双羰基还原酶突变体及其应用.pdf

本发明公开了一种双羰基还原酶突变体及其应用。该双羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少两个突变位点：第94位、第151位、第231位、第236位和第251位，且第94位的I突变为V、A或G；第151位的V突变为Q、N或S；第231位的F突变为W、Y或P；第236位的I突变为L、V或A；第251位的Q突变为H、R或K；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。具有上述突变位点的双羰基还原酶突变体酶活性大幅度提高。

权利要求书
1.  一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸序列具有如下至少两个突变位点：第94位、第151位、第231位、第236位和第251位，且所述第94位的I突变为V、A或G；第151位的V突变为Q、N或S；第231位的F突变为W、Y或P；第236位的I突变为L、V或A；第251位的Q突变为H、R或K；或者所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

2.  根据权利要求1所述的双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或者
所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。

3.  一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2所述的双羰基还原酶突变体。

4.  根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，
所述DNA分子的序列为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14所示序列；或者
所述DNA分子的序列为与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14具有95％以上同源性的序列。

5.  一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3或4所述的DNA分子。

6.  根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

7.  一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。

8.  根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

9.  一种生产3R，5S-二羟基化合物的方法，包括双羰基还原酶对二酮类化合物进行催化反应的步骤，其特征在于，所述双羰基还原酶为权利要求1或2所述的双羰基还原酶突变体。

10.  根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述二酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基；优选所述二酮类化合物选自6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸甲酯或者6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸乙酯。

