榄香烯脂肪乳注射液及制备方法 技术领域：
本发明属药物制剂技术领域。具体涉及一种榄香烯脂肪乳注射液及制备方法。
背景技术：
榄香烯是从姜科植物郁金(莪术)中提取的抗癌有效成份，以β-榄香烯为主要成份，同时含有少量δ、γ-榄香烯及其萜类化合物。
祖国医药认为莪术性温、味苦辛，有行气破血、消积止痛、抗肿瘤功效。六十年代末，进行抗癌试验亦见于报导。七十年代初，有人将莪术挥发油局部应用治疗宫颈癌有一定疗效。大连医科所在七十年代初用温州产莪术进行抗癌实验研究，发现其挥发油对各种小鼠体内肿瘤有明显治疗效果，已将榄香烯制成注射液及口服液。但该注射液系用吐温-80为增溶剂，含量高达10％，不符合国家有关吐温-80用量规定。于是大连医科所又进行剂型改进，以磷脂为乳化剂制成榄香烯乳注射液(20ml∶100mg)，可用于胸腔及静脉给药。
1996年，榄香烯乳注射液获得国家西药二类新药证书，其批准文号为(ws-049(x-041)-96-(2))。经上万例的临床应用，证实本品具有抗肿瘤效果，对治疗癌性胸腹水，颅内肿瘤、肝癌具有良好效果，并能缓解癌性疼痛和提高机体免疫力作用，为一种非细胞毒广谱抗肿瘤新药。但在静脉给药时，存在严重的静脉刺激和疼痛，静脉炎发生率高达30％左右，使患者无法忍受。借鉴国外对静脉刺激性大的药物如麻醉药丙泊酚、依托米酯等溶解于油相中制成水包油乳剂以降低静脉炎的发生率和减轻疼痛程度。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计榄香烯的新制剂，提高药效，降低副作用。
本发明提供了一种榄香烯脂肪乳注射液，该注射液的重量％组成包括榄香烯0.05～0.25％、注射用大豆油10～30％、注射用蛋黄卵磷脂1.0～1.5或注射用大豆磷脂0.8～1.5％、注射用甘油2.0～2.5％、注射用水加至100ml。
本发明的注射液为水包油乳剂，250ml∶250mg，其用量每次为榄香烯250～750mg。经药理试验证实其静脉刺激性和疼痛程度比现有制剂减轻。并且因本制剂采用大豆油作溶媒、卵磷脂作乳化剂，使其在临床治疗时还能提供人体热能和必需脂肪酸等营养成份，尚具有临床营养支持功效。
本发明的榄香烯注射液对动物疼痛及血管刺激试验结果如下：
1、受试物：
配制方法：10％脂肪乳注射液含0.1％榄香烯(I号)、20％脂肪乳注射液含0.1％榄香烯(II号)及20％脂肪乳注射液含6％右旋醣酐及0.1％榄香烯(III号)三个样品均采用原液。参照品原榄香烯乳注射液以生理盐水稀释，榄香烯浓度从0.5％稀释至0.1％(IV)。
2、试验内容：
(1)小鼠扭体试验：
实验动物：昆明小鼠，每组实验10～20只，雌雄各半。
剂量及给药途径：I、II及III号三个榄香烯脂肪乳注射液样品均采用原液1ml/只小鼠，即1mg/只小鼠。参照品原榄香烯乳注射液(现已改名为榄香烯注射液)采用生理盐水稀释后榄香烯浓度1mg/1m IV号样品，给药浓度也为1ml/只小鼠，即1mg/只小鼠。各样品试液均采用腹腔途径给药。(备注：按常规腹腔途径给药的体积为0.5ml/只小鼠，本次实验的预试验发现受试物若给0.5ml/0.5mg/只小鼠未出现“扭体”反应。为强化受试物的应激条件，将其给药的体积增至1ml/只小鼠)。
小鼠扭体试验方法：在室温20℃±2℃条件下，将受试液注入小鼠腹腔内，使小鼠因刺激而引起腹部深部的、大面积而持久的疼痛反应。统计观察各组小鼠0～15分钟及15～30分钟内产生“扭体”(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)的次数，以各组小鼠引起“扭体”的次数，进行统计。
