白蛋白(BSA)，于37封闭1h。磷酸盐缓冲液。
27、(PBS)含有0.1(体积比)Tween-20洗板三次，每孔加入 100L 上述收集到的总蛋白，37孵育 2h。阳性对照孔加商品化 A 抗体B4(购自美国Santa cruz公司)，阴性对照孔加BSA。PBS含有0.1(体积比)Tween-20洗板六次。加入100L 1:2000(体积比)稀释的anti-His单抗(购自美国Santa cruz公司)，37孵育1h。PBS含有0.1(体积比)Tween-20洗板六次。加入100L 1:4000(体积比 ) 稀释 HRP 羊抗兔 IgG 抗体 ( 购自中国博士德公司 )，37孵育 1h。PBS 含有 0.1( 体积比 )Tween-20 洗板六次。
28、。加入 3,3,5,5- 四甲基联苯胺 TMB( 购自美国 Amresco 公司 )50L/ 孔，室温避光反应 15min，每孔加 30L 2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测 OD 值( 波长为 450nm)。结果判定 ：以 OD 值超过阴性对照 3 倍为阳性，空白对照的 OD 值应小于0.2。经结果鉴定，筛选出一株与抗原结合力较强的单克隆菌株 MO6 进行后续实验。0056 实施例 3 单链抗体 MO6 基因的 DNA 序列测定0057 提取质粒pET28a-MO6，交由上海生工测序部进行序列测定，结果如图1 (pET28a-MO6 载体测序谱图，其中编码 MO6 的基因为核苷酸 3。
29、8 808 号 ) 所示。将所测得的有效的 MO6 基因序列与 GeneBank 中的免疫球蛋白基因序列进行比对分析，结果证明 ：所获得的 MO6 克隆为一编码 scFv 的 DNA 序列，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA( 其有效核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示 )，它包含了编码抗体重链可变区 (VH)、轻链可变区 (VL)的 DNA 序列，推导得到的氨基酸序列 (SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2) 具有典型的抗体可变区结构。0058 实施例 4 单链抗体 MO6 的表达和制备0059 将含有 pET28a-MO6 质粒的 E.coli BL21(DE3)3。
30、7振摇培养过夜。以 1:100 的比例接种，37振荡培养 OD600 0.8 1.0 后加入 IPTG 诱导 MO6 的表达，20，160rpm 振荡诱导 12h 后，4 5000rpm 离心 5min 收集菌体。以 PBS(pH7.4) 重悬菌体，经超声破碎后离心收集上清。对收集的上清使用 Ni2+-NTA 柱纯化本发明的人源性单链抗体 MO6 ：将上清液缓慢流过 Ni2+-NTA 柱，然后用 8 倍柱体积缓冲液 (20mM 磷酸缓冲液，500mM 氯化钠，20mM 咪唑 ) 洗柱，最后用洗脱缓冲液 (20mM 磷酸缓冲液，500mM 氯化钠，250mM 咪唑 ) 洗脱本发明的人源性单链抗体。
31、 MO6。图 2 示出了所制备的人源性单链抗体 MO6 的 SDS-PAGE 鉴定结果，纯化得到的人源性单链抗体 MO6 分子量约为 28kDa。0060 实施例 5 Dot-blot 检测单链抗体 MO6 与 A42 寡聚体的结合特异性0061 将 A42 单体、寡聚体及纤维置于硝酸纤维素膜上，以 5 ( 体积比 ) 脱脂奶粉说 明 书CN 104479013 A6/7 页8封闭膜，置室温 1h。加入单链抗体 MO6 孵育 1h 后，用 PBS 洗膜 3 次，每次 10min。再加入His-tag 抗体 1 ：1000( 体积比 )，37孵育 1h，用 PBS 含有 0.1 ( 体积比 )T。
32、ween-20洗涤膜 3 次，每次 10min。将膜加入到 HRP 标记的 rabbit IgG1:5000( 体积比 ) 中，37孵育 1h。PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗涤膜 3 次，每次 10min。PBS 洗膜 1 次，10min。将膜经底物发光显色试剂盒 (ECL)( 购自碧云天生物技术研究所 ) 显影，结果如图3 所示，只在 A42 寡聚体处显示出斑点，而在 A42 单体和纤维形态中不显示斑点。0062 实施例 6 单链抗体 MO6 亲和力的测定0063 用间接 ELISA 方法测定单链抗体 MO6 的亲和力，并以抗原抗体复合物的平衡解离常数 (KD) 表。
33、示。用 1g/mL 浓度的 A42 寡聚体包被酶标板 4过夜，用 1的 BSA 于37封闭 1h，在另外一个酶标板中将单链抗体 MO6 与 10-10 10-4mol/L 浓度的 A42 寡聚体混合，加入等体积的封闭液室温孵育 1h，再将混合液加入抗原包被孔 内，37孵育 2h，PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗涤后，每孔加入 100L 1 ：2000( 体积比 ) 稀释的anti His-Tag 抗体，37孵育 1h，PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗涤后加入 TMB 显色，测定 450nm 光密度值 (OD450)如图4所示。KD为达到最大 OD。