说明书双羰基还原酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶及酶工程领域，具体而言，涉及一种双羰基还原酶突变体及其应用。
背景技术
酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。
理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directed Mutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。
定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。
羰基还原酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，羰基还原酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。而双羰基还原酶能够立体选择性地将二酮酸酯的两个羰基同时还原为相应羟基，可以用于合成关键的药物中间体，尤其是合成他汀类药物的手性二羟基己酸链，如世界上畅销的降胆固醇药物阿托伐他汀(Atorvastatin，立普妥)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)。
目前已知的双羰基还原酶可以作为生物催化剂，一步还原二酮底物，制备得到近乎单一光学纯度的他汀类降血脂药物关键手性中间体3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如酶催化活性较低，使酶液的用量较大，且使反应体系总体积增加，导致了生产批次和生产成本的增加。
因此，仍需要对现有的双羰基还原酶进行改进，以提高双羰基还原酶(DKR)的酶立体选择性和催化活性。
发明内容
本发明旨在提供一种双羰基还原酶突变体及其应用，以提高双羰基还原酶(DKR)的酶 立体选择性和催化活性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种双羰基还原酶突变体，该双羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少两个突变位点：第94位、第151位、第231位、第236位和第251位，且第94位的I突变为V、A或G；第151位的V突变为Q、N或S；第231位的F突变为W、Y或P；第236位的I突变为L、V或A；第251位的Q突变为H、R或K；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子，DNA分子编码上述任一种双羰基还原酶突变体。
进一步地，DNA分子的序列为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14所示序列；或者DNA分子的序列为与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14具有95％以上同源性的序列。
根据本发明的又一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的再一方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明的另一方面，提供了一种生产3R，5S-二羟基化合物的方法，包括双羰基还原酶对二酮类化合物进行催化反应的步骤，双羰基还原酶为上述任一种双羰基还原酶突变体。
进一步地，二酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基；优选 二酮类化合物选自6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸甲酯或者6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸乙酯。
应用本发明的技术方案，本发明的上述双羰基还原酶突变体是在SEQ ID NO：9所编码的双羰基还原酶F231W+I94V突变体的基础上，通过定点饱和突变的方法进行进一步突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的本发明的双羰基还原酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于本发明所用的双羰基还原酶母本提高了2倍，甚至是3倍，并且酶特异性也有相应提高，从而大幅度降低了3R，5S-二羟基化合物工业生产中的成本。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明所涉及合成3R，5S-双羟基化合物的化学反应过程示意图；
图2示出了本发明所涉及合成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯的化学反应方程式；
图3示出了本发明所涉及合成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯的化学反应方程式；
图4示出了结合NAD的双羰基还原酶的三维结构模拟图；
图5示出了有效突变位点的双羰基还原酶的三维结构模拟图；以及
图6示出了本发明优选实施例中双羰基还原酶突变体的蛋白电泳检测结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
由于现有技术中的双羰基还原酶存在催化活性低、酶液用量大而不适合工业化应用的缺陷，为了改善上述缺陷，本发明的发明人基于之前公开的来源于Rhodococcus erythropolis SK121的双羰基还原酶及其编码基因(CN201410188168)，进行了更深入的研究。该双羰基还原酶可以作为生物催化剂，通过一步还原二酮底物，制备得到近乎单一光学纯度的他汀类降血脂药物关键手性中间体3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯，简化了合成步骤，降低了生产污染。在此基础上，发明人采用定点饱和突变的方法对该双羰基还原酶进行改造(CN201410196920)，得到了酶活性大幅度提高的突变体F231W+I94V，该突变体在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯的合成中酶的用量由6wt降低到2wt；但其在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯的合成中，酶的用量为9wt，酶液的用量较大，使反应体系总体积增加，导致了生产批次和生产成本的增加。因此，本发明就是在双羰基还原酶突变体F231W+I94V的基础上进行的改进，以提高双羰基还原酶(DKR)的酶立体选择性和催化活性，扩大其应用范围。