小鼠扭体试验结果：三个被筛选I、II、III号三个榄香烯脂肪乳注射液样品对小鼠扭体刺激基本不出现反应，它们对小鼠扭体刺激十分明显低于原榄香烯乳注射液IV。详见表1。
表1 小鼠扭体试验 (1)n＝5；(2)n＝10 样品 雌鼠扭体数X±SD 雄鼠扭体数X±SD 0～15分钟15～30分钟 0～15分钟15～30分钟原榄香烯乳IV号(1)13.6±11.1(2)12.4±7.5(1)0.4±0.8(2)0.2±0.4(1)3.2±6.4(2)5.3±5.2(1)1.4±0.9(2)0.8±1.010％榄香烯乳I号(1)2.2±4.9(2)0.6±1.2(1)0(2)0(1)0(2)0(1)0(2)020％榄香烯乳II号(1)0(2)0(1)0(2)0(1)0(2)0(3)0(4)020％乳+低右III号(1)0(2)0(1)0(2)0(1)0(2)0(1)0(2)0
注：1、括弧内1及2分别表示两次实验结果
2、第1次实验每组小鼠10只，第2次每组20只，均雌雄各半。
(2)小鼠热板致疼痛试验：
实验动物：昆明小鼠，体重20±2克，每组实验10～20只，雌雄各半。
剂量及给药途径：I、II及III号三个榄香烯脂肪乳注射液样品均采用原液0.3ml/只小鼠，即0.3mg/只小鼠。对照品IV号给药浓度也为0.3ml/只小鼠，即0.3mg/只小鼠。各样品试验均采用右后足趾皮下给药。
小鼠热板致疼痛试验方法：小鼠后足趾皮下注射0.03ml试液后，置于20℃±1℃的热板上，观察小鼠出现疼痛反应的时间以及给药后5分钟内出现疼痛的次数，所得结果与原榄香烯乳注射液比较按下式进行计算。
拟定的标准：舔足1次计2分
提足1次计1分
上述动作连续超过5分钟累加1次
出现刺激时间：即开始出现舔足或提足时间(秒)
抑制刺激的百分率＝
[(阳性组刺激计分-试验组刺激计分)/阳性组刺激计]分×100％出现刺激时间的延长率＝
[(试验组出现刺激时间-阳性组出现刺激时间)/阳性组出现刺激时间]×100％
小鼠热板法致疼痛试验结果：I、II、III号三个被筛选的榄香烯注射液样品对小鼠热板致疼痛反应无论初次出现刺激的时间或疼痛都明显低于原榄香烯乳注射液对照品IV号，结果详见表2、3、4。小鼠热板试验：
表2： n＝10(雌雄各半) 样品 出现刺激时间(秒) 刺激积分 雌性 雄性 总平均分 雌性 雄性 总分 原榄香烯乳27.2±2.0 34±13.9 30.6 22.9±16.2 14.8±7.1 18.85 10％榄香烯乳71.2±19.5 65.8±22.6 68.5 5.3±4.1 2.4±1.9 3.85 20％榄香烯乳84.6±26.9 83.0±31.2 83.8 4.4±4.2 1.0±1.3 2.70 20％乳+低右96.4±48.0 119.2±1.6 107.8 2.6±3.8 0.2±0.6 1.40
表2： n＝10(雌雄各半) 样品 出现刺激时间(秒) 刺激积分 雌性 雄性总平均分 雌性 雄性 总分 原榄香烯乳39.6±11.2 21.6±2.0 30.6 27.1±12.0 21.9816.6 24.5 10％榄香烯乳58.0±9.5 64.2±35.7 61.1 6.7±2.3 5.1±3.4 5.9 20％榄香烯乳82.4±20.9 83.8±33.7 83.1 2.8±2.8 1.4±2.4 2.1 20％乳+低右 95.2±18.4 104.6±31 99.9 6.0±11.8 0.1±0.3 3.05
表3 样品 出现刺激时间延长率％ 刺激抑制率％ 第1次 第2次 第1次 第2次 10％榄香烯乳 123.8 99.6 79.5 75.9 20％榄香烯乳 173.8 171.5 85.6 91.4 20％乳+低右 252.2 226.4 92.5 87.5