34、450值的 50时 A42 寡聚体浓度，由实验数据得知，KD为 5.1910-6M。0064 实施例 7 Western blot 检测单链抗体 MO6 对 A42 寡聚体的识别0065 A42混合物(单体、寡聚体、纤维体积比为1 ：1)经非变性凝胶电泳分离后，转移到聚偏二氟乙烯 PVDF 膜上，以 5 ( 体积比 ) 脱脂牛奶封闭 1h。用 PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗膜 3 次，每次 10min。将膜置于杂交袋中，加入单链抗体 MO6，对照组加入 B4 抗体 1:1000( 体积比 )，室温杂交 2h 后，PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗。
35、膜 3 次，每次 10min。将膜置于杂交袋中，实验组加入 anti His-Tag1:1000( 体积比 ) 抗体，室温杂交 1h 后，PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗膜 3 次，每次 10min。各组分别加入相应的 HRP 标记的 IgG1:15000( 体积比 )，室温杂交 1h。PBS 含有 0.1 ( 体积比 )Tween-20 洗膜 3 次，每次 10min。加入 ECL 显色，结果如图 5 所示 ：MO6 能够特异性识别分子量为 18KDa 35KDa 的区域，即 A42 寡聚体区域，而对 A42 单体、A42 纤维形式没有明显结合。0066 实施例 8 。
36、单链抗体 MO6 对 A42 聚集的抑制作用0067 分别将 A42 单体 ( 购自美国 sigma 公司 )、A42 寡聚体 ( 来自实施例 1) 与等摩尔的单链抗体 MO6 混合，37孵育，分别在 0h，3h，12h，24h 和 48h 用硫磺素 T 荧光染色(ThT-F) 法测定 A42 的聚集程度，结果如图 6 所示。存在单链抗体 MO6 时，A42 单体孵育至 48h 时聚合程度始终明显低于单独 A42 的聚合度，而 A42 寡聚体孵育至 12h 时，其聚集程度始终低于初始状态，由此证明单链抗体MO6不仅可以抑制A42的聚集，还可诱导A42 寡聚体解聚。0068 实施例 9 单链抗体。
37、抑制 A42 寡聚体对细胞的毒性作用0069 将SH-SY5Y细胞以每孔5000个细胞接种多孔细胞培养板，每孔体积100L。细胞于 37培养 24h 后，进行以下 13 组实验 ：0070 说 明 书CN 104479013 A7/7 页90071 以上 13 组分别在 37孵育 20h 后，每孔加入 3-(4,5- 二甲基噻唑 -2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐 (MTT)( 购自美国 sigma 公司 ) 溶液 (5mg/mL)20L，37继续孵育 4h，终止培养，MTT 法检测细胞的存活率，结果如图 7 所示，A42 寡聚体使细胞存活率显著性降低，而经单链抗体 MO6 作用能够明显升高细。
38、胞存活率，并且 MO6 抑制 A42 寡聚体对细胞的毒性作用呈浓度依赖性。然而，单链抗体 MO6 对 A42 单体及纤维抑制作用不显著。这些结果也说明了，单链抗体 MO6 与 A42 寡聚体形态的亲和能力较强，能够有效的结合 A42 寡聚体并抑制其对细胞的毒性作用。0072 实施例 10 体外血脑屏障模型建立及单链抗体穿透血脑屏障的检测0073 应用人脐静脉血管内皮细胞HUVEC及胶质瘤细胞C6进行共培养的方法，建立体外血脑屏障模型。0074 共培养方法如下 ：人脐静脉血管内皮细胞 HUVEC 培养条件 ：在 Hams F12K 培养基中加入终浓度为 2mM L- 谷氨酰胺，1.5g/L 碳酸。
39、氢钠，0.03mg/mL 内皮细胞生长因子支持物(ECGS)，及 10胎牛血清。0075 胶质瘤细胞 C6 培养条件 ：在 DMEM-F12 培养基中加入终浓度为 10胎牛血清。0076 先将 C6 细胞以 45,000 个 / 孔接种于 PET 膜的底面，贴壁后将 transwell 小室正置，受池加入适量培养基，2 3 天后在 PET 正面以 30,000 个 / 孔接种 HUVEC 细胞，37、5 CO2及饱和湿度条件下共培养 5 7 天。0077 鉴定 ：0078 a. 光学显微镜下观察0079 b. 试漏实验 ：使 transwell 小室内外液面差达 0.5cm 以上，培养 4h 。
40、后观察液面差的变化。0080 c. 检测跨内皮电阻值 (transendothelial electrical resistance,TEER) ：使用MilliCell-ERS Voltohmmeter测量HUVEC与C6细胞共培养双侧电阻值。每天更换新 鲜培养基同时测量 TEER 值，直至显微镜下确认细胞已完全融合且 TEER 值达到稳定。0081 单链抗体穿透血脑屏障的检测 ：当 HUVEC/C6 细胞共培养 5 7 天，检测 TEER 值达到630ohm/cm2并稳定后，进行单链抗体跨血脑屏障转运检测实验。在小室内加入5g单链抗体 MO6。当 5min，15min，30min，60min，90min，及 120min 时，在小室外侧吸取 60l 样品，加入到酶标板中，4包被过夜。ELISA 方法检测单链抗体 MO6 穿透血脑屏障。结果如图 8所示，单链抗体MO6穿透血脑屏障随时间增长而增加，并且在60min后穿透率达到峰值并呈现稳定。结果证明，单链抗体 MO6 能够有效穿透血脑屏障。说 明 书CN 104479013 A1/3 页100001 0002 序 列 表CN 104479013 A。