本发明以红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)的突变体F231W+I94V的基因(如SEQ ID NO：9所示)为起始基因进行基因突变，通过定向筛选的方法获得一系列酶活性提高的双羰基还原酶突变体。
通过采用软件对双羰基还原酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现其中I94位于NAD 结合区域(参见图4)，V151、F231、I236和Q251四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变一方面可能提高了底物结合的亲和性，从而使酶的活性得到提高，另一方面可能提高了底物结合的方向性，从而使酶的特异性提高(参见图5)。
本发明的双羰基还原酶突变体的突变氨基酸残基位于底物结合位点或与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的的区域，例如I94位于NAD结合区域，V151、F231、I236和Q251四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变可能提高了底物结合的特异性，从而使酶的活性得到提高。本发明的实验结果表明，在F231W突变的基础上，引入Q251H突变可大量提高双羰基还原酶的活性。单一的I236L突变即可显著的提高双羰基还原酶的催化特异性，且单一的Q251H突变可显著的提高双羰基还原酶的催化活性。在F231W和/或V151Q和/或I94V突变的基础上，引入Q251H突变也可显著提高其双羰基还原酶的活性。I236L突变引入F231W和/或V151Q和/或I94V能显著提高双羰基还原酶产物的特异性。组合F231W和/或I94V和/或I236L和/或Q251H既能有效提高双羰基还原酶的活性，同时也能显著提高双羰基还原酶产物的特异性。
上述得到的双羰基还原酶突变体可以通过基因工程手段，将其基因连接到pET-22b(+)以及其它表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，在30℃，pH6.0条件下，可以一步还原3R，5S-双羟基化合物的制备原料得到光学纯度较高的3R，5S-双羟基化合物。
在上述研究结果的基础上，本发明提供了一种双羰基还原酶突变体，该双羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少两个突变位点：第94位、第151位、第231位、第236位和第251位，且第94位的I突变为V、A或G；第151位的V突变为Q、N或S；第231位的F突变为W、Y或P；第236位的I突变为L、V或A；第251位的Q突变为H、R或K；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
本发明的上述双羰基还原酶突变体是在SEQ ID NO：9所编码的双羰基还原酶F231W+I94V突变体的基础上，通过定点饱和突变的方法进行进一步突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的本发明的双羰基还原酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于本发明所用的双羰基还原酶母本提高了2倍，甚至是3倍，并且酶特异性也有相应提高，从而大幅度降低了3R，5S-二羟基化合物工业生产中的成本。
在本发明一种优选的实施例中，上述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5；或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性。
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的双羰基还原酶活性的活性。在上述实例中，优选双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5具有95％以上的同源性并具有或编码具有改进的双羰基还原酶活性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。
而在本发明一种更优选的实施例中，上述双羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的突变位点为F231W+Q251H；SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的突变位点为F231W+I94V+I236L；SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的突变位点为I94V+F231W+I236L+Q251H；SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的突变位点为F231W+I94V+Q251H；SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的突变位点为I94V+V151Q+F231W+Q251H。具有上述氨基酸序列的双羰基还原酶突变体制备3R，5S-双羟基化合物，所获得的3R，5S-二羟基化合物的ee值大于99％，de值为99％左右。本发明的上述双羰基还原酶突变体为关键的药物中间体，尤其是他汀类药物的手性二羟基己酸链的合成提供了高效的催化剂，使3R，5S-二羟基化合物的工业生产成本得到大幅度降低。
在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种双羰基还原酶突变体，其所编码的双羰基还原酶具有更高的酶催化活性，利于降低3R，5S-二羟基化合物工业生产中的成本。
在本发明一种优选的实施例中，上述DNA分子的序列为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14；或者上述DNA分子的序列与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或者SEQ ID NO：14具有95％以上的同源性。具有上述序列的DNA分子能够编码活性进一步提高的双羰基还原酶。