注1：以上数据均与原榄香烯乳注射液比较。
(3)家兔耳缘静脉连续滴注的刺激试验：
实验动物：家兔6号，体重2.5～3.0kg，雄性。
剂量及给药途径：I号样品每天以20～25ml/1h耳缘静脉滴注，每天给药量10mg/kg，连续给药8天，总剂量为80mg/kg。对照品IV号样品，以相同地剂量方案给药。阴性对照组为生理盐水。
家兔耳缘静脉刺激试验结果：
大体观察：给药的前3天未见明显耳缘静脉刺激反应，至第5天各组出现不同程度的刺激。在给药的过程中发现原榄香烯乳组的耳缘出现强直刺激状。改进的制剂所出现的程度很轻。
病理观察：各组耳缘均分6段观察。榄香烯脂肪乳注射液(静脉用)虽与原榄香烯乳注射液具有相似的血管刺激症状，但刺激程度较轻，而且未见血栓形成；且刺激发生的范围也较原榄香烯乳注射液为小。注：本实验是在以上两种实验的基础上进行的，因此仅选用了一个10％榄香烯脂肪乳注射液(静脉用)做比较。
药理刺激试验结论：三个处方榄香烯脂肪乳注射液(静脉用)对所选用的3种动物致疼痛及致刺激模型进行的试验，均能反映出新设计的榄香烯脂肪乳输液较原榄香烯乳注射液均能明显地减轻疼痛及血管刺激。
本发明的榄香烯脂肪乳注射液抗肿瘤药效学试验结果如下：抗肿瘤药效学：
1、体外细胞毒试验：榄香烯脂肪乳注射液体外对人体肝癌细胞株QGY、肺癌细胞株LAX、乳腺癌细胞株Bre-04、肠癌细胞株Col-06及白血病等肿瘤细胞株的增殖抑制作用，其IC50值介于60-120ug/ml之间。
2、体内抗肿瘤试验：榄香烯脂肪乳注射液体内以80mg/kg、40mg/kg及20 mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd的治疗方案对人体肝癌QGY异种移植于裸小鼠皮下接种模型的抑瘤率分别为：44.90％、35.71％及31.12％；对人体胃癌MKN-45异种移植于裸小鼠皮下接种模型的抑瘤率分别为：41.70％、32.26％及26.42％；对小鼠黑色素瘤K111静脉接种的人为肺转移模型的抑瘤率分别为：56.28％、48.38％及42.91％；对小鼠脑胶质瘤G-422颅内接种模型的延长生命率分别为：68.23％、55.29％及49.41％以及对小鼠脑胶质瘤G422皮下接种模型的抑瘤率分别为：35.16％、30.59％及23.29％。
3、榄香烯脂肪乳注射液体内合并不同化疗药对各种小鼠肿瘤模型的抗肿瘤疗效：榄香烯脂肪乳注射液采用80mg/kg、40mg/kg及20mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd单独用药的治疗方案对小鼠肉瘤S180皮下接种模型的抑瘤率分别为：37.14％、33.02％及28.25％，合并CTX 15mg/kg，ip×7qd后的抑瘤率提高为：55.24％、52.06％及49.84％；合并MMC1mg/kg，ip×7qd后的抑瘤率分别从单独用药的38.13％、33.11％、28.09％提高为：55.18％、53.18％及51.51％；对小鼠脑神经胶质瘤G-422颅内接种模型合并VM-26mg/kg，ip×7qd后的生命延长率分别从单独用药的60.60％、41.41％、32.32％提高为：92.93％、83.84％及73.74％；对小鼠Lewis肺癌皮下接种模型合并DDP1mg/kg，ip×7qd后分别从单独用药的32.06％、28.63％、25.19％提高为：54.96％、52.67％及51.15％；对小鼠黑色素瘤K111静脉接种的人为肺转移模型合并DDP1mg/kg，ip×7qd后的肺转移抑制率从单独用药的54.20％、44.14％、38.89％提高为：58.36％、55.56％及53.86％。榄香烯脂肪乳注射液体内合并不同化疗药对各种小鼠肿瘤模型的抗肿瘤疗效均有不同程度的提高，其中以小鼠脑神经胶质瘤G-422颅内接种模型合并VM-26的效果最为明显。