在上述实施例中，SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：9所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，且第751-753bp的CAA突变为CAT或CAC。上述优选实施例中，SEQ ID NO：11为SEQ ID NO：9所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第706-708bp的ATC突变为TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG。上述优选实施例中，EQ ID NO：12为SEQ ID NO：9所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第706-708bp的ATC突变为TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，且第751-753bp的CAA突变为CAT或CAC。上述优选实施例中，SEQ ID NO：13为SEQ ID NO：9所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第751-753bp的CAA突变为CAT或CAC。上述优选实施例中，SEQ ID NO：14为SEQ ID NO：9所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG，且第751-753bp的CAA突变为CAT或CAC。
上述优选实施例中，具有上述序列的DNA分子能够编码酶催化活性更高的双羰基还原酶，其酶活性比现有技术中的双羰基还原酶的活性高2倍，甚至3倍，能够大大降低3R，5S-二羟基化合物工业生产成本。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子,涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
在本发明又一种典型的实施方式中，还提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种 DNA分子的序列。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)，pET-3a(+)，pET-3d(+)，pET-11a(+)，pET-12a(+)，pET-14b(+)，pET-15b(+)，pET-16b(+)，pET-17b(+)，pET-19b(+)，pET-20b(+)，pET-21a(+)，pET-23a(+)，pET-23b(+)，pET-24a(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28a(+)，pET-29a(+)，pET-30a(+)，pET-31b(+)，pET-32a(+)，pET-35b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a(+)，pET-41b(+)，pET-42a(+)，pET-43a(+)，pET-43b(+)，pET-44a(+)，pET-49b(+)，pQE2，pQE9，pQE30，pQE31，pQE32，pQE40，pQE70，pQE80，pRSET-A，pRSET-B，pRSET-C，pGEX-5X-1，pGEX-6p-1，pGEX-6p-2，pBV220，pBV221，pBV222，pTrc99A，pTwin1，pEZZ18，pKK232-18，pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。
在本发明再一种典型的实施方式中，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
在本发明一种典型的实施方式中，还提供了一种生产3R，5S-二羟基化合物的方法，包括双羰基还原酶对二酮类化合物进行催化反应的步骤，其中，双羰基还原酶为上述任一种双羰基还原酶突变体。由于本发明的上述双羰基还原酶具有更高的酶催化活性，因而利用本发明的双羰基还原酶突变体制备的3R，5S-二羟基化合物不仅能够降低生产成本，而且所获得的3R，5S-二羟基化合物的ee值大于99％，de值为99％左右。
在上述方法中，3R，5S-双羟基化合物的制备原料，可以为已经在市场上商业化的原料或者容易制备的酮类化合物，在本发明中，优选二酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基；更优选二酮类化合物选自6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯、6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸甲酯或者6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸乙酯。本发明的双羰基还原酶突变体对通式I所示的二酮类化合物进行催化还原生成3R，5S-双羟基化合物的反应过程如图1所示。
本发明的上述方法中，双羰基还原酶突变体与现有技术的双羰基还原酶相比，具有催化活性增加、底物谱变广、热稳定增加以及pH稳定性增加的优点，因而能够催化上述更加光谱的底物，且催化活性较高。在本发明一个优选的实施例中，本发明的突变体在3R，5S-双羟基化合物转化反应中，其双羰基还原酶突变体的用量仅为起始基因编码的双羰基还原酶用量的50％，且产物的de值提高到99％，适用于工业应用。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例1：
对来源于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)进行定点饱和突变。
将双羰基还原酶(DKR)的氨基酸序列在Swiss-model网站模拟蛋白质的三维结构，然后通过Docking进行底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸(图4)。
根据突变氨基酸及其两侧的碱基序列(突变氨基酸请见表1.中的突变位点)，用Primmer5.0设计相应的突变引物(表1)。以含双羰基还原酶基因的pET22b(+)表达载体(购买于Novagen，产品编号69744)为模版，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DPnⅠ消化除去母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。
表1：点饱和突变引物序列