4、榄香烯脂肪乳注射液体内合并放疗对小鼠肝癌模型的抑瘤率：榄香烯脂肪乳注射液采用80mg/kg、40mg/kg及20mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd单独用药的治疗方案对小鼠肝癌H22皮下接种模型的抑瘤率分别为：37.97％、33.62％及26.96％，合并放疗500拉德后的抑瘤率提高为：61.16％、59.71％及60.00％；
5、免疫功能试验：榄香烯脂肪乳注射液体内以80mg/kg、40mg/kg及20mg/kg高、中、低三个剂量iv×10qd给药对荷Lewis肺癌小鼠NK、淋巴细胞增殖活性，以及对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能均有较明显的促进和提高。
6、减毒试验：榄香烯脂肪乳注射液对CTX所致C57BL/6小鼠的白细胞影响与阳性对照云芝糖肽组相似，影响不明显，但也不增加化疗药的骨髓抑制。
小鼠最大耐受量试验：
对昆明小鼠静脉给药的最大耐受量为40mg/Kg，为临床每天用药剂量(400～700mg/50Kg/次)的3～5倍。
静脉局部刺激试验
实验结果表明：榄香烯脂肪乳注射液应用于静脉注射时，对家兔耳缘静脉血管刺激试验，以原液1mg/ml/Kg浓度的剂量，每天一次，连续三天后，实验显示榄香烯乳注射液对家兔耳静脉血管无明显的与药物有关的刺激反应。
过敏试验
实验结果表明：榄香烯乳注射液对豚鼠过敏试验中，未见明显过敏反应。
溶血试验
实验结果表明：榄香烯乳注射液对家兔红血球溶血试验呈阴性反应。
本发明的另一目的是提供了上述榄香烯脂肪乳注射液的制备方法，该方法是在惰性气体保护下，将注射用蛋黄磷脂(或注射用大豆磷脂)以及榄香烯高速搅拌至均匀制成油相。另将注射用甘油加入盛有适量注射用水容器内，混匀后过滤至澄明，加热至40～70℃制成水相，在高速搅拌下将油相与水相混合并用10％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～10.0，加注射用水至全量将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上，再经微孔滤膜过滤灌装于250～500ml玻瓶中，加通氮、胶塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。
本发明的制剂质量如下：
1、性状：本品为白色的乳状液体。
2、鉴别：
取本品3ml，置试管中加乙醇1ml，摇匀后沿管壁缓慢加1％香草醛硫酸液0.5ml，在两液层交界处显紫红色环，摇匀后显紫堇色。
在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。
3、检查项目：PH值、有关物质、游离脂肪酸、乳粒大小、热原、无菌及有关注射剂项下的各项规定。
4、含量测定：榄香烯 采用气相色谱法测定
5、有关物质检查：主要检查游离脂肪酸(采用化学法测定)及有关杂质(采用气相色谱法测定)。
6、稳定性试验：
榄香烯乳注射液经影响因素试验(光照、40℃、60℃、80℃加速10天)；40℃恒温加速三个月后，其含量无明显变化，而游离脂肪酸值及PH随着时间及温度有所变化，即PH稍有降低，游离脂肪酸值有所增加，但均能符合所订质量标准。其它如外观、乳粒大小等均无明显变化，初步证明本品在室温贮放可稳定二年左右。
本发明的制剂产品有如下生物活性
1、抑制肿瘤细胞生长：体内、体外研究表明，本品对多种肿瘤细胞有作用。
2.免疫保护作用：本品能增强T淋巴细胞亚群的功能。
3.升白作用：本品不引起骨髓抑制，用药期间白细胞数无明显下降，对放疗和其他化疗药引起的白细胞减少有一定保护作用。
4.放.化疗协同作用：本品与其他化疗药物联合应用(如顺铂、足叶乙甙、长春新碱、阿霉素等)有一定的协同作用。
5.营养作用：本品为脂类制剂，能为机体提供高能量和必需脂肪酸营养。
6.能通过血脑屏障：血脑屏障的存在是影响颅内肿瘤化疗的一个重要因素，本品的药代动力学实验表明：经3H标记的榄香烯可通过血脑屏障进入脑内，其分布与含量除肺部较高外，脑组织与其他组织相似。实验肿瘤学证明以脑瘤原位接种的小鼠有较高的延长生命率。
作用机理
1.直接抑制肿瘤细胞生长，对正常细胞(如外周血白细胞等)影响较小。
2.通过提高机体免疫功能起到抑制癌肿的作用。
3.作用于细胞周期S期与G2及M期的调控点，阻滞S期细胞进入G2+M期，降低肿瘤，细胞分裂能力，抑制其增殖。
4.通过干扰肿瘤细胞生长代谢，诱发肿瘤细胞快速发生细胞凋亡。毒理作用
急毒和长毒实验证明：本品毒副作用低微。静脉注射的LD50为270.07±18.93mg/kg；对小鼠无致畸突变作用。用狗和大鼠静脉给药连续90天进行长期毒性实验，结果各种动物的血象及肝、肾功能等生化指标均无明显变化。
适应症
主要适用于肺癌、脑癌、肝癌、胃癌等。
用法与用量
静脉注射：每日1次，400-600mg/次，静脉缓慢滴注15天为一疗程。选取较粗静脉血管，两臂交替使用，最好使用套管针。如能采用锁骨下静脉注射最佳。
具体实施方式：
实施例一：
在氮气保护下，称取注射用大豆油120g，加热至70℃，加入注射用蛋黄卵磷脂13g和榄香烯0.8g，高速搅拌至均匀，制成油相。另将注射用甘油23g，加入适量注射用水混匀后加热至60℃过滤后在高速搅拌下与油相混合制成初乳，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值9.5，加注射用水至1000ml将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上)，再经微孔滤膜过滤，灌装于250～500ml玻瓶中，通氮、加塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。
实施例二：
在氮气保护下，称取注射用大豆油200g，加热至60℃，加入榄香烯1.5g，高速搅拌至均匀，制成油相。另将注射用甘油22g，加入适量注射用水混匀后在高速搅拌下再加入注射用大豆磷脂8g混匀后加热至70℃，在高速搅拌下与油相混合制成初乳，并用10％氢氧化钠溶液调节pH值8.5，加注射用水至全量1000ml将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下占97％以上)，再经微孔滤膜过滤灌装于250～500ml玻瓶中，通氮、加塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。
实施例三：
在氮气保护下，称取注射用大豆油150g，加热至80℃，加入注射用蛋黄卵磷脂14g和榄香烯1.2g，高速搅拌至均匀，制成油相。另将注射用甘油24g，加入适量注射用水混匀后加热至50℃过滤后在高速搅拌下与油相混合制成初乳，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值8.5，加注射用水至1000ml将初乳经二步高压匀质机反复乳化至乳粒检查合格(粒子＜1μ以下，再经微孔滤膜过滤灌装于250～500ml玻瓶中，通氮、加塞、轧盖于回转式蒸汽灭菌器中115℃30分灭菌。检查合格后即成榄香烯脂肪乳注射液。