实施例2：双羰基还原酶突变体的初筛
根据实施例1所述内容，挑取上述固体培养基上的单菌落接种于96深孔板中，每孔预先加入1ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃，220rpm振荡培养3h后，加入IPTG终浓度为0.1mM，18℃，220rpm诱导培养16h，4000g离心15min收集菌体，菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，12000rpm离心5min获得上清液，即突变体粗酶液，用于酶标仪进行活性初筛。向96孔板中加入30μL DMSO，1.5μL主原料6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯(30mg/mL溶于DMSO)，2.5μL NADH(20mg/mL)，216μL磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，于340nm进行本底检测，然后分别向各孔中加入已经制备好的突变体酶液50μL，并立即于30℃检测340nm处吸光光度值的变化。
酶活计算公式：酶活(u/mL)＝(ΔA×60×V1)/(6.22×t×V2)
ΔA:反应过程中的吸光光度值变化量；
V1：反应体系的总体积；
6.22：消光系数； 
t：ΔA的检测时间； 
V2：加入的酶液体积。
实施例3：双羰基还原酶突变体的复筛
将实施例2中酶活高于母本的突变体接种于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，在18℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用于活性检测。向10ml反应瓶中加入0.05g主原料(6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯或6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯)，0.5ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入4.0ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，主原料均匀分散于缓冲液中；加入1.5mg NAD+，20.6mg甲酸铵，10mg辅酶甲酸脱氢酶和0.5ml双羰基还原酶，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温16h后，薄层色谱(TLC)跟踪，选取转化产品点明显、主原料点不明显的体系进行乙酸乙酯萃取，静置分液，取有机相进行HPLC分析。
选取催化活性优于母本的突变体进行测序，分析突变位点，并进行放大培养，复测催化活性确定突变体F231W+Q251H(SEQ ID NO：1)、F231W+I94V+I236L(SEQ ID NO：2)、I94V+F231W+I236L+Q251H(SEQ ID NO：3)、F231W+I94V+Q251H(SEQ ID NO：4)和I94V+V151Q+F231W+Q251H(SEQ ID NO：5)的催化活性比本方案母本显著提高，复筛结 果如表2和表3所示。采用软件对双羰基还原酶的三维结构进行计算机模拟分析，其中I94位于NAD结合区域，V151、F231、I236和Q251四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变一方面可能提高了底物结合的亲和性，从而使酶的活性得到提高，另一方面可能提高了底物结合的方向性，从而使酶的特异性提高(图5)。
表2双羰基还原酶母本与突变体制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯活性比较
SEQ ID NO: 位点 酶量a转化 DE％ EE％ 1 F231W+Q251H 1wt 80.14 90.08 100 2 F231W+I94V+I236L 3wt 74.42 98.98 100 3 I94V+F231W+I236L+Q251H 1wt 83.38 99 100 4 F231W+I94V+Q251H 1wt 78.48 89.66 100 5 I94V+V151Q+F231W+Q251H 1wt 77.68 89.8 100 6 母本(F231W+I94V) 2wt 72.91 89.89 100
表3.双羰基还原酶母本与突变体制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯活性比较
SEQ ID NO： 位点 酶量a转化 DE％ EE％ 1 F231W+Q251H 3wt 79.55 96.48 100 2 F231W+I94V+I236L 3wt 70.43 99.16 100 3 I94V+F231W+I236L+Q251H 2wt 81.9 99.12 100 4 F231W+I94V+Q251H 2wt 75.95 93.54 100 5 I94V+V151Q+F231W+Q251H 2wt 72.78 93.94 100 6 母本(F231W+I94V) 8wt 80.11 90.15 100
注：表2和表3中的a指转化1g底物所需各双羰基还原酶突变体重组细胞的湿重；1wt指转化1g主原料需要1g双羰基还原酶突变体重组湿细胞。
实施例4：双羰基还原酶突变体的克隆与表达
为了便于双羰基还原酶突变体的表达以及鉴定，在其基因的5’和3’末端设计了兼容的限制性酶切位点。可以采用NdeⅠ和XhoⅠ分别将目的基因和pET-22b(+)(其他可在大肠杆菌中表达蛋白质的表达质粒也可使用)分别同时进行酶切，酶切后的目的基因和质粒的较大片段用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。
挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体命名为pET22b(+)-R-M并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。挑取上述培养平板上长出的单菌落并接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用菌落PCR进行鉴定，将含有正确的表达载体的大肠杆菌进行后续的诱导表达。将上述菌液转接于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.7时，加入IPTG至终浓度分 别为0.02～0.5mM，在18～25℃下进行诱导表达10～16h后，取出菌液，6000g离心15min收集菌体，于-20℃冻存备用。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液和沉淀，上清液用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测。表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，具体见图6中箭头所指大小。
在图6中，1表示突变体F231W+Q251H；2表示突变体F231W+I94V+I236L；3表示标准分子量蛋白marker：由上到下分别为97KDa、66KDa、43KDa、31KDa、14KDa；4表示突变体I94V+F231W+I236L+Q251H；5表示突变体F231W+I94V+Q251H；6表示突变体I94V+V151Q+F231W+Q251H；7表示母本(F231W+I94V)。
以下实施例5至8以6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯或6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯为主原料，以本发明所提供的双羰基还原酶突变体作为酶进行催化还原反应，具体反应方程式如图2或如图3所示，具体应用过程如下：
实施例5：双羰基还原酶突变体I94V+F231W+I236L+Q251H在3R，5S-双羟基化合物制备中的应用
选用符合通式I的二酮化合物(通式I)为初始原料，其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。所述的双羟基产物由以下化学通式II表达：(通式II)，其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
(1)双羰基还原酶突变体I94V+F231W+I236L+Q251H在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯制备中的应用
向100ml反应瓶中加入1g主原料6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯：4ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入35ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.03gNAD+，0.42g甲酸铵，0.1g辅酶甲酸脱氢酶和1wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W+I236L+Q251H的粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用40ml甲基叔丁基醚停止反应，用20g硅藻土过滤，40ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，产品3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯：体系中(6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯)的比例为81～83％，收率83～85％，ee值大于99.5％，de值99-99.3％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.29-7.35(m，5H)，4.53(s，2H)，4.21(m，1H)，4.05(m，1H)，3.43～3.39(m，4H)，2.40(d，2H)，1.65(t，2H)，1.42(S，9H)。
鉴于其他4个双羰基还原酶突变体对主原料6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯的催化活性和反应方法类似，故在此不进行重复叙述。
(2)双羰基还原酶突变体I94V+F231W+I236L+Q251H在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯制备中的应用
向100ml反应瓶中加入1g主原料6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯：4ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入30ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.03g NAD+，0.42g甲酸铵，0.1g辅酶甲酸脱氢酶和2wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W+I236L+Q251H粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用40ml乙酸乙 酯停止反应，用20g硅藻土过滤，40ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯：体系中(3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯)的比例为80～82％，收率81～83％，ee值大于99.5％，de值98.9～99.2％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.26～7.35ppm(m，5H)，4.58ppm(s，2H)，4.26ppm(m，1H)，4.09ppm(m，1H)，3.80ppm(s，1H)，3.47ppm(d，2H)，3.33ppm(d，1H)，2.46ppm(d，2H)，1.81ppm(q，2H)，1.62～1.67ppm(dd，2H)，1.45ppm(s，6H)，0.90ppm(t，3H)。
鉴于其他4个双羰基还原酶突变体对主原料6-苄氧基-3，5-二氧代-己酸新戊酯的催化活性和反应方法类似，故在此不进行重复叙述。
实施例6：双羰基还原酶母本(I94V+F231W)在3R，5S-双羟基化合物制备中的应用
(1)双羰基还原酶母本(I94V+F231W)在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯制备中的应用
向250ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯：20ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和2wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W的粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，产品3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯：体系中(6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯)的比例为86～91％，收率80～86％，ee值大于99.5％，de值88～95％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：δ7.29(m，5H)，4.54(s，2H)，4.22(m，1H)，4.07(m，1H)，3.45～3.40(m，4H)，2.41(d，2H)，1.65(t，2H)，1.43(S，9H)。
(2)双羰基还原酶突变体I94V+F231W在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯制备中的应用
向500ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯：10ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和9wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯：体系(3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯)的比例为80～90％，收率75～85％，ee值大于99.3％，de值90～96％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.26～7.35ppm(m，5H)，4.56ppm(s，2H)，4.24ppm(m，1H)，4.08ppm(m，1H)，3.79ppm(s，1H)，3.45ppm(d，2H),3.30ppm(d，1H)，2.44ppm(d，2H),1.79ppm(q，2H)，1.60～1.65ppm(dd，2H)，1.43ppm(s，6H)，0.88ppm(t，3H)。
实施例7：SEQ ID NO：7所示的双羰基还原酶突变体I94A+F231W+I236V在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯制备中的应用
向500ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯：10ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和4wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯：体系中(3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯)的比例为75～85％，收率70～80％，ee值大于99.5％，de值90～96％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.26～7.35ppm(m，5H)，4.56ppm(s，2H)，4.24ppm(m，1H)，4.08ppm(m，1H)，3.79ppm(s，1H)，3.45ppm(d，2H),3.30ppm(d，1H)，2.44ppm(d，2H),1.79ppm(q，2H)，1.60～1.65ppm(dd，2H)，1.43ppm(s，6H)，0.88ppm(t，3H)。
实施例8：SEQ ID NO：8所示的与实施例5中序列同源性为93.71％的双羰基还原酶在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯制备中的应用
向500ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯：10ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和5wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯：体系中(3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯)的比例为70～85％，收率75～80％，ee值大于99.5％，de值88～95％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.26～7.35ppm(m，5H)，4.56ppm(s，2H)，4.24ppm(m，1H)，4.08ppm(m，1H)，3.79ppm(s，1H)，3.45ppm(d，2H),3.30ppm(d，1H)，2.44ppm(d，2H)，1.79ppm(q，2H)，1.60～1.65ppm(dd，2H)，1.43ppm(s，6H)，0.88ppm(t，3H)。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过对现有的双羰基还原酶突变体母本(I94V+F231W)进行定点饱和突变，再通过定向筛选的方法，得到本发明的上述酶活性大幅度提高的双羰基还原酶突变体，其酶活相对于本发明所用的双羰基还原酶母本提高了2倍，甚至是3倍，并且酶特异性也有相应提高，从而大幅度降低了3R，5S-二羟基化合物工业生产中的成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。





















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